1.一种利尿活性药物细胞筛选模型的建立方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:1)mdck细胞的培养;2)药物的配制;3)nacl转运浓度的筛选;4)分组、给药与nacl转运实验;5)统计学分析。
2.根据权利要求1所述的建立方法,其特征在于,mdck细胞的培养具体为:购买mdck细胞株,用含5~15%胎牛血清、0.5~1.5%青霉素-链霉素溶液、85~95%的dmem高糖培养基,37℃、co2培养箱mdck细胞培养至对数生长期。
3.根据权利要求2所述的建立方法,其特征在于,mdck细胞的培养具体为:购买mdck细胞株,用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液、89%的dmem高糖培养基,37℃、co2培养箱mdck细胞培养至对数生长期。
4.根据权利要求1所述的建立方法,其特征在于,药物的配制具体为:取nacl,dmem高糖培养基分别成0.012、0.015、0.018、0.021、0.024、0.027、0.030、0.033、0.036g·ml-1nacl备用,里白烯、22-羟基何伯烷、β-谷甾醇、cycloeucalenone、泽屋萜、dryocrassol、hopan-28,22-olide、齐墩果酸、22,28-epoxyhopane、cyclohopenol、cycloeucalenol、木栓酮、(23e)-cycloart-23-ene-3β,25-diol、(23e)-cycloart-23,25-ene-3β-ol、cyclolaudenol、11-羰基-β-乙酰乳香酸、2',3'-dihydroxypropylpentadecanoate、β-胡萝卜苷和氢氯噻嗪用dmso助溶后,dmem高糖培养基分别稀释至100umol·l-1备用。
5.根据权利要求1所述的建立方法,其特征在于,nacl转运浓度的筛选具体为:
取对数生长期mdck细胞体外培养,分为生理盐水组0.009g·ml-1和nacl不同浓度梯度组:分别为0.012、0.015、0.018、0.021、0.024、0.027、0.030、0.033、0.036g·ml-1共9个浓度梯度,取相应浓度nacl药液孵育mdck细胞3~10小时,mtt法检测细胞存活率,确定研究nacl转运的最佳nacl孵育浓度。
6.根据权利要求5所述的建立方法,其特征在于,nacl转运浓度的筛选具体为:取对数生长期mdck细胞体外培养,分为生理盐水组0.009g·ml-1和nacl不同浓度梯度组:分别为0.012、0.015、0.018、0.021、0.024、0.027、0.030、0.033、0.036g·ml-1共9个浓度梯度,取相应浓度nacl药液孵育mdck细胞8小时,mtt法检测细胞存活率,确定研究nacl转运的最佳nacl孵育浓度。
7.根据权利要求1所述的建立方法,其特征在于,分组、给药与nacl转运实验具体为:取transwell板,规格:0.4um孔径,24孔,12小室,在小室内每孔接种200ul·孔-1密度为4×105个·ml-1的mdck细胞,小室外每孔给予完全培养基1ml以适应细胞正常生长,细胞贴壁后,测定每孔电阻值,于37℃测得跨膜电阻值≥300ω·cm2,即可用于下一步实验;取符合实验要求的mdck细胞,随机分为模型组,给予dmem培养基、各石韦提取单体组100umol·l-1、氢氯噻嗪组100umol·l-1,每组3个复孔,37℃二氧化碳培养箱培养20~28h,20~28h后吸弃小室内液体,于transwell板小室内给予含nacl0.015g·ml-1或含尿素15mmol·l-1的dmem继续培养,分别于30min、1h、2h、4h分别取小室外液体50ul,酶标仪检测氯离子、尿素吸光度。
8.根据权利要求7所述的建立方法,其特征在于,分组、给药与nacl转运实验具体为:取transwell板,规格:0.4um孔径,24孔,12小室,在小室内每孔接种200ul·孔-1密度为4×105个·ml-1的mdck细胞,小室外每孔给予完全培养基1ml以适应细胞正常生长,细胞贴壁后,测定每孔电阻值,于37℃测得跨膜电阻值≥300ω·cm2,即可用于下一步实验;取符合实验要求的mdck细胞,随机分为模型组,给予dmem培养基、各石韦提取单体组100umol·l-1、氢氯噻嗪组100umol·l-1,每组3个复孔,37℃二氧化碳培养箱培养24h,24h后吸弃小室内液体,于transwell板小室内给予含nacl0.015g·ml-1或含尿素15mmol·l-1的dmem继续培养,分别于30min、1h、2h、4h分别取小室外液体50ul,酶标仪检测氯离子、尿素吸光度。
9.如权利要求1所述建立方法所得的模型,其特征在于,所述模型具体为:
1)mdck细胞的培养
购买madin-dabycaninekidneycells(mdck)细胞株,用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液、89%的dmem高糖培养基,37℃、co2培养箱mdck细胞培养至对数生长期;
2)药物的配制
取nacl,dmem高糖培养基分别成0.012、0.015、0.018、0.021、0.024、0.027、0.030、0.033、0.036g·ml-1nacl备用;里白烯、22-羟基何伯烷、β-谷甾醇、cycloeucalenone、泽屋萜、dryocrassol、hopan-28,22-olide、齐墩果酸、22,28-epoxyhopane、cyclohopenol、cycloeucalenol、木栓酮、(23e)-cycloart-23-ene-3β,25-diol、(23e)-cycloart-23,25-ene-3β-ol、cyclolaudenol、11-羰基-β-乙酰乳香酸、2',3'-dihydroxypropylpentadecanoate、β-胡萝卜苷和氢氯噻嗪用dmso助溶后,dmem高糖培养基分别稀释至100umol·l-1备用;
3)nacl转运浓度
取对数生长期mdck细胞体外培养,分为生理盐水组0.015g·ml-1浓度的nacl药液孵育mdck细胞8小时,mtt法检测细胞存活率;
4)分组、给药与nacl转运
取transwell板,0.4um孔径,24孔,12小室,在小室内每孔接种200ul·孔-1密度为4×105个·ml-1的mdck细胞,小室外每孔给予完全培养基1ml以适应细胞正常生长,细胞贴壁后,测定每孔电阻值,于37℃测得跨膜电阻值≥300ω·cm2;
取符合实验要求的mdck细胞,随机分为模型组(给予dmem培养基)、各石韦提取单体组(100umol·l-1)、氢氯噻嗪组(100umol·l-1),每组3个复孔,37℃二氧化碳培养箱培养24h,24h后吸弃小室内液体,于transwell板小室内给予含nacl0.015g·ml-1或含尿素15mmol·l-1的dmem继续培养,于4h之内取小室外液体50ul,酶标仪检测氯离子、尿素吸光度;
5)统计学分析
实验结果均服从正态分布,数据以
10.根据权利要求1~9所述的任一项建立方法获得的模型在利尿活性药物中的应用。