一种广藿香醇生产酵母菌株及其构建方法和应用与流程

本发明涉及基因工程及代谢工程领域，更具体地涉及一种广藿香醇生产酵母菌株及其构建方法和应用。

背景技术：

广藿香醇是一类三环倍半萜，是存在于广藿香油的活性组分，是一类具有重要经济和药用价值的天然化合物，在药理方面已被发现消炎，维持神经活性、抗病毒，甚至还存在潜在的抗癌效果。此外，由于其具有非比寻常的定香效果，目前主要以香料的形式使用，在日用品及化妆品的调香中广泛使用，全世界范围内对广藿香精油的年需求有万吨级别的程度。广藿香醇目前主要通过传统的农业方法和蒸汽蒸馏生产。例如，可以从100公斤干燥的广藿香叶中提取2.2–2.8公斤的广藿香油。不幸的是，该过程耗时耗力且需要煤油。此外，根据地理位置和气候条件，使用植物作为生产倍半萜的来源受制于其缓慢的生长和组成成分的差异。而且生产是在设备不符合欧洲标准且监管监督较少的小型公司中进行的。现阶段已经报道了使用重组微生物细胞以更少的时间和能量消耗生产倍半萜的一些研究。因此通过基因工程和代谢工程的手段改造酵母菌株以提高广藿香醇的产量，具有重要的意义和实际的应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种广藿香醇生产酵母菌株及其构建方法和应用，从而解决现有技术中广藿香醇制备方法落后，产量低下的问题。

为了解决上述问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种广藿香醇生产酵母菌株的构建方法，以酿酒酵母菌株为出发菌，在所述出发菌中多拷贝整合erg20和pts的融合酶fpts，即可获得一种广藿香醇生产酵母菌株，其中，所述融合酶fpts的核苷酸序列如seqidno:1所示。

根据本发明的一个优选方案，进一步地，还包括在所述出发菌中进行基因rox1、yjl064w或ypl062w的单独敲除或上述三种基因的任意组合敲除，所述基因rox1的核苷酸序列如seqidno:7所示，所述基因

yjl064w的核苷酸序列如seqidno:8所示，所述基因ypl062w的核苷酸序列如seqidno:9所示。

可以理解的是，基因rox1，yjl064w，ypl062w的单独敲除方案包括分别敲除rox1，yjl064w，ypl062w的3种菌株，基因rox1，yjl064w，ypl062w的组合敲除方案包括同时敲除rox1+ypl062w，rox1+yjl064w，ypl062w+yjl064w及rox1+ypl062w+yjl064w的4种菌株。其中，当rox1，ypl062w，yjl064w三种基因同时敲除时获得基因工程菌的广藿香醇产量相比未敲除菌株的产量得到最大幅提高。

根据本发明的另一优选方案，进一步地，还包括在所述出发菌中过表达基因erg11和ctt1，所述基因erg11的核苷酸序列如seqidno:3所示，所述基因ctt1的核苷酸序列如seqidno:5所示。其中，erg11和ctt1的强化均被本发明证实有利于广藿香醇的合成。

本领域的技术人员应当理解，本发明所采用的出发菌可以是酿酒酵母菌株by4741，也可以是经过基因改造后能合成丰富fpp前体的酵母菌株。本发明作为举例而非限制地，采用的出发菌是以酿酒酵母菌by4741为出发菌株改造的酿酒酵母菌株rel003，所述改造包括过表达upc2-1，thmg，以及以hxt1启动子替换菌株本身erg9启动子。具体见参考文献[ma,b.,liu,m.,li,z.h.,tao,x.,wei,d.z.,&wang,f.q.(2019).significantlyenhancedproductionofpatchoulolinmetabolicallyengineeredsaccharomycescerevisiae.journalofagriculturalandfoodchemistry,67,8590–8598.]。

根据本发明的优选方案，在所述出发菌中融合酶fpts的多拷贝整合包括1拷贝～7拷贝，其中最优选为7拷贝。因为随着融合酶fpts的拷贝数从1不断增加到7的过程中，广藿香醇的产量随拷贝数的增加也是逐级递增的。

根据本发明，所述融合酶fpts中的pts为植物广藿香来源，erg20为前体fpp合酶，所述的erg20和pts融合后的酶fpts的密码子优化后的核苷酸序列及氨基酸序列为seqidno:1和seqidno:2。具体参考文献[ma,b.,liu,m.,li,z.h.,tao,x.,wei,d.z.,&wang,f.q.(2019).significantlyenhancedproductionofpatchoulolinmetabolicallyengineeredsaccharomycescerevisiae.journalofagriculturalandfoodchemistry,67,8590–8598.]。

根据本发明，所述基因rox1，yjl064w，ypl062w，erg11和ctt1均为酵母本身来源。

根据本发明的第二方面，提供一种根据上面所述的构建方法构建的广藿香醇生产酵母菌株。

根据本发明的一个优选方案，所述广藿香醇生产酵母菌株是一种同时多拷贝整合基因erg20(前体fpp合酶)和pts(广藿香醇合酶)融合酶(fpts)的整合，缺失3个基因rox1，yjl064w和ypl062w及强化麦角甾醇合成路径相关基因erg11及过氧化氢酶ctt1的酿酒酵母。这些基因改造使得酿酒酵母生产广藿香醇的能力得到大幅提高。

根据本发明的第三方面，还提供一种上述广藿香醇生产酵母菌株在广藿香醇生产中的应用，将所述广藿香醇生产酵母菌株在发酵罐中进行发酵，即可高产量制备广藿香醇。

根据本发明的一个优选实施方案，本发明的广藿香醇生产酵母菌株的构建方法如下，包括步骤：1)对出发菌株进行基因erg20和pts融合酶(fpts)的多拷贝整合；2)对rox1，yjl064w和ypl062w这3个基因的缺失；3)对麦角甾醇合成路径相关基因erg11过表达；4)对过氧化氢酶ctt1进行过表达。

但是应当理解的是，本发明实际并不仅限于上述优选实施方案，因为当对出发菌株仅仅进行基因erg20和pts融合酶(fpts)的多拷贝整合时，已经证实该基因工程菌对广藿香醇的产量已经有了明显提高(参见实施例2.3)；而当进一步进行rox1，yjl064w和ypl062w这3个基因的缺失时，已经证实该基因工程菌对广藿香醇的产量又有了进一步提高(参见实施例2.4)；当进一步erg11强化和ctt1强化时，证实该基因工程菌对广藿香醇的产量又有了更进一步的提高(参见实施例2.5)。

本领域的技术人员还应当理解的时，rox1，yjl064w和ypl062w可以通过在各个基因中缺失，插入和替换一个或多个碱基实现，使得基因yjl064w，rox1和ypl062w丧失功能，基因fpts，erg11，ctt1的过表达是通过crisper/cas技术及酵母本身的同源重组实现的。

本发明还提供一种酵母整合菌株的构建方法，包括如下步骤，对应基因(fpts，erg11，ctt1)的高表达质粒的构建；对应插入位点的grna质粒的构建；cas9表达质粒的引入；对应插入位点同源臂的扩增。

具体的，高表达质粒选用常用的酵母高表达质粒pesc-ura(addgene)；cas9的质粒为p414-tef1p-cas9-cyc1t(addgene)；grna质粒p426-snr52p-grna.can1.y-sup4t(addgene)。

将所用的质粒及片段转入酵母菌株中，采用化学转化法(采用试剂盒thefrozen-ezyeasttransformationiikit；zymoresearch,usa)。

为提高转化效率，先将对应质粒在大肠杆菌中表达，再将提取的质粒转化到酵母菌株中，控制加入量(质粒为100ng,片段为1200ng)和孵育时间(纯质粒1h，片段为2-3h)。

根据本发明的一个优选方案，通过发酵多拷贝整合融合酶fpts，敲除基因rox1，yjl064w和ypl062w，以及过表达erg11和ctt1的生产菌株，能够实现广藿香醇的高产量制备。

综上所述，本发明通过提供一种广藿香醇生产酵母菌株的构建方法，特别是基因erg20(前体fpp合酶)和pts(广藿香醇合酶)融合酶fpts的多拷贝整合，以及基因rox1，ypl062w，yjl064w的敲除，基因erg11(固醇14-脱甲基酶)和ctt1(过氧化氢酶)的强化，实现了广藿香醇的高产量制备。本发明通过构建这样一种酿酒酵母基因工程菌，将其用于制备广藿香醇，提高了广藿香醇的生产效率以及生产产量，降低其生产成本。

根据本发明所提供的方法，通过融合酶fpts拷贝数的增加提高广藿香醇合酶的表达量，特别是七个拷贝的基因工程菌相比单个拷贝的基因工程菌的广藿香醇产量提高了5.4倍，继续敲除基因rox1，yjl064w和ypl062w获得的基因工程菌相比不敲除的基因工程菌的广藿香醇产量则提高了3.5倍，继续强化erg11和ctt1获得的基因工程菌相比不强化的基因工程菌的广藿香醇产量提高了25.5％。根据本发明所构建的广藿香醇生产酵母菌株，通过上罐发酵使广藿香醇的产量高达1077.4mg/l，弥补了现有广藿香醇制备方法产量不足的缺陷，有望满足当前市场对广藿香醇的巨大需求，因此本发明具有重要的意义和实际应用价值。

附图说明

图1示出了erg11表达框质粒pesc-ura-erg11质粒图谱；

图2示出了ctt1表达框质粒pesc-ura-ctt1质粒图谱；

图3示出了fpts表达框质粒pesc-ura-fpts质粒图谱；

图4示出了grna质粒p426-snr52p-grna.can1.y-sup4t质粒图谱；

图5示出了单拷贝整合菌株pt01，质粒形式的菌株pt0p，及7拷贝菌株pt07的广藿香醇发酵产量；

图6示出了7拷贝菌株及rox1，yjl064w，ypl062w这3个基因单独敲除及组合敲除生产菌株的产量图；

图7示出了组合敲除菌株，及erg11强化和ctt1强化的生产菌株的产量图；

图8示出了最终菌株上罐补料速率；

图9示出了最终菌株上罐的产量图。

具体实施方式

为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的条件进行。引物为上海睿勉生物有限公司合成。

为更好的理解本发明的内容，以酵母菌中的一株以酿酒酵母by4741(市售)为出发菌株改造后的酿酒酵母菌株rel003(以by4741为出发菌株过表达upc2-1，thmg，以hxt1的启动子替换菌株本身erg9的启动子，ma,b.,liu,m.,li,z.h.,tao,x.,wei,d.z.,&wang,f.q.(2019).

significantlyenhancedproductionofpatchoulolinmetabolicallyengineeredsaccharomycescerevisiae.journalofagriculturalandfoodchemistry,67,8590–8598.)为具体实施例作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

实施例1fpts/ctt1/erg11整合元件及rox1，yjl064w，ypl062w敲除元件的获取

1.1fpts，erg11，ctt1表达质粒的构建

由ruimianbio(中国上海)进行密码子优化后合成了广藿香醇合酶基因(pts，genbankid：ay508730)，seqidno:1。pesc-ura-fpts(图3)具体构建过程为以引物seqidno:19，20和酵母菌株by4741为模板，通过酶kodone(toyobo，kfx-101)扩增得到erg20片段，以合成的基因pts为模板seqidno:21，22扩增得到pts片段，以上述2个片段为模板(1：1)，引物seqidno:19，22扩增得到fpts，通过ecori和bglii双酶切质粒pesc-ura(addgene)，将片段与质粒骨架进行无缝克隆(来源vazyme，c113-01)，转化到大肠杆菌，选取克隆测序，结果正确即为pesc-ura-fpts，参考于文献(ma,b.,liu,m.,li,z.h.,tao,x.,wei,d.z.,&wang,f.q.(2019).significantlyenhancedproductionofpatchoulolinmetabolicallyengineeredsaccharomycescerevisiae.journalofagriculturalandfoodchemistry,67,8590–8598.)。

使用引物seqidno:23和引物seqidno:24及引物seqidno:25和引物seqidno:26，直接以酵母菌株by4741为模板，通过酶kodone(toyobo，kfx-101)扩增得到基因片段ctt1和erg11，通过bamhi和xhoi双酶切质粒pesc-ura，将片段与质粒骨架进行无缝克隆(来源vazyme，c113-01)，转化到大肠杆菌，选取克隆测序，结果正确即为

pesc-ura-erg11和pesc-ura-ctt1(图1，2)。引物seqidno:27和seqidno:28以pesc-ura-fpts为模板扩增得到fpts，同样用bamhi和xhoi双酶切质粒pesc-ura-fpts及片段，进行t4连接，转化到大肠杆菌，选取克隆测序，结果正确即为pesc-ura-2fpts。

1.2各位点grna质粒的构建

在网站http://crispr.dbcls.jp/中输入所要插入的位点gre3，ho，1622，1014，1021，911，rox1，yjl064w和ypl062w所在的片段，得到所需的crrna信息(20bp)(seqidno:10-18)。以这20bp设计引物，以p414-tef1p-cas9-cyc1t为模板(addgene)，扩增转化验证得到grna质粒(图4)。以gre3位点为例，引物seqidno:29和引物seqidno:30，以p414-tef1p-cas9-cyc1t(addgene)为模板，扩增为片段转化大肠杆菌，验证得到grna质粒。其他位点(ho，1622，1014，1021，911)的20bp碱基序列见seqidno:10-18。其他位点设计引物时改变上述引物seqidno:29和30对应互补的20bp碱基序列即可，ho位点(引物seqidno:31-32)，1622位点(引物seqidno:33-34)，1014(引物seqidno:35-36)1021(引物seqidno:37-38)，911(引物seqidno:39-40)，rox1位点(引物seqidno:41-42)，yjl064w位点(引物seqidno:43-44)和ypl062w位点(引物seqidno:45-46)来得到上下游同源臂。位点的选择不仅仅局限于这些，包括其他报道的酿酒酵母常规的整合位点也可。

1.3对应位点上下游同源臂，及整合片段的构建

上下游同源臂的获得，以酵母s288c(atcc:204508)的基因组为模板，引物seqidno:47和48扩增上游同源臂，引物seqidno:51和52扩增下游同源臂。引物seqidno:49和50以pesc-ura-fpts为模板得到表达框fpts。其他位点类似地使用对应引物ho(引物seqidno:53，54，57，58)，1622(引物seqidno:59，60，63，64)，1014(引物seqidno:65，66，69，70)1021(引物seqidno:71，72，75，76)，911(引物seqidno:77，78，81，82)来得到上下游同源臂，ho(引物seqidno:55-56)，1622(引物seqidno:61-62)，1014(引物seqidno:67-68)位点以pesc-ura-2fpts为模板扩增片段2个fpts基因表达框；1021(引物seqidno:73-74)位点以pesc-ura-erg11为模板扩增片段erg11表达框；911(引物seqidno:80-81)位点以pesc-ura-ctt1为模板扩增片段ctt1表达框。rox1，yjl064w，ypl062w的同源臂使用的引物为seqidno:83-94。

1.4各生产菌株的构建

通过化学转化法(采用试剂盒thefrozen-ezyeasttransformationiikit；zymoresearch,usa)，在rel003(ma,b.,liu,m.,li,z.h.,tao,x.,wei,d.z.,&wang,f.q.(2019).significantlyenhancedproductionofpatchoulolinmetabolicallyengineeredsaccharomycescerevisiae.journalofagriculturalandfoodchemistry,67,8590–8598.)中加入gre3的上下游同源臂，fpts表达框，gre3位点的grna质粒(具体片段的构建见实施例1.2，1.3得到的grna和扩增的元件)，转化用leu/ura缺陷型的平板筛选，验证测序对的菌株得到的即为1个fpts拷贝的菌株(产量见图4)，继续消除grna(使用5foa)以便之后多拷贝的菌株的构建。以1个fpts拷贝的菌株为底盘，使用ho位点的同源臂，对应的ho位点的grna质粒及实施例1.3中提到的2个fpts基因表达框(具体片段的构建见实施例1.2，1.3得到的grna和扩增的元件)得到3个fpts拷贝菌株。同理5拷贝的菌株则选择1622位点，使用1622位点的同源臂，对应的1622位点的grna质粒及2个fpts基因表达框(具体片段的构建见实施例1.2，1.3得到的grna和扩增的元件)为5拷贝菌株，同理7拷贝的菌株则选择1041位点，使用1041位点的同源臂，对应的1041位点的grna质粒及2个fpts基因表达框(具体片段的构建见实施例1.2，1.3得到的grna和扩增的元件)为7拷贝菌株。同理在前一个菌株7拷贝菌株基础上选择rox1，yjl064w，ypl062w的grna及同源臂(具体片段的构建见实施例1.2，1.3得到的grna和扩增的元件)得到3个单敲菌株(包括分别敲除rox1,ypl062w,yjl064w的三种菌株)及四种组合敲除(包括同时敲除

rox1+ypl062w,rox1+yjl064w,ypl062w+yjl064w及

rox1+ypl062w+yjl064w的四种菌株)。以组合敲除

rox1+ypl062w+yjl064w菌株(也称3敲菌株)为底盘，1021位点及要整合到该位点的片段erg11(实施例1.2及1.3所提及的grna质粒和同源臂及表达框片段)，得到菌株强化erg11的酵母菌株。再在强化erg11的酵母菌株的基础上选择911位点grna，同源臂及整合到该位点的片段ctt1(1.2及1.3所提及的grna质粒和同源臂及表达框片段)，得到强化erg11和ctt1的菌株。

实施例2酵母菌株发酵生产广藿香醇

2.1酵母菌株的摇瓶及上罐发酵

从对应固体培养基上挑取培育3天左右大小的单菌落在5mlypd试管中30℃活化24h，转接到种子培养基20mlypd的250ml锥形瓶中初始od600为0.3，12-14h。将培养好的种子培养基中的菌液转接到50mlypd发酵培养基中同样初始od600为0.3，培养7天，选择合适的时间取样广藿香醇的产量。

ypd:葡萄糖20g/l,yeastextract10g/l,peptone20g/l

从sd-leu固体培养基上挑一个菌落转接在5ml的试管中培养20-24h，将其转接至50mlypd的种子培养基(初始浓度为od600＝0.03)培养12-14h后，将其转接到3瓶100mlypd的250ml锥形瓶中，同样初始od600为0.03。待其生长20h后，准备好发酵罐(百仑罐)。首先使用饱和亚硫酸钠校准溶氧电极的零点，ph4和ph7的标准液校准ph电极。在罐中加入2.5ml的培养基(不含葡萄糖)，装好电极和补料瓶，115℃灭菌20min。待灭完菌之后，装载在操作台上连接在线监测装置，同时在超净台把另外灭菌的葡萄糖加入到补料瓶中，晃动混匀。首先控制进气量为1vvm，搅拌速率为200r/min，在接种口点火接种(3瓶菌液300ml，还有单独灭菌的葡萄糖)，此时进行溶氧电极的满点(100％)校准，待罐中的溶氧降到40％时，将进气量修改到2vvm，同时将桨叶的速率与溶氧进行自动关联，调整为200r/min-800r/min之间，同时使用氨水来控制ph在5.5到6之间，之后设定补料速率(图8)即可，中间前期每3-6h取一次，后面可以改为6-9h取一次样。

微量元素溶液：15g/ledta，10.2g/lznso4·7h2o，0.5g/lmncl2·4h2o，0.5g/lcuso4，0.86g/lcocl2·6h2o，0.56g/lna2moo4·2h2o，3.84g/lcacl2·2h2o，5.12g/lfeso4·7h2o。

维生素溶液：0.05g/l生物素，1g/l泛酸钙，1g/l烟酸，25g/l肌醇，1g/l盐酸硫胺素，1g/l吡哆醇，0.2g/l对氨基苯甲酸。(过滤除菌)

5l发酵罐中的培养基(3l)：葡萄糖75g，酵母提取物30g，蛋白胨60g，leu/ura/met/his各3g，1.8g无水mgso4，30ml微量元素溶液，36ml维生素溶液(其中葡萄糖单独灭菌115℃20min)。

补料(1.5l)：750g葡萄糖，15g酵母提取物，30g蛋白胨，15ml微量元素溶液，18ml维生素溶液，1.5gleu/ura/met/his，0.9g无水mgso4(其中葡萄糖单独灭菌115℃20min)。

25％的氨水用来调ph。

2.2发酵产物的gc分析

从发酵液中取出600μl与等体积的乙酸乙酯混合，同时在破碎管中加入1.5-2g的研磨珠，将乙酸乙酯和菌液加入破碎管中，涡旋振荡，使用冷冻研磨仪进行细胞破碎。

破碎程序：振荡时间10min，振荡速度300hz，循环次数3次。

将破碎完的破碎管12000rpm离心10min，溶液处于分层状态(若未分层，则重新振荡破碎)，吸取有机层的萃取液500-600μl至ep管中，同时加入无水硫酸钠。漩涡混匀3min除水，12000rpm离心10min，吸取500μl液体至液相小瓶进行gc检测产物含量。

气相检测条件：

色谱柱：hp-5(30mx0.32mm，0.25μm，美国安捷伦公司)；进样口温度250℃；程序升温：柱温起始温度80℃持续1min，继而升至120℃

(10℃/min)维持0min，随后升至150℃(3℃/min)同样维持0min，最后升至270℃(30℃/min)，保持1min；氢火焰离子化检测器(fid)温度：300℃；不分流；空气流量：400ml/min；氢气流量：30ml/min；尾吹n2气流量：15ml/min；平均线速度：31.275cm/s；压力：14.54psi；进样量：1μl。

2.3多拷贝菌株的发酵结果

rel003(以by4741为出发菌株过表达upc2-1，thmg，以hxt1的启动子替换菌株本身erg9的启动子获得，参见ma,b.,liu,m.,li,z.h.,tao,x.,wei,d.z.,&wang,f.q.(2019).significantlyenhancedproductionofpatchoulolinmetabolicallyengineeredsaccharomycescerevisiae.journalofagriculturalandfoodchemistry,67,8590–8598.)的基础上不断增加fpts的拷贝数的策略是有效的，当融合酶fpts的拷贝数从1不断增加到7的过程中，产量随拷贝数的增加也是逐级递增的，其中当整合5个拷贝的融合酶fpts的时候，其产量几乎与质粒形式表达的产量持平，达到21.1mg/l，7拷贝达到24.7mg/l是单拷贝的5.4倍(图5)。

2.4rox1，yjl064w，ypl062w敲除菌株的发酵结果

当在含有2％葡萄糖的ypd培养基中培养(发酵操作如实施例2.1所示)时，敲除rox1或ypl062w使广藿香醇的产量增加到1.5倍(图6)。而yjl064w的单独敲除对广藿香醇的产量影响更大，达到了2倍。三个基因敲除菌株ptr66最高提高了3.5倍，达到102.2mg/l(图6)。

2.5erg11强化和ctt1强化的生产菌株的发酵结果

发酵培养的具体操作见实施例2.1所示，发现erg11和ctt1强化菌株相比于对照菌株ptr66都有一定幅度的提高。出发菌株ptr66达到102.2mg/l，erg11强化的菌株达到114.5mg/l，erg11和ctt1强化的菌株达到128.7mg/l，表明erg11和ctt1的强化都是有利于广藿香醇的合成的(图7)。

2.6上罐发酵

上罐发酵的具体操作见实施例2.1所示，通过上罐发酵产量可以达到1077.4mg/l(图9)。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

sequencelisting

<110>华东理工大学

<120>一种广藿香醇生产酵母菌株及其构建方法和应用

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<213>酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)

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