鉴别柿树性别的分子标记引物及鉴别方法与流程

本发明涉及分子鉴别
技术领域：
。具体地说是鉴别柿树性别的分子标记引物及鉴别方法。
背景技术：
：柿(diospyroskakithunb.)为柿科(ebenaceae)柿属(diospyros)植物，是原产我国的、重要的木本粮食树种。柿果实营养丰富，可溶性固形物和单宁含量高，叶片富含vc、黄酮、多酚等活性成分，在食品、保健、化工和医药等领域的开发价值和应用潜力越来越受到重视，对柿育种和栽培技术的研究可为精准扶贫、农业综合体建设及国家粮食安全等方面提供强有力的科技支撑。值得注意的是，柿栽培品种绝大部分为完全雌株(只开雌花)和雌雄同株(雌花和雄花同株)，柿野生资源中存有完全雄株(只开雄花)。此外，柿从种子播种到实生苗首次开花结果通常需要5-8年的时间。柿童期长的特点严重限制了具有优良性状杂交子代雌株的早期筛选的同时，在育苗及种植管理过程中也花费了大量的人力、物力和财力，降低了柿良种培育的工作效率。因此，有必要开发高效稳定的性别分子标记，在育苗阶段对柿种苗性别进行早期鉴定，对于加速育种进程及育苗成本控制具有重要意义。技术实现要素：为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种鉴别柿树性别的分子标记引物及鉴别方法，利用分子标记引物在育苗阶段对柿树的性别进行早期鉴定，对于提高柿杂交子代雌株的早期选择效率及降低杂种圃的管理成本具有重要意义。为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：鉴别柿树性别的分子标记引物，包括正向引物和反向引物，其序列分别为序列表中seqidno.1和seqidno.2的核苷酸序列。鉴别柿树性别的方法，包括如下步骤：(1)提取柿树叶片dna；(2)利用权利要求1所述的正向引物和反向引物对所提取的dna进行pcr扩增；(3)pcr扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行分离并拍照；(4)根据电泳图中的条带情况对柿树进行性别鉴定。上述鉴别柿树性别的方法，在步骤(1)中：(1-1)用电子天平迅速称取约0.5g的柿树幼嫩叶片于研钵中，利用液氮将样品充分研磨成粉末后，快速转入盛有预热至65℃的800μl2×溴化十六烷基三甲铵ctab缓冲液的2ml离心管中，65℃水浴提取30min；(1-2)加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿和异戊醇体积比为24：1，涡旋混匀后在12000rpm的转速下离心10min，将上清液转入新的离心管，再次加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，涡旋混匀后在12000rpm的转速下离心10min；取上清液于新的离心管后，加入2倍体积且预冷至-20℃的乙醇，缓慢摇匀至dna絮状沉淀析出；(1-3)10000rpm离心10min，倒去上清液；用体积分数为70％的乙醇清洗沉淀物2-3次；室温放置5min使沉淀物自然风干后，加入预热至65℃的50μl的ddh2o，即得到柿基因组dna；(1-4)利用1.0％琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度计法检测dna样品的纯度和浓度，样品检测合格后置于-20℃冰箱保存备用。上述鉴别柿树性别的方法，在步骤(2)中，pcr扩增的程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，重复循环30次；72℃延伸5min。上述鉴别柿树性别的方法，在步骤(2)中，pcr扩增的体系为：taqdna聚合酶12.5μl；10μm上游引物1μl；10μm下游引物1μl；模板dna1μl；加入ddh2o补齐到25μl。上述鉴别柿树性别的方法，在步骤(3)中，pcr扩增产物用1.0wt％的琼脂糖凝胶电泳检测；电泳条件为150v、400ma，电泳时间为20min。上述鉴别柿树性别的方法，电泳凝胶上268bp处显示1条条带的为开雄花的完全雄株或雌雄同株，无条带的为不开雄花的完全雌株。本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：杂交育种是进行种质创新和良种培育的重要手段。柿单株类型多样化，常见的为完全雌株和雌雄同株，少数为完全雄株。此外，柿从种子播种到实生苗首次开花结果通常需要5-8年的时间。柿花性复杂且其童期长的特点严重限制了杂交子代雌、雄个体的筛选，该现状不利于杂种圃管理的同时，进一步降低了通过杂交育种筛选具有优良性状子代，从而进行种质创新和良种培育的工作效率。本发明采用分子标记技术鉴别柿树性别，先提取柿树dna，再用本发明提供的分子标记进行pcr扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离并拍照，即可根据目的条带的有无鉴别出柿种质是否开雄花。可以在育苗阶段将开雄花的种苗(包括雌雄同株和完全雄株)分离出来，鉴定结果的准确率大于94％，无需等到5-8年柿树开花后再剔除杂交个体中的雄性种质，能够在育苗阶段对柿杂交子代的性别进行早期鉴定，从而尽早淘汰雄株，筛选出具有优良性状杂交子代雌株，从而提高柿杂交子代的早期选择效率，降低育种成本，有利于杂交育种工作的顺利开展，推动育种和产业发展，及推动柿产业的顺利发展。附图说明图1对柿树36个完全雌株个体进行检测的pcr扩增电泳图；图2对柿树33个完全雄株个体进行检测的pcr扩增电泳图；图3对柿树17个雌雄同株个体进行检测的pcr扩增电泳图。具体实施方式本实施例的鉴别柿树性别的方法为：(1)提取柿树叶片dna；(1-1)用电子天平迅速称取约0.5g的柿树幼嫩叶片于研钵中，利用液氮将样品充分研磨成粉末后，快速转入盛有预热至65℃的800μl2×溴化十六烷基三甲铵ctab缓冲液的2ml离心管中，65℃水浴提取30min；(1-2)加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿和异戊醇体积比为24：1，涡旋混匀后在12000rpm的转速下离心10min，将上清液转入新的离心管，再次加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，涡旋混匀后在12000rpm的转速下离心10min；取上清液于新的离心管后，加入2倍体积且预冷至-20℃的乙醇，缓慢摇匀至dna絮状沉淀析出；(1-3)10000rpm离心10min，倒去上清液；用体积分数为70％的乙醇清洗沉淀物2-3次；室温放置5min使沉淀物自然风干后，加入预热至65℃的50μl的ddh2o，即得到柿基因组dna；(1-4)利用1.0％琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度计法检测dna样品的纯度和浓度，样品检测合格后置于-20℃冰箱保存备用。(2)利用正向引物和反向引物对所提取的dna进行pcr扩增；用于鉴别柿树性别的分子标记引物，其中正向引物序列为：tttatcacaactgcccaggg(5'-3')，反向引物序列为：tgtgataaattttttttttttattattatgctccaac(5'-3')，分别为序列表中seqidno.1和seqidno.2的核苷酸序列。pcr扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，重复循环30次；72℃延伸5min。pcr扩增体系为：taqdna聚合酶12.5μl浓度为1μm的上游引物1μl浓度为1μm的下游引物1μl模板dna1μlddh2o9.5μl(3)pcr扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行分离并拍照；pcr扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测；电泳条件为150v、400ma，电泳时间为20min。(4)根据电泳图中的条带情况对柿树进行性别鉴定。电泳凝胶上268bp处显示1条条带的为开雄花的完全雄株或雌雄同株，无条带的为不开雄花的完全雌株。为了证明鉴别方法的鉴别效果，分别采用已经开花或结果的成年柿完全雌株36份、完全雄株33份、雌雄同株17份验证鉴别效果。实验材料：已经开花或结果的成年柿完全雌株36份、完全雄株33份、雌雄同株17份。实验方法：采用上述的鉴别柿树性别的方法(提取叶片dna，进行pcr扩增后用琼脂糖凝胶电泳分离并拍照)。实验结果：根据电泳图中的条带情况(如图1-图3)对柿树的性别进行鉴定。结果如表1所示：表1柿树性别的鉴定结果结果表明，该方法鉴定结果的准确率大于94％；由此推测，本发明可以通过dna准确鉴别柿树的性别。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。序列表<110>国家林业和草原局泡桐研究开发中心<120>鉴别柿树性别的分子标记引物及鉴别方法<141>2020-09-23<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tttatcacaactgcccaggg20<210>2<211>37<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tgtgataaattttttttttttattattatgctccaac37当前第1页12