一种与单纯性先天性心脏病相关的SNP标志物及其应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种与单纯性先天性心脏病相关的snp标志物。
背景技术：
：先天性心脏病(congenitalheartdisease,chd)，简称先心病，是指出生时即存在的心脏、血管结构和功能上的异常。其临床后果极为严重，通常导致流产、死胎、死产、新生儿死亡，以及儿童、青少年和成人残疾。目前，先心病已占到主要出生缺陷疾病1/3，成为影响儿童身心健康及人口生存质量的重大公共卫生问题，给社会和家庭造成严重的经济和精神等方面的负担。先心病中约有80-90％仅表现为心脏畸形，而不伴有其他系统的先天异常，称之为单纯性先天性心脏病。多年来研究已经证实它是一种多基因遗传病，主要是由于胚胎期遗传因素和环境因素共同作用导致心脏血管异常发育所引起的，遗传度55％～65％。目前研究认为，单纯性chd不但涉及多种基因，而且与这些基因在不同时间和不同空间的先后表达和相互作用有关，其中任何基因表达的质或量的异常都可能影响心脏的发育。比如：基因组水平上转录因子nkx2-5、gata4、tbx5、信号通路以及参与心脏发育的某些基因突变，单核苷酸多态性(snp)、基因拷贝数变异(cnv)等基因多态性，表观遗传学方面包括dna甲基化、microrna、组蛋白修饰等，都可能与chd的发生发展相关。dna甲基化作为表观遗传学上研究最深入的一种机制，与人类多种疾病的发生发展相关。目前研究表明，参与哺乳动物cpg岛dna甲基化主要涉及三种dna甲基化转移酶(dnamethyltransferase,dnmt)：维持甲基化的dna甲基转移酶(dnmt1)和从头甲基化的dna甲基转移酶(dnmt3a、dnmt3b)。dnmt1是细胞中丰度最高的dnmt，主要负责细胞分裂之后基因组甲基化的维持，用于保持子代细胞与母细胞相同的特异性甲基化模式。dnmt3a和dnmt3b是从头甲基转移酶，这两个酶主要负责在生殖细胞、胚胎干细胞中以及胚胎发育时期dna新的甲基化进程。以往dnmts基因多态性研究主要集中于肿瘤方面，未见先心病方面的研究报道。dnmts基因的snp研究涉及启动子区域的研究比较少，特别是dnmt1基因，而启动子区在基因的表达调控中发挥重要的作用。影响基因表达水平一个重要的原因是基因多态性，它也是影响个体疾病易感性、表型和治疗反应性差异的重要因素，其中最重要和最常见的表现形式是snp。目前有多篇文献报道dnmts基因snp位点与肿瘤、精神病、感染、生长发育等方面的疾病存在关联性，调控dnmts基因的表达或翻译过程。不过，目前在单纯性先心脏病患儿中进行研究的dnmts基因，只有dnmt1中的rs16999593、rs2228612、rs10420321、rs2288349四个位点，并且还是本实验室之前的工作内容，其他的、尤其是对基因表达有重要影响的启动子区域的snp位点还没有报道。因此，研究dnmt1，dnmt3a、dnmt3b三个基因多态性与单纯性先心脏病的相关性，建立临床检测方法，总结河南人群dnmts基因snp信息，以寻求更有效、更特异性的分子诊断靶点或特异性的生物标志物，为预测或评估人群中生育先天性心脏病的潜在风险提供新的思路，对于最大限度地降低患儿的出生，提高我国人口综合素质有非常重要的意义。有研究报道,新生儿先天性心脏病(chd)的发病率约为1‰，在自然流产或死亡新生儿中发生率更高。因此，提供新的先天性心脏病的产前筛查检测方法，提高检测的准确性，从而为先天性心脏病的诊断提供更客观准确的依据，有利于我国先天性心脏病高危人群的早期筛查、及早治疗和预防。技术实现要素：为克服现有技术中对于新生儿先天性心脏病检测方法的不足，以及检测准确率较低的现状，本发明提供了一种与单纯性先天性心脏病相关的snp标志物。本研究拟利用核酸质谱massarray技术，对河南省汉族人群的先天性心脏病患儿中dnmt1，dnmt3a、dnmt3b三个基因的snp位点，尤其是启动子区域，进行全面系统的研究，并与正常儿童比较，分析dnmts基因多态性与先天性心脏病是否存在关联，哪些基因型为疾病的风险因子，dnmts相关基因的交互作用是否影响了先天性心脏病的发生。针对筛选出来的特异性位点，对筛选出来的特异性位点建立特异检测方法,形成单纯性先天性心脏病易感基因检测试剂盒。本发明公开了dnmt3a基因在制备检测单纯性先天性心脏病易感者的检测试剂中的用途。优选的，本发明进一步公开了dnmt3a基因的rs1550117位点的多态性在制备检测单纯性先天性心脏病的检测试剂中的用途。优选的，dnmt3a基因的rs1550117位点的aa基因型患单纯性先天性心脏病的风险显著高于该位点其他基因型患单纯性先天性心脏病的风险。本发明公开了一种用于扩增dnmt3a基因的rs1550117位点的特异性引物对。优选的，所述引物对的核苷酸序列为acgttggatgctgctggaggagtgagatg和acgttggatgcacctctgtctaattccacc，分别如seqidno:4和seqidno:5所示。本发明公开了一种用于扩增dnmt3a基因的rs1550117位点的特异性单碱基延伸引物。优选的，所述单碱基延伸引物地序列为gcacagccactcact，如seqidno:6所示。本发明公开了扩增dnmt3a基因的rs1550117位点的特异性引物在制备检测单纯性先天性心脏病的检测试剂中的用途。优选的，所述引物分别如seqidno:4和seqidno:5所示。优选的，所述引物如seqidno:6所示。本发明公开了一种检测先天性心脏病的试剂盒。优选的，所述试剂盒包括扩增dnmt3a基因的rs1550117位点的特异性引物。优选的，所述试剂盒包括的特异性引物分别如seqidno:4和seqidno:5所示和/或seqidno:6所示。本发明提供了一种可用于先天性心脏病易感者筛选的基因标志物，即dnmt3a基因的rs1550117位点。通过检测样本dnmt3a基因的rs1550117位点中的gg、ag、aa基因型，从而判断样本是否与先心病易感性相关，其中，rs1550117位点的aa基因型患单纯性先天性心脏病的风险显著高于该位点其他基因型患单纯性先天性心脏病的风险。附图说明图1为w1-uep质谱图。图2为w2-uep质谱图。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1实验样本的来源分析收集单纯性chd患儿的外周血样本和临床病例资料，正常对照为来我单位进行亲子鉴定、无疾病史以及家族史的核心家系，并参考我单位人类遗传资源库的管理办法，使标本的采集、保存、使用均进行标准的信息化管理。同时，入选的chd标本根据临床表现，进行染色体g显带分析，确认是否具有染色体病。本研究拟对196例chd患儿以及195例正常儿童进行对照研究。这291份样本的基本信息如下表1所示。表1先天性心脏病患儿及正常儿童基本信息实施例2dnmt基因snp位点初步筛选首先在hapmap和1000genomes数据库中，对中国汉族人群的dnmt1，dnmt3a、dnmt3b三个基因进行snp位点查询。要求maf≥0.05，同时保证全面覆盖启动子区，或编码区等功能区域，并补充一些有文献报道的内含子区域的snp。初步筛选获得24个dnmt基因的snp相关位点，这24个位点的基本信息如下下表2所示。表224个dnmts基因相关snp位点基本信息实施例3质谱法筛选与先天性心脏病相关的snp位点1.snp扩增引物的设计于合成对于实施例2中初步筛选确定snp位点，以snp位点为中心截取100bp以上长度的基因序列，并将序列信息整理成标准格式。结合文献采用assaydesigner软件进行引物设计。引物合成后稀释备用。24个snps的扩增引物和单碱基延伸引物序列如下表3。表3:24个snps的扩增引物和单碱基延伸引物序列2.dna提取和质检提取基因组dna，使用nanodrop2000仪器进行od值检测，dna质检合格，用去离子水或tris-cl稀释为浓度15-20ng/ul，-20℃保存备用。3.massarray系统基因分型。具体流程为96孔pcr扩增，96孔sap反应，96孔单碱基延伸反应，树脂纯化，上机检测以及收集数据。1)样本pcr扩增反应体系如下表4所示。表4pcr扩增反应体系试剂最后在5μl反应中的浓度5μl中的试剂体积[μl]水,hplc级n/a0.810xpcrbufferwith20mmmgcl22mmmgcl20.525mmmgcl22mm0.425mmdntpmix500μm0.10.5umprimermix0.1μm15u/μlpcrenzyme**1u/rxn0.25ng/μldna10ng/rxn2总体积[ul]n/a5.0002)样本pcr反应程序如下。3)反应产物碱性磷酸酶处理。配制虾碱性磷酸酶(shrimpalkalinephosphatase，sap)处理反应液，将上述步骤2)中的pcr反应产物进行碱性磷酸酶处理，消除反应体系中剩余的dntp，其消化反应体系如表5所示。表5：pcr扩增反应产物碱性磷酸酶处理的反应体系试剂最后在7μl反应中的浓度2μl中的试剂体积[μl]超纯水n/a1.53sap缓冲液0.243x0.17sapenzyme(1.7u/ul)0.5u0.30总体积[ul]n/a2.000消化反应程序为：37度40min；85度5min；4度hold。4)单碱基延伸反应。配置延伸反应液，将步骤3)中碱性磷酸化处理后的pcr反应产物进行延伸反应，延伸反应体系如表6所示。表6：单碱基延伸反应体系试剂最后在9μl反应中的浓度2μl中的试剂体积[μl]超纯水n/a0.619iplex缓冲液0.222x0.200iplexterminationmix1x0.200extendprimermix0.84/1.04/1.57μm0.94iplexenzyme1x0.041总体积[ul]n/a2.0005)单碱基延伸pcr反应条件如下。6)树脂纯化及质谱分析。在384/6mgdimple板里均匀填充树脂并放置10分钟使其晾干。在384样本板的每个孔中加16μl水。将384样本板轻轻翻转过来扣在dimple板上，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中。将384样本板放置翻转离心机中室温旋转混匀30分钟。对延伸产物进行脱盐纯化，避免离子在质谱中对待测样本的影响，消除盐峰干扰。启动massarraynanodispenserrs1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384-wellspectrochipbioarray上。将点样后的spectrochip芯片使用maldi-tof质谱仪分析，检测结果使用typer4.0软件获取原始数据及基因分型图。分型图结果分别如附图1和附图2所示。实施例4snp数据分析首先采用spss23.0软件进行数据的统计分析，计算基因型频率和等位基因频率，并且检验h-w平衡和maf。然后再进行单个snp的关联分析，通过pearson卡方检验或fisher精确检验，分析正常组和疾病组在每个位点上基因型和等位基因的差异，寻找与疾病相关的位点。结果显示：在对照组中，所有24个snp的基因型符合h-w平衡。其中dnmt3a基因的rs1550117位点与chd风险之间存在显著相关性。在纯合模型中，与gg基因型相比，aa基因型与chd风险显着升高(or＝2.08,95％ci＝1.03-4.21)。在隐形模型中，与ag/gg基因型相比，aa基因型与chd风险也显着升高(or＝1.79，95％ci＝1.12-2.88)。先天性心脏病病例与对照组中dnmt3a基因的rs1550117位点相关性分析如下表7所示。表7先天性心脏病病例与对照组dnmt3a基因rs1550117相关性分析以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>河南省生殖健康科学技术研究院（河南省出生缺陷干预工程技术研究中心）<120>一种与单纯性先天性心脏病相关的snp标志物及其应用<130>2020<160>72<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>29<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>1acgttggatgtcacctttcggtcctcctc29<210>2<211>29<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>2acgttggatgccacgataattccttcccc29<210>3<211>15<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>3gccctccagcggccc15<210>4<211>29<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>4acgttggatgctgctggaggagtgagatg29<210>5<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>5acgttggatgcacctctgtctaattccacc30<210>6<211>15<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>6gcacagccactcact15<210>7<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>7acgttggatgtgtagcttgtctccaccatc30<210>8<211>29<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>8acgttggatgatcgcgccattgcactcag29<210>9<211>15<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>9gcctgggtgacagat15<210>10<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>10acgttggatggtagggccaggattagatag30<210>11<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>11acgttggatgaagtgacttggaaaactcgg30<210>12<211>17<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>12gaaaactcggtttcagc17<210>13<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>13acgttggatgcaccctagttaccagatctc30<210>14<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>14acgttggatggaaaaggaactactgagggc30<210>15<211>17<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>15tctgggttgtttaggga17<210>16<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>16acgttggatggtattaatccccaccaaccc30<210>17<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>17acgttggatgtagtatcaccaggcgatctc30<210>18<211>18<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>18accacttctcggacctgc18<210>19<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>19acgttggatgccaaaatcacgtccatgctg30<210>20<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>20acgttggatgctttctcacatctgtgtccg30<210>21<211>18<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>21ccctccgtgtgtcctgac18<210>22<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>22acgttggatgtgcaatgagccatgattggg30<210>23<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>23acgttggatgaagatctcaccactgcacgc30<210>24<211>18<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>24tctccagccggggtgaca18<210>25<211>29<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>25acgttggatgaggatgtgggccatgctct29<210>26<211>29<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>26acgttggatgtcacgctgggacagaggta29<210>27<211>18<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>27aataggtaaggatgcggc18<210>28<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>28acgttggatgacgttgacaagttttgtggg30<210>29<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>29acgttggatgatttgttacgtcgtggctcc30<210>30<211>19<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>30ggctccagttacaaaaaaa19<210>31<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>31acgttggatgccatgattgaatgggccctg30<210>32<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>32acgttggatgtgccctcatttaccttctgg30<210>33<211>20<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>33cctctaccttctggtggctc20<210>34<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>34acgttggatgctggttcagcaaaaccaatc30<210>35<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>35acgttggatggtgtgccccaaacataatcc30<210>36<211>20<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>36tattccttaccttcaagaga20<210>37<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>37acgttggatgtccactttgagaaccccttg30<210>38<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>38acgttggatgctaggattctgctccaatgc30<210>39<211>20<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>39gggtggtcaatggtaactca20<210>40<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>40acgttggatgtatccacctatctcagtccc30<210>41<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>41acgttggatggaacaaaccaaacagactga30<210>42<211>21<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>42aaccaaacagactgaatgcaa21<210>43<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>43acgttggatggggtgtgctgagttctataa30<210>44<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>44acgttggatgaagctccttgcttcacactc30<210>45<211>21<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>45ctcctagggaagagggagata21<210>46<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>46acgttggatgatttgcgggttgcatctctc30<210>47<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>47acgttggatggggcccaatctaatcacttc30<210>48<211>22<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>48atactcacttcagcccttaaga22<210>49<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>49acgttggatgtgtcactaagcagtggcttg30<210>50<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>50acgttggatgccaatgctaaggtcttcccg30<210>51<211>22<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>51ctttcaggacagagtcttctaa22<210>52<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>52acgttggatgctacaactgcacacgtctgt30<210>53<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>53acgttggatggacagctctccaatactcag30<210>54<211>23<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>54tcatttttgaaaactggctactg23<210>55<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>55acgttggatgtccccaagctcttaggtaga30<210>56<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>56acgttggatggtgagtaaatgagtgaaggg30<210>57<211>23<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>57agtgaagggttaattctttggat23<210>58<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>58acgttggatgctgaaaccccttcccttttg30<210>59<211>30<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>59acgttggatgcaaaacgacccccaaagaac30<210>60<211>26<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>60cgtaagaatttattcttgacattatc26<210>61<211>29<212>dna<213>人工合成(homosapiens)<400>61acgttggatgggatcagaagccctaagcg29<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