一种WPRE突变体病毒载体及其应用的制作方法

文档序号：22435336发布日期：2020-10-02 10:25阅读：5112来源：国知局

本发明属于病毒载体领域，具体涉及一种wpre突变体病毒载体及其应用。

背景技术：

wpre（woodchuckhepatitisvirusposttranscriptionalregμlatoryelement）即土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，长度大约600bp，属于顺式作用元件（dna序列），由gamma，alpha，beta等三部分构成。wpre的主要功能如下：1）提高病毒的包装滴度；2）帮助检测病毒的滴度；3）同时有效帮助mrna的polya加尾效率，增强转基因的表达和稳定。虽然具体的机制仍不十分明确，但是wpre元件仍然被广泛使用在各种病毒载体中。

慢病毒（lentivirus）载体是以hiv-1（人类免疫缺陷i型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

然而现有的wpre元件对慢病毒载体的滴度的改善水平还有待提高，亟需发明一种新的wpre突变体以提高慢病毒的滴度水平。

技术实现要素：

发明人发现来源于不同毒株的wpre对慢病毒包装中的滴度有一定影响，针对于此，申请人设计并构建了一个wpre随机点突变慢病毒文库，通过文库筛选获得对慢病毒包装有明显促进作用的wpre突变体，解决了现有技术中wpre元件对慢病毒载体的滴度的改善水平低等问题。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种wpre突变体病毒载体，包括wpre突变体-03，其核苷酸序列如seqidno：3所示。

优选的，所述wpre突变体病毒载体为wpre突变体慢病毒载体或wpre突变体腺相关病毒载体。

本发明第二个方面公开了一种病毒颗粒，包含上述的载体。

本发明第三个方面公开了一种细胞，所述细胞包含上述的载体。

本发明第四个方面公开了一种构建上述的wpre突变体病毒载体的方法，采用wpre元件进行随机点突变体文库的构建，并进行筛选得到wpre突变体病毒载体；包括：

s1：制备随机突变目的片段；

s2：随机突变目的片段与能表达荧光蛋白的目的载体连接；

s3：涂平板后流式细胞仪筛选细胞；

s4：抽提筛选得到的细胞基因组，使用pcr技术扩增wpre区域；

s5：连接t载体后涂板获得克隆细胞，进行测序，得到wpre突变体病毒载体。

在本发明的一些优选实施例中，筛选得到三种wpre突变体病毒载体：wpre突变体-01、wpre突变体-02和wpre突变体-03，其核苷酸序列分别如seqidno：1、seqidno：2和seqidno：3所示。

优选的，在s1中，突变模板的核苷酸序列如seqidno：4所示；更优选的，其中，正向引物和反向引物的核苷酸序列如seqidno：5和seqidno：6所示。

优选的，在s2中，所述目的载体为pslenti-ef1a-egfp-p2a-puro-wtwpre或paav-cmv-egfp-wtwpre。

优选的，在s4中，使用pcr技术扩增wpre区域，所用的正向引物和反向引物的核苷酸序列如seqidno：7和seqidno：8所示。

本发明第五个方面公开了根据上述的wpre突变体病毒载体或上述的方法在提高病毒滴度中的应用。

本发明第六个方面公开了一种利用上述的wpre突变体病毒载体进行病毒包装的方法，包括：

（1）培养待转染细胞；

（2）制备含有上述的wpre突变体的dna-转染试剂复合体；

（3）将dna-转染试剂复合体加入到细胞培养容器中，5-7h后弃去培养基，再加入新鲜的完全培养基培养。

本发明的一些具体实施例中，步骤（2）包括：

1）将待转染的病毒载体质粒32μg（骨架质粒pcag-gagpol-tat:包膜蛋白质粒phcmv-vsvg：穿梭质粒（pslenti-ef1a-egfp-p2a-puro-wtwpre、pslenti-ef1a-egfp-p2a-puro-wpre突变体-01、pslenti-ef1a-egfp-p2a-puro-wpre突变体-02或pslenti-ef1a-egfp-p2a-puro-wpre突变体-03=2：1：3）溶于opti-mem培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5分钟；2）将转染试剂溶于opti-mem培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5分钟；3）将转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20min，使dna和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。

本发明的一些具体实施例中，步骤（3）包括：

取出细胞培养皿，将准备好的dna-转染试剂复合体加入到细胞培养皿中，放回培养箱；6h后吸去培养基，pbs洗一次，加入10ml新鲜完全培养基培养。

wpre突变体病毒载体包装病毒后滴度测定方法：

转染48小时后，第一次收毒，收集培养基至50ml离心管中，并给细胞更换新鲜的完全培养基。转染72小时后，第二次收毒，收集培养基至50ml离心管中，丢弃细胞。将收集的培养上清，用离心机3500rpm，10min，室温离心后，上清倒入新的50ml离心管；用超速离心机30,000rpm，4℃离心2h后，小心地弃去上清，离心管倒扣在灭菌过的吸水纸上，加入dpbs重悬沉淀，收集到1.5mlep管中，-80℃冰箱保存。

采用realtimepcr法测定慢病毒滴度，制备样品：按1×10⁵细胞每孔接种293t细胞于24孔板；第二天加入病毒（0.1μl、1μl和10μl），12~20h后更换新鲜培养基；感染后72h拍照记录荧光，后收取细胞抽取基因组dna并做定量pcr实验测定滴度。

优选的，所述细胞为293t细胞；优选的，所述培养基为opti-mem培养基。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：

本发明中发明人通过大量的创新性劳动，设计并构建了一个wpre随机点突变慢病毒文库，通过文库筛选发现一种新的wpre突变体病毒载体，其对慢病毒包装有明显促进作用；且该wpre突变体病毒载体构建方法简单，因此本发明的技术方案具有很大的市场经济价值。

附图说明

图1为本发明实施例中突变wpre与野生型wpre序列比对结果示意图；

图2为本发明实施例中pcr产物电泳图；

图3为本发明实施例中pslenti-ef1a-egfp-p2a-puro-wtwpre载体图谱；

图4为本发明实施例中慢病毒滴度感染荧光示意图；

图5为本发明实施例中慢病毒滴度统计结果示意图；

图6为本发明实施例中paav-cmv-egfp-wtwpre载体图谱示意图；

图7为本发明实施例中腺相关病毒滴度统计结果示意图；

图8为本发明实施例中细胞感染72h后荧光示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

实施例1

本实施例构建随机突变目的片段并筛选出效果较好的wpre突变体，包括：

1.1随机突变目的片段的制备

1.2突变模板序列如下：

tcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggc（seqidno：4）

1.3引物设计：

f---taaggatcctcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattga（seqidno：5）

r---cactgcaggcccaaagggagatccgac（seqidno：6）

1.4随机突变反应：

1.4.1随机突变体系（50μl）：

1.4.2

1.4.3pcr程序：

1.5

1.6pcr结束后，向pcr样品中加入1μldpni用以消除甲基化的模板；

1.7随后，取5μlpcr产物电泳检测条带浓度和特异性；pcr产物电泳图如图2所示；

1.8将剩余的pcr产物电泳，切胶回收目标dna片段；

1.9目的载体pslenti-ef1a-egfp-p2a-puro-wtwpre（载体图谱见图3）使用bamhi和psti酶切后回收大片段；

1.10dna片段使用bamhi和psti酶切后使用pcr产物回收试剂盒回收片段588bp片段连接入1.8中线性化的目的载体；

1.11将平板的克隆计数后，使用细胞刮刮下后收集；

1.12重复上述1.2-1.8，直到收集的克隆数达到10⁷，获得wpre突变体慢病毒质粒文库；

1.13将上述收集的菌抽提质粒后包装慢病毒,获得wpre突变体慢病毒文库.滴度为5.8×10⁸tu/ml；

1.14使用上述文库感染293t细胞(感染复数moi设置为0.5)，72小时后，收集细胞进行流式细胞仪检测，分离并富集绿色荧光亮度前5%的细胞；

1.15抽提293t细胞基因组

1.16使用pcr扩增wpre区域

f：5’tcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattga3’（seqidno：7）；

r：5’gcccaaagggagatccgac3’（seqidno：8）；

1.17连接入t载体后涂板

1.18对获得克隆进行测序

1.19筛选到多个突变体，举例其中3个突变体

wpre-突变体-01：携带5个点突变（c101g,t169a,g181c,a229g,c345a）；

wpre-突变体-02：携带6个点突变（c211a,c258g,t287a,c306g,g355a,g501a）；

wpre-突变体-03：携带4个点突变（c79g,t87a,g97c,a552g）；

2.wpre突变体慢病毒载体构建

突变体序列1（pslenti-ef1a-egfp-p2a-puro-wpre突变体-01）：

tcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatgatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttaagaggagttgtgccccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcgacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggaaaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggc（seqidno：1）

突变体序列2（pslenti-ef1a-egfp-p2a-puro-wpre突变体-02）：

tcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgaactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccagctgtcagctcctttccgggactttcgctatccccctccctattgccagggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcgactgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccacggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggc（seqidno：2）

突变体序列3（pslenti-ef1a-egfp-p2a-puro-wpre突变体-03）：

tcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggataggctgcttaaatgcctttctatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcggacgagtcggatctccctttgggc（seqidno：3）；

3.wpre突变体慢病毒载体病毒包装及滴度测定

转染前一天，将293t细胞接种到100mm培养皿中；转染前一小时取出细胞培养皿，去除原有细胞培养基，加入10ml的opti-mem培养基，将细胞放回培养箱；制备转染试剂和质粒的复合物：（1）将待转染的病毒载体质粒32μg（骨架质粒pcag-gagpol-tat：包膜蛋白质粒phcmv-vsvg：穿梭质粒(pslenti-ef1a-egfp-p2a-puro-wtwpre、pslenti-ef1a-egfp-p2a-puro-wpre突变体-01、pslenti-ef1a-egfp-p2a-puro-wpre突变体-02或pslenti-ef1a-egfp-p2a-puro-wpre突变体-03)=2：1：3）溶于opti-mem培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5分钟；（2）将转染试剂溶于opti-mem培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5分钟；（3）将转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20min，使dna和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。取出细胞培养皿，将准备好的dna-转染试剂复合体加入到细胞培养皿中，放回培养箱；6h后吸去培养基，pbs洗一次，加入10ml新鲜完全培养基培养。

采用realtimepcr法测定慢病毒滴度，制备样品：按1×10⁵细胞每孔接种293t细胞于24孔板；第二天加入病毒（0.1μl、1μl和10μl），12~20h后更换新鲜培养基；感染后72h拍照记录荧光（荧光图片见图4），后收取细胞抽取基因组dna并做定量pcr实验测定滴度。三次慢病毒滴度统计结果见图5；其中pslenti-ef1a-egfp-p2a-puro-wpre突变体-03可以提高约65%慢病毒的滴度。将pslenti-ef1a-egfp-p2a-puro-wpre突变体-03与野生型wpre序列比对结果如图1所示。

实施例2

本实施例将有效的wpre突变体在腺相关病毒载体上进行效果验证，具体如下：

一、腺相关病毒载体构建：

将检测增强效果的wpre突变体03序列构建到腺相关病毒载体，在paav-cmv-egfp-wtwpre（图谱见图6）基础上构建paav-cmv-egfp-wpre突变体-03。

使用paav-cmv-egfp-wtwpre和paav-cmv-egfp-wpre突变体-03以aav2/8作为血清型载体包装aav病毒。使用wpre引物对以上病毒进行滴度测定。并使用考马斯亮蓝染色验证。

转染前一天，将293t细胞接种到100mm培养皿中；转染前一小时取出细胞培养皿，去除原有细胞培养基，加入10ml的opti-mem培养基，将细胞放回培养箱；制备转染试剂和质粒的复合物：（1）将待转染的病毒载体质粒20μg（血清型质粒aav2/8：辅助质粒phelper：穿梭质粒paav-cmv-egfp-wtwpre或paav-cmv-egfp-wpre突变体-03=1：1.5：1）溶于opti-mem培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5分钟；（2）将转染试剂溶于opti-mem培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5分钟；（3）将转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20min，使dna和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。取出细胞培养皿，将准备好的dna-转染试剂复合体加入到细胞培养皿中，放回培养箱；6h后吸去培养基，pbs洗一次，加入10ml新鲜完全培养基培养。

转染72小时后，收集培养基至50ml离心管中，丢弃细胞。将收集的培养上清，用离心机3500rpm，10min，室温离心后，上清倒入新的50ml离心管；用密度梯度离心方法收取腺相关病毒，加入dpbs重悬沉淀，收集到1.5mlep管中，-80℃冰箱保存。

采用realtimepcr法测定腺相关病毒滴度，并使用考马斯亮蓝染色的方法检测腺相关病毒，腺相关病毒包装滴度统计结果见图7；其中paav-cmv-egfp-wpre突变体-03组可以提高约82%的腺相关病毒滴度。

按1×10⁵细胞每孔接种293t细胞于24孔板；第二天加入病毒（按照moi=5×10⁵），12~20h后更换新鲜培养基；感染后72h拍照记录荧光（荧光图片见图8），paav-cmv-egfp-wpre突变体-03组的感染荧光亮于paav-cmv-egfp-wtwpre组。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>和元生物技术(上海)股份有限公司

<120>一种wpre突变体病毒载体及其应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>576

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctcc60

ttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatgatgctattgcttcccgtat120

ggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttaagaggagttgtg180

ccccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcgacccccactgg240

ttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctat300

tgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggaaaggggctcggctgtt360

gggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgc420

ctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaa480

tccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcg540

ccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggc576

<210>2

<211>576

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctcc60

ttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtat120

ggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtg180

gcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgaactgtgtttgctgacgcaacccccactgg240

ttggggcattgccaccagctgtcagctcctttccgggactttcgctatccccctccctat300

tgccagggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcgactgtt360

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ctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaa480

tccagcggaccttccttcccacggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcg540

ccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggc576

<210>3

<211>576

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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gggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgc420

ctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaa480

tccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcg540

ccttcgccctcggacgagtcggatctccctttgggc576

<210>4

<211>576

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4