高产MonacolinK紫色红曲菌菌株及其发酵生产功能性红曲的方法与流程

本发明涉及一株高产monacolink紫色红曲菌菌株及其发酵生产功能性红曲的方法，属于微生物菌株发酵技术领域。

背景技术：

红曲是以籼稻、粳稻、糯米等为原料，经红曲霉发酵而成，为我国传统发酵产品，有一千多年的生产和应用历史，一直广泛应用于食品着色、酿酒、腐乳及中医中药中。《本草纲目》中明确记载，红曲具有活血除淤作用。1979年日本学者远藤章从红色红曲菌(m.ruber)发酵产物中分离出一种新的物质，命名为monacolink，能有效抑制胆固醇生物合成中的关键酶3-羟基-甲基-戊二酰基-辅酶a还原酶的活性，阻断胆固醇的合成，调节人体内异常血脂，对产生动脉粥样硬化的血清总胆固醇及低浓度脂蛋白胆固醇的降低有特异作用。

近年来，随着生活水平的提高，由高胆固醇所引起的冠心病、高血脂、脑血栓等威胁着人类健康，降脂类产品需求日益增多，以monacolink(与洛伐他汀是同一种物质)为主要成分的功能性红曲逐渐走进人们的视野。功能性红曲与普通红曲米的主要区别是monacolink含量更高。研究表明，与从其他菌类提取或人工合成的洛伐他汀相比，红曲产品中的monacolink结晶少、溶解度高，因而疗效更显著，毒副作用更小。功能性红曲中还含有γ-氨基丁酸、胆碱、麦角固醇、黄酮、不饱和脂肪酸等多种对人体有益的活性物质，使功能性红曲不仅保留了传统的“健脾消食，活血化瘀”功效，还具有降低血胆固醇、降血脂、降血糖血压、防癌、提高免疫力、抗氧化性等生理活性，具有极高的营养、保健、药用价值，是一种天然、安全、有效的保健食品和药品原料。

莫那可林k(monacolink)是理想的降血脂药物，它有两种结构，即内酯式结构和酸式结构。monacolink的生产菌种有土曲霉和红曲霉。土曲霉发酵来源的monacolink是美国默克公司开发的处方药，是目前市场上降脂药物的主要成分，是内酯式结构，是前体药物，服用后必须经过人体肝脏分泌出的羟基酯酶水解成酸式结构才具有活性，起到抑制hmg-coa还原酶，进而阻断胆固醇合成的作用；但有少数人体内分泌的羟基酯酶量不足或活性低下，导致对内酯式的monacolink水解不完全，产生毒副作用，导致横纹肌溶解而疼痛，同时也增加肝、肾的负担。功能性红曲米中的monacolink以两种形式同时存在，天然发酵得到的功能性红曲米中的monacolink绝大部分是酸式结构，它不需要人体内的羟基酯酶参与水解，不会增加肝、肾负担，直接发挥降脂作用，另一小部分为内酯式结构monacolink，在发酵后期，随着外界水分和温度的变化，酸式会向内酯式转化，若在提纯过程中，遇到高温、脱水等条件，则内酯式monacolink含量会占到主要地位。

土曲霉发酵法生产的monacolink是内酯式结构，产生毒副作用，导致横纹肌溶解而疼痛，同时也增加肝、肾的负担。虽然红曲霉发酵来源的monacolink可以很好的解决此问题，并且还有很多其它保健功能，但是现有技术生产的功能红曲米中monacolink含量比较低，且1995年法国学者blanc在红曲霉的发酵物中检测出橘霉素，其具有肾毒性、致癌性、致突变等作用，严重制约了红曲霉菌发酵产品的应用和发展。所以，获得一株高产酸式monacolink低产橘霉素的紫红曲霉菌是目前这个产业急需解决的一个问题。

功能性红曲在饲料中的应用也已得到相关开发，国外已将洛伐它汀作为鸡、猪饲料添加剂，以减少这些动物的胆固醇合成，使鸡肉、鸡蛋和猪肉中的胆固醇含量降低。养殖业中抗生素滥用问题一直以来都是影响食品安全和公共卫生安全的重要因素。农业农村部明确规定自2020年1月1日起，动物的日常饲料中严禁添加抗生素，自7月1日起，含有抗生素的饲料产品严禁销售，“替抗”产品迎来历史机遇。功能性红曲除含有monacolink外，还含有大量其他多种有益活性物质，具有提高免疫力及高抗氧化活性价值。因此功能性红曲有望作为一种新型饲料添加剂，在“减抗/替抗”相关产品上具有广泛应用空间。

我国轻工行业标准对功能性红曲米的要求是monacolink含量≥0.4％。普通红曲米中monacolink含量极低，需浓缩数倍后才可测出，其固态发酵工艺成熟且粗犷，技术含量低，由于为半开放式发酵，易污染杂菌，产生毒素类物质，其中橘霉素为主要毒素，它有强烈的肾毒性，且损害肝的代谢，体内试验可与血清蛋白结合，有致癌性可诱发突变。欧美国家对食品及饲料中的橘霉素含量的要求是采用高效液相色谱法不得检出。我国功能性红曲产品橘霉素含量不得高于0.05μg/g。

目前困扰功能性红曲产品的问题主要有两方面，一为规模化发酵技术不成熟，产品生产成本过高；二为发酵过程中monacolink产量偏低且产生毒性物质橘霉素。据文献报道，目前功能性红曲monacolink实验室发酵水平在2-10mg/g之间，也有少数报道称可达到15-20mg/g，但因功能性红曲固体发酵为严格纯种，其发酵规模的放大是困扰该产业的技术瓶颈。现阶段国内功能性红曲工厂大多采用塑料瓶发酵生产工艺，发酵周期长、产量低、人工成本高，许多实验室研究成果虽然看起来较先进，但由于生产技术瓶颈，难以实现产业化。发酵过程中橘霉素的产生是困扰众多研发者及生产企业的另一大问题。

申请号201710774819.7的中国专利公开了一种高产酸式莫那可林k低产橘霉素的紫红曲霉菌及应用，提供了使用该紫红霉菌发酵生产功能性红曲米的方法以及得到的功能性红曲米，主要内容包括菌株培养方式及发酵方法，其主要亮点是其提供的菌株可以提高红曲霉菌发酵产品功能性红曲米中酸式monacolink的含量，同时降低橘霉素的含量，橘霉素低于15μg/kg，monacolink含量至少为5‰，在monacolink中酸式monacolink的占比至少为40％。虽然该发明提供的菌株其monacolink产量相对较高，且酸式monacolink含量高于40％，但发酵过程中仍有橘霉素产生，且制备工艺较繁琐，籼稻大米需要提前浸泡4-10h，然后用蒸汽蒸熟，大约蒸15-30min，以大米无白心为准，而后再进行121℃灭菌操作，且接种量较大，达到10％-20％。在固体培养过程中，需要每天摇动培养基翻料一次，且培养所用容器为1000ml玻璃摇瓶，这种操作不仅导致劳动强度大，而且使得在培养过程中水分流失快，根据实际操作经验，8-10天后则需开始补充水分，进一步加大劳动强度。其他相似专利，例如申请号201810040975.5的中国专利公开的一种谷物发酵功能性红曲粉的生产工艺，其恒温培养期间需要补水并间断摇瓶，每9小时-15小时则需要摇瓶一次，劳动强度极大。

技术实现要素：

目前功能性红曲的固体发酵培养，功能性物质monacolink的产量皆偏低且开环式monacolink(酸式monacolink)含量基本都在50％以下，且有毒性物质橘霉素产生，而且在固体发酵过程中，基本都需要每天摇动培养基翻料，这种操作不仅导致劳动强度大，而且使得在培养过程中水分流失快，根据实际操作经验，8-10天后则需开始补充水分，进一步加大劳动强度，且培养所用容器皆为玻璃或塑料摇瓶，培养过程浪费空间且物料容易堆积结块，水分挥发较快。

针对上述问题，本发明提供了一株monacolink的产量较高且发酵过程无橘霉素产生的紫色红曲菌菌株，该菌株性能稳定，生长速度快且发酵能力强。在优良菌株基础上，采用聚丙乙烯耐高温培养袋发酵，制备功能性红曲，发酵过程中无需补充水分，且在培养过程中无需频繁翻动物料，仅在培养第三天翻动一次物料即可。经此工艺制备的功能性红曲，发酵时间15-30天，产品中monacolink含量达到0.8％-1.7％，开环式monacolink含量达到80％以上，无橘霉素产生。

本实验室从自然发酵的红曲中经筛选、系列条件优化后获得一株monacolink的产量较高且发酵过程无橘霉素产生的紫色红曲菌(monascuspurpureus)ncps2019010，该菌株已于2019年9月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为cctccno:m2019736。

采用上述紫色红曲菌ncps2019010菌株发酵生产功能性红曲的方法，其特征是，包括以下步骤：

1)斜面培养

将紫色红曲菌ncps2019010菌株进行斜面培养，培养温度为28-32℃，培养时间为5-8天；

2)种子液培养

斜面挖取菌苔加入装有种子液培养基的摇瓶中，将菌苔打散后摇床振荡培养，28-30℃培养90-100hr，得种子液；

3)发酵培养

将发酵固体培养基装入聚丙乙烯耐高温培养袋，物料厚度4-5cm，灭菌后趁热将物料打散，冷却至常温，按照每100克干物质接种5-10ml种子液的比例接种；

将接种后的培养袋先置于27-30℃恒温培养室内培养，无需控制湿度，培养3-4天后充分混匀，继续培养至5-6天红曲菌已经长满培养基且物料已呈现明显红色，将培养物移至22-25℃条件下培养15-25天，培养结束后，灭菌、烘干、粉碎得到功能性红曲。

所述斜面培养基：pda加麦芽汁固体培养基(麦芽汁加量为最终糖度为4°)。

种子液培养基(除甘油外都是质量比)：大米粉1.5-2.5％，玉米浆粉0.1-0.15％，黄豆粉1.5-2.5％，蛋白胨0.8-1.2％，甘油4-6％(v/v)，葡萄糖1.5-2.5％，kh2po40.2-0.3％，nano30.3-0.8％，ph自然。

发酵固体培养基为：包括干物质、无机盐营养液和乳酸；无机盐营养液加量为干物质的60-70％(v/w)，乳酸加量为干物质的0.5-1.5％(v/w)；

所述干物质的组分及重量份为：粳米或籼米100，大豆分离蛋白60-85，玉米粉10-20，麸皮10-20，小米8-12；

所述无机盐营养液的组分及重量比含量为：mgso40.08-0.12％，znso40.03-0.08％，柠檬酸三钠0.8-1.2％，nano30.3-0.8％。

本发明的有益效果是：

1)产品质量好

使用本工艺制备的发酵型功能性红曲，产品中monacolink含量达到0.8％-1.7％，开环式monacolink含量达到80％以上，且无橘霉素产生，这一产品质量大大高于市场上现有产品。

2)工艺简便

传统使用的普通培养瓶，瓶太高，浪费空间，因为是好氧固体发酵，本发明采用聚丙乙烯耐高温培养袋，其接触面积大，培养基摊的薄(不高于5cm)，并且接种后混合均匀度好，在培养过程中无需频繁翻动物料，只需要在培养第三天翻动一次物料即可，大大降低劳动量。由于减少了翻动物料，发酵过程中无需补充水分，且大大降低染杂菌风险。

附图说明

图1为菌株ncps2019010的pda平板培养10天后的菌落图片；

图2为菌株ncps2019010的pda平板培养14天后的菌落图片(正面)；

图3为菌株ncps2019010的pda平板培养14天后的菌落图片(反面)；

图4为菌株ncps2019010的100倍染色后菌丝体及分生孢子图片；

图5为菌株ncps2019010的40倍下子囊孢子图片；

图6为菌株ncps2019010的pcr琼脂糖凝胶电泳图片；其中，2：ncps2019010，m:marker(dl2000：2000、1000、750、500、250、100bp)，y：阴性对照；

图7为发酵生产的功能性红曲的图片；

图8为产品的开环式monacolink的hplc检测结果。

具体实施方式

以下结合试验例来说明本发明的效果。

实施例1：菌株的分离与鉴定

1、红曲菌的筛选、优化

活化平板：pda加适量麦芽汁(最终糖度4^°)；

液体培养基配方：大米粉2％，玉米粉2％，黄豆粉4％，甘油7％(质量体积分数)，葡萄糖2％，kh2po40.25％，nano30.5％；

固体培养基配方：米粉15g，黄豆粉10g，麸皮2.5g，玉米粉2g，搅拌，121℃灭菌20min。灭菌后趁热打散，加10ml营养液(0.1％mgso4，0.05％znso4，1％柠檬酸三钠，5％甘油，3％蛋白胨，0.5％nano3)+0.3ml乳酸。

取购买的多种红曲米入无菌水中，摇床震荡2小时左右，系列稀释，取稀释度为10²、10³、10⁴的悬液涂布pda加适量麦芽汁的固体平板(含有0.01％氯霉素)，平板28-30℃培养4-5天，根据菌落外观，挑取长势较好的单菌落至斜面培养基，培养6-7天后，再次进行系列稀释分纯工作，挑取后的单菌落斜面培养待用。

检测单菌落生长活性：液体培养基培养液分装于500ml三角瓶中，每瓶装100ml，121℃灭菌待用。斜面挖块接入上述液体培养基，28℃，180rpm，摇床震荡培养96小时，培养过程观察长势，选取长势旺盛、颜色较深的液体按10％的接种量接种固体发酵培养基，培养结束后60℃条件下烘干2小时，测定mk含量，选取mk量最高的10株菌进行连续三次固体发酵，测定mk含量和橘霉素含量，结果如下。

表1红曲菌株筛选结果

其中菌株010号菌株发酵产mk含量最高且未有毒素类物质橘霉素检出，连续三次固体发酵性质稳定，后经过多次重复性实验表明，该菌株稳定性非常好，因此选取010号菌株作为最终菌株进行菌种鉴定，命名为ncps2019010。

2、菌株的特征及鉴定

1)菌落形态观察：红曲霉的形态学鉴定将筛选出的010号菌株点植于pda平板上，于30℃培养10-14天，观察并记录菌株生长的颜色、形态、大小及质地的变化。采用载片培养法观察其菌丝、分生孢子链、闭囊壳、子囊孢子等形态，显微镜观察并拍照。

菌落形态特征：将经斜面活化的菌株点植于pda平板上，32℃恒温培养箱中培养10天后观察，菌落圆形，边缘整齐，有较长绒毛菌丝，绒毛呈白色(图1)；培养14天后观察，菌落圆形，边缘整齐，绒毛变短，为橙红色，边缘一圈呈淡黄色，反面橙红色(图2-图3)。

2)显微观察：个体形态特征

菌丝直径2～7μm，有横隔和不规则分支(图4)；分生孢子是单细胞结构，无色透亮，单生或成链，呈倒梨形或球形，着生在菌丝及其分枝的顶端(图4)。闭囊壳呈椭圆形，直径30～50μm，有柄，里面充满密集排列的孢子，子囊孢子卵形或者球形(图5)；

通过对菌落形态特征和菌丝、孢子等显微结构特征观察，根据《真菌鉴定手册》、《中国真菌志》可初步鉴定ncps2019010菌为红曲霉属真菌，但仅由形态特征难以鉴定到种，需结合分子生物学手段作进一步鉴定。

3)红曲霉的分子生物学鉴定

利用its鉴定引物(its1/its4)和18s鉴定引物(ns1/ns8)进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，产物大小分别300～700bp和1800bp左右(如图6所示)，并进行dna测序，与genbank中的已知序列进行同源性比对后，判定真菌种类，将真菌划分到属或种。测定ncps2019010的its序列结果所示(seq-1)：

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通过分子生物学鉴定，鉴定菌株ncps2019010为紫色红曲菌(monascuspurpureus)，该菌株已于2019年9月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为cctccno:m2019736。

实施例2：无菌纯种发酵

斜面培养基：pda加麦芽汁固体培养基(麦芽汁加量为最终糖度为4°)。

种子液培养基：大米粉2％，玉米浆粉0.12％，黄豆粉2％，蛋白胨1.0％，甘油5％(v/v)，葡萄糖2％，kh2po40.25％，nano30.5％，ph自然。

发酵固体培养基：粳米或籼米100g，大豆分离蛋白60-85g，玉米粉10-20g，麸皮10-20g，小米8-12g，无机盐营养液(0.1％mgso4，0.05％znso4，1％柠檬酸三钠，0.5％nano3)加量为干物质的66％(v/w)，乳酸加量为干物质1％(v/w)。

具体方法：

1)斜面培养

将紫色红曲菌ncps2019010菌株进行斜面培养，培养温度为28-32℃，培养时间为5-8天，待斜面长满菌丝体且培养基变红则可以放入4℃冰箱保存使用；

2)种子液培养

将种子液培养基分装于500ml三角瓶中，每瓶装100ml，121℃灭菌30min，冷却后取出备用；

接种方法：无菌操作，斜面挖取2-3块黄豆粒大小的菌苔加入摇瓶中，尽量将菌苔打散后摇床振荡培养，28-30℃，180rpm，培养90-100hr，得种子液；

3)发酵培养

将发酵固体培养基装入聚丙乙烯耐高温培养袋，物料厚度4-5cm，121℃90分钟灭菌后趁热将物料打散，冷却至常温，按照每100克干物料接种5-10ml种子液的比例接种；

将接种后的培养袋先置于27-30℃恒温培养室内培养，无需控制湿度，培养3-4天后充分混匀，继续培养至5-6天红曲菌已经长满培养基且物料已呈现明显红色，将培养物移至22-25℃条件下培养，时间为15-25天(本实施例为20天)，最终培养得到的功能性红曲莫纳克林k(monacolink)含量可达到0.8％以上(本实施例在1.0-1.5％)，且开环式成分含量高于80％，培养结束后，121℃高温湿热杀菌15分钟后60℃烘干水份至8-12％，制备的红曲的图片如图7所示，也可以根据需要进一步粉碎。

monacolink的hplc检测分析

色谱仪：agilent1260；

色谱柱：zorbaxxdb-c184.6*250mm，5μm；

流动相：乙腈:0.2％磷酸水溶液＝60:40；

检测波长：237nm；

柱温：30℃；

试验处理按qb/t2847-2007处理，检测结果如图8所示(开环式monacolink的rt为10.785，内酯式结构monacolink的rt为18.507)，从图中可以看出：开环式monacolink的含量占总的monacolink总含量的95％以上。

sequencelisting

<110>山东省农业科学院农产品研究所

<120>高产monacolink紫色红曲菌菌株及其发酵生产功能性红曲的方法

<130>0

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<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>紫色红曲菌（monascuspurpureus）ncps2019010的its序列

<400>1

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