1.一种快速鉴定二倍体基因编辑作物t0代基因型的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)以二倍体基因编辑作物t0代的基因组dna为模板dna,在基因编辑靶标位点的上下游设计特异性引物,进行pcr扩增,将得到的pcr产物回收后纯化和第一次sanger测序;当测序结果为单一峰图,则所述基因编辑作物t0代的植株为纯合植株;当测序结果单一峰后面出现3个信号峰,则为嵌合体;单一峰后面出现2个信号峰,则为杂合体或双等位基因突变基因型;
(2)对于测序结果有杂峰或套峰的所述pcr产物进行t/a克隆,得连接产物;
(3)将所述连接产物转化感受态细胞,在lb培养基中震荡培养60min后,将菌液涂抹在含氨苄青霉素的lb平板上,培养8~12h,挑取单菌落于含氨苄青霉素的lb培养基中震荡培养8h后,进行第二次sanger测序;将测序结果用ncbiblast工具,与野生型序列进行比对;基因编辑序列为三个不同的序列,则为嵌合体;基因编辑序列为两个不同的序列,则为双等位基因突变基因型;对应的两个序列,一个为野生型,一个为突变序列,则为杂合体基因型。
2.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤(1)中在基因编辑靶标位点的下游350~500bp处设计特异性引物。
3.根据权利要求2所述方法,其特征在于,在得到所述特异性引物后,还包括利用所述特异性引物和阴性植株dna进行pcr扩增,扩增条带单一;回收和纯化pcr产物后,进行第一次sanger测序,测序结果显示无杂峰。
4.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤(1)所述pcr扩增的体系以20μl计,包括:模板dna1μl,10mmdntps0.5μl,所述特异性引物的上下游引物各0.5μl,10×extaqbuffer2μl,extaq0.1μl,加水补足至20μl。
5.根据权利要求1或4所述方法,其特征在于,步骤(1)所述pcr扩增的反应程序包括:94℃预变性2min;94℃变性30s,56℃退火50s,72℃延伸40s,35个循环;72℃延伸5min。
6.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤(1)中测序结果仅为单一峰图,判定所述基因编辑作物t0代的植株为纯合植株,包括双等位基因纯合突变或阴性植株后,还包括用ncbiblast与野生型靶位点序列进行比对,来判断纯合基因型,如果和野生型序列一致,则为纯合阴性植株;如果不一致,则为双等位基因纯合突变。
7.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤(2)中利用cv21-zerobackgroundptopo-ta/bluntcloningkit进行所述t/a克隆。
8.根据权利要求7所述方法,其特征在于,所述t/a克隆的体系以10μl计,包括:ptopo-bluntsimplevector1μl,pcr产物1μl,10×enhancer1μl和灭菌水7μl。
9.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤(3)所述含氨苄青霉素的lb平板和含氨苄青霉素的lb培养基中氨苄青霉素的浓度均为100μg/ml。
10.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤(3)所述震荡培养和培养的温度均为37℃。