一种布鲁氏菌外膜蛋白OMP25与周质蛋白BP26的融合蛋白及其表达和应用的制作方法

文档序号:23052045发布日期:2020-11-25 17:27阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种布鲁氏菌外膜蛋白omp25与周质蛋白bp26的融合蛋白,其特征在于,将omp25蛋白n端信号肽序列与bp26蛋白n端信号肽序列删除,保留其抗原决定簇序列,中间通过linker序列ggaggcgggggttctggaggcgggggttct将之连接成为融合蛋白;所述的omp25蛋白n端信号肽序列为第1个aa~29个aa,所述的bp26蛋白n端信号肽序列为第1个aa~24个aa。

2.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌外膜蛋白omp25与周质蛋白bp26的融合蛋白,其特征在于,根据pet28a(+)载体的多克隆位点,在omp25蛋白序列的两端分别引入ndei和bamh1两个酶切位点及保护碱基ggaattc和cg,在bp26蛋白序列的两端分别引入bamh1和ecori两个酶切位点及保护碱基cg和c,便于插入表达载体pet28a(+)中。

3.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌外膜蛋白omp25与周质蛋白bp26的融合蛋白,其特征在于,含有布鲁氏菌外膜蛋白omp25的抗原表位氨基酸序列,第25个aa-第213个aa,共189aa:

含有布鲁氏菌周质蛋白bp26的抗原表位氨基酸序列,第30个aa-第250个aa,共221aa:

构建的含有布鲁氏菌外膜蛋白omp25和周质蛋白bp26的融合蛋白的抗原表位氨基酸序列422aa:

4.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌外膜蛋白omp25与周质蛋白bp26的融合蛋白,其特征在于,含有布鲁氏菌外膜蛋白omp25的抗原表位基因的dna序列,588bp:

ggaattccatatggacgccatccaggaacagcctccggttccggctccggttgaagtagctccccagtatagctgggctggtggctataccggtctttaccttggctacggctggaacaaggccaagaccagcaccgttggcagcatcaagcctgacgattggaaggctggcgcctttgctggctggaacttccagcaggaccagatcgtatacggtgttgaaggtgatgcaggttattcctgggccaagaagtccaaggacggcctggaagtcaagcagggctttgaaggctcgctgcgtgcccgcgttggctacgacctgaacccggttatgccgtacctcacggctggtattgccggttcgcagatcaagcttaacaacggcttggacgacgaaagcaagttccgcgtgggttggacggctggtgccggtctcgaagccaagctgacggacaacatcctcggccgcgttgagtaccgttacacccagtacggcaacaagaactatgatctggccggtacgactgttcgcaacaagctggacacgcaggatttccgcgtcggcatcggctacaagttcggatcccg

含有布鲁氏菌周质蛋白bp26的抗原表位基因的dna序列(681bp):

cgggatccgagaatcagatgacgacgcagcccgcgcgcatcgccgtcaccggggaaggcatgatgacggcctcgcccgatatggccattctcaatctctcggtgctacgccaggcaaagaccgcgcgcgaagccatgaccgcgaataatgaagccatgacaaaagtgctcgatgccatgaagaaggccggcatcgaagatcgcgatctccagacaggcggcatcaatatccagccgatttatgtctatcctgacgacaagaacaacctgaaagagcctaccatcaccggctattctgtatccaccagtctcacggttcgcgtgcgcgaactggccaatgttggaaaaattttggatgaatccgtcacgctcggtgttaatcagggcggtgatttgaacctggtcaatgataatccctctgccgtgatcaacgaggcgcgcaagcgcgcagtggccaatgccattgccaaggcgaagacgcttgccgacgctgcaggcgtggggcttggccgtgtggtggaaatcagtgaactgagccgcccgcccatgccgatgccaattgcgcgcggacagttcagaaccatgctagcagccgcaccggacaattccgtgccgattgccgcaggcgaaaacagctataacgtatcggtcaatgtcgtttttgaaatcaagtaagaattcc

构建的含有布鲁氏菌外膜蛋白omp25和周质蛋白bp26的融合蛋白抗原表位基因的dna序列,1289bp:

ggaattccatatggacgccatccaggaacagcctccggttccggctccggttgaagtagctccccagtatagctgggctggtggctataccggtctttaccttggctacggctggaacaaggccaagaccagcaccgttggcagcatcaagcctgacgattggaaggctggcgcctttgctggctggaacttccagcaggaccagatcgtatacggtgttgaaggtgatgcaggttattcctgggccaagaagtccaaggacggcctggaagtcaagcagggctttgaaggctcgctgcgtgcccgcgttggctacgacctgaacccggttatgccgtacctcacggctggtattgccggttcgcagatcaagcttaacaacggcttggacgacgaaagcaagttccgcgtgggttggacggctggtgccggtctcgaagccaagctgacggacaacatcctcggccgcgttgagtaccgttacacccagtacggcaacaagaactatgatctggccggtacgactgttcgcaacaagctggacacgcaggatttccgcgtcggcatcggctacaagttcggaggcgggggttctggaggcgggggttctatgaacgagaatcagatgacgacgcagcccgcgcgcatcgccgtcaccggggaaggcatgatgacggcctcgcccgatatggccattctcaatctctcggtgctacgccaggcaaagaccgcgcgcgaagccatgaccgcgaataatgaagccatgacaaaagtgctcgatgccatgaagaaggccggcatcgaagatcgcgatctccagacaggcggcatcaatatccagccgatttatgtctatcctgacgacaagaacaacctgaaagagcctaccatcaccggctattctgtatccaccagtctcacggttcgcgtgcgcgaactggccaatgttggaaaaattttggatgaatccgtcacgctcggtgttaatcagggcggtgatttgaacctggtcaatgataatccctctgccgtgatcaacgaggcgcgcaagcgcgcagtggccaatgccattgccaaggcgaagacgcttgccgacgctgcaggcgtggggcttggccgtgtggtggaaatcagtgaactgagccgcccgcccatgccgatgccaattgcgcgcggacagttcagaaccatgctagcagccgcaccggacaattccgtgccgattgccgcaggcgaaaacagctataacgtatcggtcaatgtcgtttttgaaatcaagtaagaattcc。

5.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌外膜蛋白omp25与周质蛋白bp26的融合蛋白,其特征在于,

将权利要求1所述的含有布鲁氏菌外膜蛋白omp25基因和周质蛋白bp26基因的dna序列分别送至生物公司化学合成,得到的基因片段分别经过酶切后连接至pet28a(+)载体构建重组质粒,将重组质粒进行双酶切和测序鉴定后,确定正确,命名为pet28a-omp25-bp26;

构建的重组质粒表达布鲁氏菌外膜蛋白omp25和周质蛋白bp26的融合蛋白,全长1289bp,422个aa,n端为omp25蛋白片段,长189个aa,c端为bp26蛋白片段,长221个aa,中间含有10个aa的连接片段linker,为4gly1ser4gly1ser。

6.如权利要求1所述的一种布鲁氏菌外膜蛋白omp25与周质蛋白bp26的融合蛋白的表达,其特征在于,

omp25基因片段经ndei和bamh1双酶切,bp26基因片段经bamh1和ecori双酶切后,同时与经ndei和ecori双酶切的pet28a(+)载体质粒进行连接,使两个蛋白基因插入到载体的ndei和ecori之间,获得表达omp25和bp26融合蛋白的重组质粒。

7.根据权利要求6所述的一种布鲁氏菌外膜蛋白omp25与周质蛋白bp26的融合蛋白的表达,其特征在于,

将重组质粒转化rosetta(de3)表达菌,涂布在含50μg/ml卡那霉素的固体lb平板上,37℃过夜培养;将阳性转化子接种含50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基中,37℃,180rpm振荡过夜培养,所得即为表达菌母液;将母液按照1/50比例加入含卡那霉素50μg/ml的新鲜液体lb培养基中,37℃,180rpm振荡3h,加入终浓度为0.5mmol/l的iptg,继续诱导培养6h,12000rpm离心5min收集菌体沉淀,进行sds-page检测;成功表达后获得相对分子量约53kd的重组融合蛋白,对照空质粒转化子无此条带。

8.如权利要求1所述的一种布鲁氏菌外膜蛋白omp25与周质蛋白bp26的融合蛋白的应用,其特征在于,将表达纯化复性后的融合蛋白,用于疫苗、布鲁氏菌抗体检测以及免疫制备布鲁氏菌单抗或多抗。

9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,将融合蛋白作包被抗原,建立并优化布鲁氏菌ielisa抗体检测方法,

以100μl/孔包被elisa板,4℃密闭反应过夜;用0.01mol/lpbst洗涤4次,250μl/孔;按照最佳封闭液和条件进行封闭,250μl/孔;pbst洗涤4次;按照100μl/孔加入样品,37℃孵育45min;pbst洗涤4次;按照100μl/孔加入稀释后的酶标二抗,37℃孵育30min;pbst洗涤4次;按照100μl/孔加入tmb底物液,避光室温显色15min;按照50μl/孔加入2mol/l硫酸终止反应。在od450处读数,求出p/n值;

所述布鲁氏菌ielisa抗体检测方法的临界值为0.1254。当od450值>0.1254时,判为阳性,od450值≤0.1254时,判为阴性。

10.如权利要求1所述的一种布鲁氏菌外膜蛋白omp25与周质蛋白bp26的融合蛋白的应用,其特征在于,蛋白包被浓度是4.5mg/l,包被条件是4℃过夜,猪血清作为封闭液,37℃封闭1h,二抗稀释度为1/4000倍,室温显色15min;

用辣根过氧化物酶(hrp)标记布鲁氏菌外膜蛋白omp25和周质蛋白bp26的融合蛋白,用捕获法或夹心法检测抗布鲁氏菌igm或igg抗体,用金标法检测抗布鲁氏菌抗体。


技术总结
本发明公开了一种布鲁氏菌外膜蛋白OMP25与周质蛋白BP26的融合蛋白及其表达和应用,将OMP25蛋白N端信号肽序列与BP26蛋白N端信号肽序列删除,保留其抗原决定簇序列,中间通过Linker序列GGAGGCGGGGGTTCTGGAGGCGGGGGTTCT将之连接成为融合蛋白;所述的OMP25蛋白N端信号肽序列为第1个aa~29个aa,所述的BP26蛋白N端信号肽序列为第1个aa~24个aa。本发明比单独蛋白更经济、方便,抗原性更优。蛋白获得耗时少产量高,避免了活菌的培养和生物安全风险,特异性强,定位布鲁氏菌细胞抗原表位更有利于揭示体液免疫的本质。

技术研发人员:吕素芳;李峰;董炳梅;郭广君;沈志强;胡莉萍
受保护的技术使用者:山东省滨州畜牧兽医研究院
技术研发日:2020.08.04
技术公布日:2020.11.24
当前第2页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1