一种主链型大分子季铵盐及其制备方法与应用

1.本发明涉及高分子化合物的合成以及功能高分子的植物保护应用技术领域，特别涉及一种主链型大分子季铵盐及其制备方法与应用。


背景技术：

2.香蕉枯萎病是一种由尖孢镰刀菌所引起的植物病害，由于其防止较难，所以被称之为“香蕉癌症”。香蕉枯萎病作为一种土传性的病害，尖孢镰刀菌一旦进入香蕉园，就会产生孢子在土中侵入香蕉的根部维管束，并在其中繁殖使得土壤带有大量真菌孢子，从而循环侵染，严重时放弃种植香蕉便是唯一选择。
3.目前对于香萎病产生拮抗作用的菌类在实际的土壤中会随环境的改变而容易发生改变，具有不稳定性，而且成本较高。而当前化学防治中所使用的药物均为小分子，在这些化学防治的过程中容易出现流失的现象，难以在土壤中长存达到灭杀香蕉枯萎病菌的效果，并且大量的使用会造成周围环境生物造成毒害，破坏环境生态。以上这些问题都制约着当前对于香蕉枯萎病防治问题的解决。


技术实现要素：

4.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种主链型大分子季铵盐。
5.本发明的另一目的在于提供上述主链型大分子季铵盐的制备方法。
6.本发明的再一目的在于提供上述主链型大分子季铵盐的应用。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.一种主链型大分子季铵盐，其结构式如式(i)所示：
[0009][0010]
n为8～40；更优选为9～35。
[0011]
r为正丁基苄基或ch
3-。
[0012]
所述的主链型大分子季铵盐中的数均分子量在1500～15000之间；更优选为2400～7400。
[0013]
所述的主链型大分子季铵盐的制备方法，包括如下步骤：
[0014]
(1)小分子单体的制备
[0015]
将n-甲基二烯丙基胺与溴代物溶解于有机溶剂中，在密封条件下于0～5℃冰浴后
抽真空冲氮气，于35～45℃反应至出现分层；终止反应后除去未反应的原料，得到的产物用水溶解或稀释后，再用萃取溶剂萃取，取下层，浓缩，得到纯化后的小分子单体；
[0016]
(2)主链型大分子季铵盐的制备
[0017]
①
用水将纯化后的小分子单体溶解后，加入引发剂，在密封条件下于0～5℃冰浴后抽真空冲氮气，于50～60℃反应；停止反应后，进行第一次浓缩，在浓缩产物中加入丙酮析出沉淀，收集沉淀，用水溶解沉淀后通过透析纯化；
[0018]
②
将得到的纯化产物进行第二次浓缩，在浓缩产物中加入丙酮析出沉淀，得到主链型大分子季铵盐。
[0019]
步骤(1)中所述的溴代物优选为溴代正丁烷、溴化苄或溴甲烷。
[0020]
步骤(1)中所述的溴代物的用量相对于所述的n-甲基二烯丙基胺过量；优选为按n-甲基二烯丙基胺与溴代物＝摩尔比1：1.01～1.5配比计算；更优选为按n-甲基二烯丙基胺与溴代物＝摩尔比1：1.05～1.5配比计算。
[0021]
步骤(1)中所述的有机溶剂优选为丙酮或是正己烷。
[0022]
步骤(1)所述的有机溶剂作为反应介质使用，不参与反应；其用量优选按有机溶剂相当于n-甲基二烯丙基胺和溴代物总质量的0.80～1.2计算。
[0023]
步骤(1)中所述的冰浴的时间优选为30s。
[0024]
步骤(1)中所述的抽真空冲氮气的次数优选为3次。
[0025]
步骤(1)中所述的抽真空冲氮气的具体操作优选为：抽真空15s，冲氮气10s。
[0026]
步骤(1)中所述的分层为明显分层。
[0027]
步骤(1)中所述的反应的时间优选为12～36h；更优选为24h。
[0028]
步骤(1)中所述的除去未反应的原料的具体操作优选为于60℃减压旋蒸。
[0029]
步骤(1)中所述的萃取溶剂优选为正己烷。
[0030]
步骤(1)中所述的萃取的次数优选为3次。
[0031]
步骤(1)中所述的浓缩的具体操作优选为于70℃减压旋蒸。
[0032]
步骤(2)
①
中所述的水优选为去离子水。
[0033]
步骤(2)
①
中所述的水的用量优选为按小分子单体：水＝质量比1：0.9～1.1配比计算；更优选为按小分子单体：水＝质量比1：1配比计算。
[0034]
步骤(2)
①
中所述的引发剂为过硫酸铵、过硫酸钠或偶氮二异丁脒盐酸盐，优选为偶氮二异丁脒盐酸盐(aiba)。
[0035]
所述的引发剂的用量优选为按小分子单体：引发剂＝摩尔比100：0.05～5配比计算；更优选为按小分子单体：引发剂＝摩尔比100：2配比计算。
[0036]
步骤(2)
①
中所述的冰浴的时间优选为30s。
[0037]
步骤(2)
①
中所述的抽真空冲氮气的次数优选为3次。
[0038]
步骤(2)
①
中所述的抽真空冲氮气的具体操作优选为：抽真空15s，冲氮气10s。
[0039]
步骤(2)
①
中所述的反应时间优选为12～24h；更优选为18h。
[0040]
步骤(2)
①
中所述的浓缩的具体操作优选为减压旋蒸，优选温度为70℃。
[0041]
步骤(2)
①
中所述的丙酮的用量优选相当于所述的浓缩产物2～3倍体积计算。
[0042]
步骤(2)
①
中所述的透析中的透析袋的规格优选为截留分子量为500～1000。
[0043]
步骤(2)
②
中所述的浓缩的具体操作优选为于70℃减压旋蒸。
[0044]
步骤(2)
②
中所述的丙酮的用量优选相当于所述的浓缩产物2～3倍体积计算。
[0045]
所述的主链型大分子季铵盐在抑制香蕉枯萎病中的应用；优选包括如下步骤：将主链型大分子季铵盐配制成5～20mg/ml溶液后，浇灌于香蕉根部土壤即可。
[0046]
所述的浇灌的次数优选为3次。
[0047]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0048]
(1)当前对于香蕉枯萎病的预防与治疗主要以小分子化学防治为主，小分子在这些化学防治的过程中容易出现随雨水流失的现象，难以在土壤中长存达到灭杀香蕉枯萎病菌的效果，并且大量的使用会对周围环境生物造成毒害，甚至破坏环境生态。而主链型大分子季铵盐(pdmdaac、pbmdaac、pmbdaac)由于季铵基团位于大分子主链上，所以具有更高的正电荷密度，这使得在对病菌抑制作用时，会有更好的抑制活性，而且其较大的分子量与复杂的结构会使得其在土壤中随水的迁移性弱于小分子，能够在雨水的渗透下大量残存于土壤中，并且达到长效抑制香蕉枯萎病。与此同时，相较于小分子的内吸性作用方式，主链大分子由于其分子链长，体积较大，难以透过动植物表皮或是被吸收而进入生物体内，所以该药物对于环境和生物的毒副作用比小分子要小很多，对于生物与环境极为友好，符合当前绿色化学的理念。
[0049]
(2)本发明提供的主链型大分子季铵盐对于小鼠经口急性毒性为低毒甚至无毒且远低于小分子bc；对于斑马鱼急性毒性为中毒或接近低毒且远低于小分子bc。
[0050]
(3)该聚合物的合成方法简便，只需两步便可，而且其聚合方式与常用的主链大分子季铵盐不同，一般的主链型大分子季铵盐以缩聚的方式合成，其分子量的扩大会受到极大的制约，而该种大分子季铵盐是以自由基的聚合方式合成，简便而且分子量调节容易。其次原料易得，合成成本较低，对于生产设备要求较低，十分适合大规模商业生产。
附图说明
[0051]
图1是实施例1的主链型大分子季铵盐的合成路径示意图；其中，a为pmbdaac的合成路径示意图，b为pbmdaac的合成路径示意图，c为pdmdaac的合成路径示意图，
[0052]
图2是小分子的核磁谱图。
[0053]
图3为小分子的红外谱图。
[0054]
图4为大分子的核磁谱图。
[0055]
图5为大分子的红外谱图。
[0056]
图6为三种侧基不同的主链型大分子季铵盐以及小分子bc在土壤中的水淋出体积与淋出量的关系图。
[0057]
图7为三种侧基不同的主链型大分子季铵盐对于在土壤中的香蕉枯萎病的持续抑制情况图。
具体实施方式
[0058]
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0059]
本发明所用试剂均可从市场购得。
[0060]
实施例1:
[0061]
主链型大分子季铵盐的制备，反应过程如图1所示：
[0062]
(1)小分子单体的制备
[0063]
(a)dmdaac的制备
[0064]
在配有磁力搅拌子的茄型反应瓶中，将n-甲基二烯丙基胺(19.4g，0.2mol)用30ml丙酮溶解置于茄型反应瓶中，再称取溴甲烷(19.94g，0.21mol)溶解于30ml丙酮中，将其注入反应体系中，塞上胶口塞后，先在0～5℃下冰浴30s，然后抽真空(15s)并冲入氮气(10s)，重复该操作三次。然后将其置于油浴锅中，升温至40℃反应。反应24h后，会出现明显的分层现象，此时停止反应。将反应液于60℃减压旋蒸，除去未反应的原料。旋干后加入10ml去离子水将产物溶解，并加入100ml正己烷萃取，取下半部分，重复上述操作三次。最后将分离液于70℃减压旋蒸出溶剂，得到36.19g黄色固体产物，记为dmdaac，产率约为92.4％。其核磁谱图与红外谱图如图2和图3所示。
[0065]
(b)mbdaac的制备
[0066]
在配有磁力搅拌子的茄型反应瓶中，将n-甲基二烯丙基胺(19.4g，0.2mol)用30ml丙酮溶解置于茄型反应瓶中，再称取溴代正丁烷(28.77g，0.21mol)溶解于30ml丙酮中，将其注入反应体系中，塞上胶口塞后，先在0～5℃下冰浴30s，然后抽真空并冲入氮气，重复该操作三次。然后将其置于油浴锅中，升温至40℃反应。反应24h后，会出现明显的分层现象，此时停止反应。将反应液于60℃减压旋蒸，除去未反应的原料。旋干后加入10ml去离子水将产物溶解，并加入100ml正己烷萃取，取下半部分，重复上述操作三次。最后将分离液于70℃减压旋蒸出溶剂，得到43.83g黄色固体产物，记为mbdaac，产率约为91.1％。其核磁谱图与红外谱图如图2和图3所示。
[0067]
(c)bmdaac的制备
[0068]
在配有磁力搅拌子的茄型反应瓶中，将n-甲基二烯丙基胺(19.4g，0.2mol)用30ml丙酮溶解置于茄型反应瓶中，再称取溴化苄(26.58g，0.21mol)溶解于30ml丙酮中，将其注入反应体系中，塞上胶口塞后，先在0～5℃下冰浴30s，然后抽真空并冲入氮气，重复该操作三次。然后将其置于油浴锅中，升温至40℃反应。反应24h后，会出现明显的分层现象，此时停止反应。将反应液于60℃减压旋蒸，除去未反应的原料。旋干后加入10ml去离子水将产物溶解，并加入100ml正己烷萃取，取下半部分，重复上述操作三次。最后将分离液于70℃减压旋蒸出溶剂，得到40.3g黄色粘稠液体产物，记为bmdaac，产率约为87.7％。其核磁谱图与红外谱图如图2和图3所示。
[0069]
(2)大分子聚合物的制备
[0070]
(a)pdmdaac的制备
[0071]
将dmdaac(20g)用20ml去离子水溶解后，置于装有磁子的茄型反应瓶中，再加入引发剂偶氮二异丁基脒盐酸盐aiba(1.084g，0.004mol)，塞上密封塞，在0～5℃下冰浴30s后先抽真空然后充氮气，重复三次，然后将其置于恒温油浴锅中，加热至55℃，反应18h后停止反应。在70℃下减压旋蒸出部分溶剂，冷却后加入100ml丙酮搅拌，析出白色固体，将其用10ml去离子水溶解后，用透析袋(截留分子量为500～1000)进行透析滤去小分子。最后以在70℃下减压旋蒸，将产物浓缩后，用100ml丙酮沉析，在真空烘箱中以50℃干燥得到14.7g产物，记为pdmdaac，产率为73.5％。其核磁谱图与红外谱图如图4和图5所示。其分子量通过gpc测得，如表1所示。
[0072]
(b)pmbdaac的制备
[0073]
将mbdaac(20g)用20ml去离子水溶解后，置于装有磁子的茄型反应瓶中，再加入引发剂偶氮二异丁基脒盐酸盐aiba(1.084g，0.004mol)，塞上密封塞，在0～5℃下冰浴30s后先抽真空然后充氮气，重复三次，然后将其置于恒温油浴锅中，加热至55℃，反应18h后停止反应。在70℃下减压旋蒸出部分溶剂，冷却后加入100ml丙酮搅拌，析出白色固体，将其用10ml去离子水溶解后，用透析袋(截留分子量为500～1000)进行透析滤去小分子。最后以在70℃下减压旋蒸，将产物浓缩后，用100ml丙酮沉析，在真空烘箱中以50℃干燥得到12.4g产物，记为pmbdaac，产率为62.0％。其核磁谱图与红外谱图如图4和图5所示。其分子量通过gpc测得，如表1所示。
[0074]
(c)pbmdaac的制备
[0075]
将bmdaac(20g)用20ml去离子水溶解后，置于装有磁子的茄型反应瓶中，再加入引发剂偶氮二异丁基脒盐酸盐aiba(1.084g，0.004mol)，在0～5℃下冰浴30s后先抽真空然后充氮气，重复三次，然后将其置于恒温油浴锅中，加热至55℃，反应18h后停止反应。在70℃下减压旋蒸出部分溶剂，冷却后加入100ml丙酮搅拌，析出白色固体，将其用10ml去离子水溶解后，用透析袋(截留分子量为500～1000)进行透析滤去小分子。最后以在70℃下减压旋蒸，将产物浓缩后，用100ml丙酮沉析，在真空烘箱中以50℃干燥得到9.6g产物，记为pbmdaac，产率为48.2％。其核磁谱图与红外谱图如图4和图5所示。其分子量通过gpc测得，如表1所示。
[0076]
表1
[0077]
聚合物种类m
nmw
重复单元数(n)pdmdaac7.36
×
10312.9
×
10335pmbdaac4.93
×
1038.19
×
10320pbmdaac2.41
×
1034.37
×
1039
[0078]
实施例2主链型大分子季铵盐以及小分子苯扎氯氨(bc)对于小鼠的急性毒性
[0079]
参照《gb 15193.3-2014食品安全国家标准急性经口毒性试验》，采用经口灌胃法，评价四种药(主链型大分子季铵盐pdmdaac、pmbdaac、pbmdaac和bc)对小鼠的经口急性毒性。试验前，试验小鼠(昆明小鼠，体重20-25g，购于广州大学实验动物中心)禁食4～6h，自由饮水。具体操作方法如下：将小鼠分为5组，即3组季铵盐组，1组苯扎氯氨(bc)组，1组空白对照组。每组10只体重相近的小鼠，称重后，按小鼠体重确定灌胃量。将实施例1中得到的三种聚合物以及bc分别用无菌水溶解，最终使其浓度为50mg/ml。首先以5000mg/kg的量对小鼠进行灌胃(若小鼠体重为20g，此时灌胃量为2ml)，重复操作三次，若小鼠24h内出现死亡则按照3000mg/kg的量再进行灌胃，若小鼠24h内出现死亡则按照2000mg/kg的量再进行灌胃，若还出现死亡则按照555mg/kg的量继续操作，若继续出现死亡则停止实验。空白对照组经口灌胃相同体积的无菌水。灌胃后禁食1h～2h，观察无明显问题后喂食，并观察48h和14d内，小鼠的状态、体重和饮食情况，并统计每个处理组下小鼠的死亡情况。
[0080]
利用aot425软件处理数据，求出三类不同结构的季铵盐对小鼠的半数致死计量并进行毒性评估。结果如表2所示，说明三类大分子季铵盐对于以小鼠为代表的哺乳类动物的毒性均要远低于小分子bc这种商用抑菌剂，可达到低毒甚至无毒的水平。
[0081]
表2
[0082]
药物种类半数致死量ld
50
(mg/kg)毒性评估pdmdaac》5000无毒pmbdaac3000～5000低毒pbmdaac2000～3000低毒bc《555高毒
[0083]
实施例3主链型大分子季铵盐以及小分子苯扎氯氨(bc)对于斑马鱼的急性毒性
[0084]
(1)供试斑马鱼的驯养
[0085]
选用一定体长(2.0
±
1.0)cm以及一定体重(0.3
±
0.1)g的斑马鱼(购于广州市芳村花鸟鱼虫市场)作为试验对象。
[0086]
在试验前，将试验的斑马鱼置于试验相同的环境条件下驯养一定时间，一般为7d～14d。在驯养期间，每天早上及晚上各喂食一次，并且及时清除粪便和食物残渣。在正式试验开始前24停止喂食，保证试验的准确性。试验用水为经活性炭处理且曝气除氯后的自来水，水质硬度在10mg/l～250mg/l之间(以caco3计)，ph值在6.0～8.5之间，溶解氧保持在5.8mg/l以上，试验水温21℃～25℃。
[0087]
(2)鱼类急性经口毒性
[0088]
参照《gb/t 31270.12-2014化学农药环境安全评价实验准则——第12部：鱼类急性毒性试验》，采用半静态试验法，试验期间定时(一般24h)更换一次试验药液，以保证供试物在药液中的浓度。具体方法如下：在预试验确定的浓度范围内按一定比例间距(级差应控制在2.2倍以内)设置5～7个浓度组(10mg/l、8mg/l、6mg/l、4mg/l、2mg/l、1mg/l、0.5mg/l)，并设一个空白对照组，每组至少放入7尾鱼，并保证各组使用鱼数相同，试验开始后6h内随时观察并记录试验用鱼的中毒症状及死亡率，其后于24h、48h和96h观察并记录试验用鱼的中毒症状及死亡率，当用玻璃棒轻触鱼尾部，无可见运动即为死亡，并及时清除死鱼。每天测定并记录试验药液温度及ph值。
[0089]
利用spss处理数据，求出三类不同结构的季铵盐对斑马鱼的半数致死浓度(lc
50
)。结果如表3所示，说明三类大分子季铵盐对于以斑马鱼为代表的水生类动物的毒性均要远低于小分子bc这种商用抑菌剂，可达到中毒(lc
50
＝1～10mg/l)甚至接近低毒(lc
50
》10mg/l)的水平，其在使用后能够较小的对水环境的生物产生毒副作用。
[0090]
表3
[0091][0092]
实施例4主链型大分子季铵盐在土壤中随水的迁移性
[0093]
(1)土柱填装
[0094]
将风干后的50g试验土分层装入长10cm、内径为8cm的铝柱中，并将其夯实，最终土柱填装的高度为7cm。每次在放入土样后，将土层夯实，并且将表面抓花，尽可能的减少在人为填充过程中可能造成的分层。整个土柱填装完成后，在其表面覆上2cm厚、粒径约为0.5mm
的石英砂，以此来减弱溶液在早期入渗时对土柱表层的冲刷而造成的误差。最后在最底部加上过滤的钢丝网，防止土壤随着渗出的滤液而流出，从而影响后续渗液的药物浓度测量。
[0095]
(2)土柱准备
[0096]
用20ml的水以一定速率淋洗土柱后，静置1天，使土柱内的土壤对水的吸附达到饱和平衡态。
[0097]
(3)纯水淋柱
[0098]
称取1g待测药物，用5ml超纯水溶解均匀后，用滴定管以一定的滴定速率加入土柱中，随后以纯水用相同的滴定速率滴加入土柱。将滴定管固定，使其滴嘴与土柱上表面保持2～3cm的高度，在滴加纯水时，调整滴速使得土柱表面出现一定高度的积水。通过不间断往滴定管中补水，保证滴加过程不中断。
[0099]
(4)收集滤液
[0100]
观察滤液渗出情况，记录滤液渗出体积；同时每渗出50ml时采集1ml渗出液，待渗出液累积体积达到500ml时停止试验，测定各阶段渗出液的吸光度并用标准曲线换算成相应的浓度，计算出渗出药物质量百分比并绘制渗出体积与渗出质量百分比曲线。
[0101]
结果如图6所示，随着淋出液体积的增加，不论是大分子还是小分子的药物随水淋出的量是增加的，但大分子明显比小分子的淋出量要少。这说明大分子在土壤中的随水的流动的迁移性要远低于小分子，其可以在雨水冲洗下仍然大量保存于土壤中。
[0102]
实施例5主链型大分子季铵盐对于土壤外香蕉枯萎病菌抑制
[0103]
参照“lin yaling,liu qiongqiong,cheng liujun,lei yufeng,zhang anqiang.synthesis and antimicrobial activities of polysiloxane-containing quaternary ammonium salts on bacteria and phytopathogenic fungi.reactive&functional polymers,2014,85:36-44”或是“刘琼琼.高分子季铵盐的合成、表征及其对细菌和真菌的抑制特性研究，华南理工大学硕士论文，2014”制得分子量为1800、季铵盐接枝率为1/3的pdms-g-bc，与“实施例1”中的三种大分子季铵盐以及bc一起按照下述方法进行对土壤外香蕉枯萎病菌抑制效果测试。
[0104]
(1)马铃薯培养基(pd)的配制
[0105]
将马铃薯洗净后去皮，然后切成小块。称取200g加入1000ml蒸馏水，加热煮沸30min，然后用四层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖20g，继续加热搅拌混匀，稍微冷却后加入蒸馏水至1000ml，得到pd培养基。
[0106]
(2)菌种活化
[0107]
从试管中挑取少量香蕉枯萎病菌(foc4，华南农业大学植物病理学系真菌实验室惠赠，已在文献“刘任,杨静美,梁小媚,等.不同条件下韭菜汁对香蕉枯萎病菌4号小种活性抑制的研究[j].植物检疫,2012,26(2):13-16.”中公开)在pda上划线，在28℃下的培养箱中培养3d后，再在培养后的pda平板上用打孔器打孔，将打孔得到的菌碟转移至新的pda培养基的中心，置于28℃的培养箱中培养4～5d。
[0108]
(3)ttc显色法测定样品对于香蕉枯萎病菌的最低抑菌浓度(mic)
[0109]
最低抑菌浓度(mic)是指将药物和菌体在特定的条件下培养后，可以表现出抑制菌体增长的最低药物浓度。具体测定方法如下：用马铃薯液体培养基将活化好的的香蕉枯萎病菌(foc4)菌悬液稀释至106～107cfu/ml后，将不同浓度的样品药物逐一加入到96孔板
中，每孔滴加100μl，然后逐次将100μl的菌悬液滴入其中，放入生化培养箱中，在37℃下培养24h后，每孔再分别滴加50μl的0.05％的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(ttc)溶液，用移液枪吹打均匀后在培养箱中37℃下避光培养2～4h，然后观察结果，以没有长菌(未变红)的那些孔对应的药物浓度作为mic。除此以外，设置无药生长对照组与无菌对照组，往无药生长对照组对应的孔中加入菌悬液100μl，液体培养基100μl，往无菌对照组对应的孔中只加入培养基200μl，其余实验条件与步骤同正常试验组相同。
[0110]
(4)涂布法测定样品对于香蕉枯萎病菌的最低杀菌浓度(mfc)
[0111]
最小杀菌浓度是指药物能杀死99.9％的细菌或真菌的最低浓度。其测试方法为：将取mic浓度以下一个浓度至其以上三个梯度浓度各100μl，将其涂布在相应的固体培养基上，然后在培养箱中以37℃培养24h，观察有无菌体生长，以固体培养基上无菌落生长的聚合物浓度作为mfc。
[0112]
结果如表4所示，可以明显发现主链型季铵盐pdmdaac、pmbdaac、pbmdaac的抑菌活性均要强于pdms-g-bc这类侧链型季铵盐，而且对于pbmdaac这种带有苄基的主链季铵盐，其对于香蕉枯萎病的抑制活性甚至接近于商用小分子抑菌剂(bc)，说明其抑制效果相当明显。
[0113]
表4
[0114]
药物种类mic(μg/ml)mfc(μg/ml)mfc/micpdms-g-bc25010004pdmdaac1603202pmbdaac80801pbmdaac60601bc402005
[0115]
实施例6主链型大分子季铵盐对于土壤中香蕉枯萎病菌抑制
[0116]
(1)试验准备
[0117]
将试验土壤(试验土壤来自广东省农业科学院果树研究所香蕉地)置于121℃下，高温灭菌20min后分装干燥储存。另外制备含有固体马铃薯培养基的平板。
[0118]
(2)配制待测溶液
[0119]
在无菌操作台中，将活化好的香蕉枯萎病菌(已在文献“华南农业大学植物病理学系真菌实验室惠赠，参考文献：刘任,杨静美,梁小媚,等.不同条件下韭菜汁对香蕉枯萎病菌4号小种活性抑制的研究[j].植物检疫,2012,26(2):13-16.”中公开)用马铃薯培养基配制成溶液，然后加入灭菌后的土壤使其混合均匀，最终达到2.25
×
105个/g土的浓度。将实施案例一中得到的三种大分子季铵盐分别与不同体积的水混合，最终形成体积不同但浓度均为600μg/ml的药液，最后分别向其加入0.5g含有真菌的土壤并置于50ml的离心管，放入培养箱中在28℃下以100转/分钟的速度震荡培养。
[0120]
(3)平板涂布
[0121]
培养48h后，从每个离心管中取出25μl的混合液，将其用涂布棒均匀涂在准备好的固体马铃薯培养基上，每组试验重复3次，将上述涂布平板放入培养箱中28℃培养24h后观察平板表面菌落生长情况，每隔一天重复上述操作一次。每次取完药液后应补加相应体积的无菌水。以涂布平板上不出现明显菌落为有效抑制，以涂布平板上出现明显菌落的最小
时间为持续抑制时间。最后统计各药物在不同药液与土壤配比下的持续抑制时间。
[0122]
实验结果如图7所示，本实施案例中的大分子季铵盐可对土壤中的香蕉枯萎病菌达到至少35天的有效抑制，而且随着用量越大，这种抑制效果有着明显的增强。
[0123]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。