脐带间充质干细胞重编程为肝脏细胞的方法及所制备的肝脏类器官与流程

本申请涉及一种细胞培养技术，尤其涉及一种脐带间充质干细胞重编程为肝脏细胞的方法及所制备的肝脏类器官。

背景技术：

肝肿瘤通常需要进行肝脏大部分切除术，剩余肝脏将再生代偿，术后容易导致肝切除术后肝衰竭(phlf)，这是最令人担忧的并发症之一，必须通过移植和终生免疫抑制来治疗。供体肝的短缺，高成本和免疫抑制限制了这种治疗方式的使用。肝功能衰竭的治疗也可以通过临时性肝支持方法来改善。比如生物人工肝，通过血浆置换和白蛋白透析进行持续性血液透析滤过可以改善某些肝功能参数，但是尚难以证明其能提高患者生存率。而且由于缺乏安全的肝细胞来源，这项技术受到了限制。肝细胞的潜在替代来源包括猪肝细胞，永生化人类肝细胞，es细胞衍生的肝细胞和各种成人干细胞，但是仍不能解决现在人工肝治疗过程中原代肝细胞缺乏的问题。进一步地，有研究表明，间充质干细胞(mscs)或mscs来源的肝细胞样细胞移植可改善了啮齿动物或患有肝损伤的患者的肝功能。但是，迄今为止使用的几种传统方法收效甚微，这些类肝细胞样细胞仅表现出一部分标记和原代肝细胞的功能。

技术实现要素：

本申请的目的是，克服现有技术的不足，提供一种简单、容易重复，重编程效率高，可用于临床上大量获取功能性肝脏细胞的脐带间充质干细胞重编程为肝脏细胞的方法，并利用所获得的肝脏细胞制备肝脏类器官。

为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：

首先是一种脐带间充质干细胞重编程为肝脏细胞的方法，其包括以下步骤：

获取脐带间充质干细胞；

对所述脐带间充质干细胞进行预处理2d；

利用成肝诱导组合物对经过预处理的脐带间充质干细胞进行成肝诱导7d；

利用第一成熟诱导组合物对经过成肝诱导处理的脐带间充质干细胞进行第一次成熟诱导7d，获得肝脏细胞；

利用第二成熟诱导组合物对所述肝脏细胞进行第二次成熟诱导12～20d，获得功能性肝脏细胞。

优选地，所述脐带间充质干细胞进行预处理之前，体外培养至对数生长期。

进一步优选地，所述脐带间充质干细胞进行预处理之前，在无血清条件下进行体外培养。

具体地，所述预处理的试剂包括20ng/ml的表皮生长因子和10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子；

所述成肝诱导组合物包括30ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、20ng/ml的肝细胞生长因子和0.61g/l的烟酰胺；

所述第一次成熟诱导组合物包括40ng/ml的itspremix的混合剂、10ng/ml的重组人骨保护素-m和1umol/l的地塞米松；

所述第二次成熟诱导组合物包括40ng/ml的its+premix、40ng/ml的重组人骨保护素-m、1umol/l的地塞米松、10umol/l的人源γ分泌酶复合物抑制剂和10umol/l的小分子抑制剂sb431542。

光学显微镜下，所述功能性肝脏细胞为不规则圆形或多边形，核仁边界清晰。

所述功能性肝脏细胞的肝脏特异性基因表达率高于所述肝脏细胞。

具体地，所述肝脏特异性基因包括甲胎蛋白、白蛋白和细胞角蛋白。

优选地，所述功能性肝脏细胞的糖原累积功能鉴定结果为阳性。

如前所述的方法在制备肝脏类器官中的应用。

其次是一种肝脏类器官，其包括：脱细胞基质水凝胶、干细胞和肝脏细胞，所述干细胞和肝脏细胞在脱细胞基质水凝胶中分布。

具体地，所述脱细胞基质水凝胶通过脐带组织制备；所述干细胞为全能干细胞、多能干细胞或单能干细胞；所述肝脏细胞通过诱导脐带间充质干细胞分化获得，或者所述肝脏细胞来源于原代培养的肝脏细胞或传代培养的肝脏细胞系。

再次是一种肝脏类器官的制备方法，其包括以下步骤：

将脱细胞基质水凝胶稀释液、干细胞和肝脏细胞用无血清培养基混合均匀；

在培养容器中静置培养至所述脱细胞基质水凝胶凝固；

确定凝固后的所述脱细胞基质水凝胶中的细胞存活之后继续培养，获得肝脏类器官。

优选地，所述脱细胞基质水凝胶的稀释液进行混合之前调节ph到7～7.5。

具体地，所述脱细胞基质水凝胶稀释液、干细胞和肝脏细胞的混合比例为：每12ml无血清培养基中加入1×107个干细胞、1×106个肝脏细胞和3ml脱细胞基质水凝胶稀释液。

可选择地，通过染色法确定所述脱细胞基质水凝胶中的重编程肝脏细胞和正常肝脏细胞存活的情况。

进一步地，所述脱细胞基质水凝胶中的细胞存活之后，继续培养6～7d，获得肝脏类器官。

与现有技术相比较，本申请具有如下优势：

(1)本申请的脐带间充质干细胞重编程为肝脏细胞的方法，所使用的成肝诱导组合物、第一次成熟诱导组合物和第二次成熟诱导组合物仅包含因子和小分子化合物，配方简单，容易配制。

(2)本申请的脐带间充质干细胞重编程为肝脏细胞的方法，增加了第二次成熟诱导的步骤，延长了培养时间，显著提高了诱导效率，特别是所获得的功能性肝脏细胞的白蛋白表达明显上升。

(3)本申请的脐带间充质干细胞重编程为肝脏细胞的方法，在第二次成熟诱导组合物中增加了抑制剂，抑制了旁路的信号传导从而促进了间充质干细胞分化为肝细胞。

(4)本申请的肝脏类器官，使用了脐带间充质干细胞来源的细胞、脱细胞基质水凝胶，从而使得所获得的肝脏类器官具有超低免疫源性，有跨物种移植的可能性，实验已证实，人源的肝脏类器官可在大鼠体内维持和生长。

附图说明

图1为本申请所获取的脐带间充质干细胞的光学显微镜下的形态图。

图2为采用本申请的脐带间充质干细胞重编程为肝脏细胞的方法从脐带间充质干细胞分化为功能性肝脏细胞的各个阶段的光学显微镜下的形态图。

图3为本申请所获得的功能性肝脏细胞的免疫荧光表达结果图。

图4为本申请所获得的肝脏细胞和功能性肝脏细胞的肝脏特异性基因的表达量的对比图。

图5为本申请所获得的功能性肝脏细胞的糖原染色鉴定图。

图6为本申请所获得的肝脏类器官中的细胞存活情况鉴定图。

图7为本申请所获得的肝脏类器官在电学显微镜下的形态图。

图8为本申请所获得肝脏类器官移植在大鼠后的维持情况图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本申请作进一步详细描述。

实施例一

脐带间充质干细胞重编程为肝脏细胞的方法

脐带来源于人类，但通常作为医疗废弃物处理，其来源广泛，不涉及伦理问题，是临床和研究中大量获取间充质干细胞的一种优越组织来源。脐带间充质干细胞(uc-mscs)增殖活力强，已用于多种疾病的救治研究。

本申请中，将uc-mscs在无血清条件下培养到6分满，即体外培养uc-mscs至进入对数生长期，如图1所示，uc-mscs体外培养至第三代时，形态均一，呈长梭形旋窝状生长，后续对uc-mscs进行细胞表面标记鉴定和分化能力鉴定，证实所提取的uc-mscs符合后续重编程步骤的要求。

随后，开始进行诱导分化处理，在无血清培养基中依次加入如下试剂，诱导uc-mscs发生重编程：

预处理阶段：表皮细胞生长因子(egf)20ng/ml(gibco；phg0315)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)10ng/ml(peprotech；100-31-25)，预处理2d；

成肝诱导组合物：碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)30ng/ml、肝细胞生长因子(hgf)20ng/ml(peprotech；100-39-10)、烟酰胺(nicotinamide)0.61g/l(sigma；n0636)，诱导7d；

第一次成熟诱导组合物：its+premix40ng/ml(gibco；51500056)、重组人骨保护素-m(osm)10ng/ml(peprotech；300-10-2)、地塞米松(dexamethasone)1umol/l(invitrogen；d1383)，诱导7d；

第二次成熟诱导组合物：its+premix40ng/ml、重组人骨保护素-m(osm)10ng/ml、地塞米松(dexamethasone)1umol/l、人源γ分泌酶复合物抑制剂(γ-secretase抑制剂，或简称dapt)10umol/l(mce；hy-13027)、小分子抑制剂sb43154210umol/l(abcam；ab146590)，诱导12～20d。

在诱导uc-mscs的过程中对重编程的细胞进行鉴定，结果如下：

1.在倒置显微镜观察细胞形态：诱导重编程过程中细胞生长良好，经过预处理(day1-day2)和成肝诱导阶段(day3-day9)，mscs变得更加细长，肝细胞成熟阶段(day10-day16)，uc-mscs分化为肝脏细胞，细胞形态逐渐由长梭形变扁平、变圆，肝细胞二次成熟阶段(day17-day32)重编程获得的肝脏细胞进一步成熟为功能性肝脏细胞，此时，细胞转为不规则圆形或多边形，核仁明显，且未见凋亡(如图2所示)。

2.免疫荧光鉴定是否表达肝脏特异性基因：白蛋白(alb，采用abcam试剂盒：207327)、甲胎蛋白(afp，abcam试剂盒：ab169552)以及细胞角蛋白(ck19，abcam试剂盒：ab52625)，鉴定结果为afp(+)(见图3第一列图片)、alb(+)(见图3第一列图片)、ck19(+)(见图3第二列图片)。进一步地，对荧光值进行统计分析，诱导阶段的第32天与第16天相比较，即将功能性肝脏细胞和肝脏细胞进行比较，afp、alb、ck19表达率明显提高(图4)，说明重编程的肝脏细胞进一步成熟，更接近具备肝脏功能的肝脏细胞。

3.糖原累积功能测定(采用solarbio试剂盒：g285)：如图5所示，肝细胞出现了糖原的染色，糖原积累功能鉴定结果为阳性。

综上，经过预处理、成肝诱导、两次成熟诱导的过程，成功获得由uc-mscs重编程分化的功能性肝脏细胞，与现有技术相比较，增加了第二次成熟诱导的阶段，延长了肝脏细胞的诱导时间，使得诱导成功率大大提高。

实施例二

肝脏类器官及其制备方法

类器官属于三维细胞培养物，包含其代表器官的一些关键特性。类器官也是一个体外培养系统，其包括一个自我更新干细胞群，可分化为多个器官特异性的细胞类型，与对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能，从而提供一个高度生理相关系统。类器官培养已用于各种组织，包括肠道、肝脏、胰腺、肾脏、前列腺、肺、视杯以及大脑。类器官也是一种工具，其可应用在发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制、精准医疗以及药物毒性和药效试验等等。对于这些应用以及其他应用，类器官培养实现了对现有二维培养方法和动物模型系统的高信息量的互补。

肝脏类器官除了在临床肝衰移植中的用途外，它们还可以用作肝衰竭向肝再生过渡的急救桥梁，或在移植等待期间对广泛的肝切除术和暂时性维持肝脏作用起到补充作用。

利用前述的脐带间充质干细胞重编程为肝脏细胞的方法以及所获得的功能性肝脏细胞，制备肝脏类器官，具体地，肝脏类器官构建方法如下：

(1)在冰上取3ml的脐带脱细胞基质预凝胶，用300ul的10×pbs进行配平成为水凝胶；

(2)用naoh调节ph到7-7.5备用；

(3)在12ml无血清培养基中加入1×10⁷个uc-mscs，1×10⁶个肝脏细胞，3ml配平后的水凝胶，充分吹打混合均匀；

(4)取6孔板，每孔添加入2.5ml上述混合液体,培养箱中静置2-4h，待成胶后补充加入2ml无血清培养基。显微镜下观察细胞在水凝胶中的生长情况，对水凝胶中培养细胞进行有效性鉴定：培养第1d、3d、7d进行染色以鉴定细胞的存活情况。

(5)一般6-7天即可获得成型的“3d-hos”(肝脏类器官，见图7)。

其中，所述脐带脱细胞基质水凝胶从脐带组织中制备，不仅保持了相对人体的低免疫原性，也最大程度的保留了ecm内部结构的完整性，有利于干细胞和肝脏细胞在水凝胶内、甚至移植到体内之后的增殖和存活。如图6所示，水凝胶中的细胞在培养1d、3d、7d，活细胞的密度越来越高，证明细胞在水凝胶的空隙中生长良好。

所述uc-mscs也可以用其他类型的干细胞替换，从发育潜能来看，全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞都可以具备形成肝脏类器官的潜力。

所述肝脏细胞可以通过如上所述的方法诱导脐带间充质干细胞分化获得，或者所述肝脏细胞来源于原代培养的肝脏细胞或传代培养的肝脏细胞系。

上述肝脏类器官的制备过程全程使用无血清无异源培养基，符合gmp标准，所有细胞、组织取材均为人类自身，易于大量获取且不涉及医学伦理。由于mscs的免疫调节属性，脐带脱细胞ecm水凝胶具有超低免疫源性，所构建的3d-hos在不同个体间移植不会引起免疫反应，甚至可以跨物种移植，且成本低廉、来源广泛、可大规模批量生产、系统成熟容易复制，效果稳定，为将来的临床试验奠定了基础。进一步地，将所述肝脏类器官移植到大鼠体内，移植后10天解剖大鼠，可见移植物迁移至肝脏表面，3d-hos上方布满血管(图8)，表明该人源3d-hos可在大鼠体内维持和生长，不会引起免疫排斥反应。

综上所述，本申请的脐带间充质干细胞重编程为肝脏细胞的方法，增加了第二次成熟诱导的步骤，延长了培养时间，显著提高了诱导效率，特别是所获得的功能性肝脏细胞的白蛋白表达明显上升。本申请的肝脏类器官，使用了脐带间充质干细胞来源的细胞、脱细胞基质水凝胶，从而使得所获得的肝脏类器官具有超低免疫源性，有跨物种移植的可能性。

上述实施例为本申请较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的任何未背离本申请的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均包含在本申请的保护范围之内。