与花生含油量主效QTL位点连锁的分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及与花生含油量主效qtl位点连锁的分子标记及其应用。

背景技术：

花生(arachishypogeal.)是重要的经济作物之一。花生种子含有丰富的油脂、蛋白质、维生素和其他优异的矿质元素，可以用作榨油、花生酱、坚果点心或者鲜食。但花生油需求大，需要进一步提高花生油的产量，来保障供给。花生含油量是构成花生油产量的关键品质性状之一，如何快速、准确的培育高含油量花生品种是花生遗传改良研究的重要方向。

花生资源中含油量表型的变异一般在42％-55％之间，少数高含油量的材料可达到60％以上，具有较大的遗传改良潜力。然而含油量是复杂的数量性状，容易受到环境的影响，通过常规方法测定含油量表型，筛选优异材料的效果不好、准确性差、效率较低。随着分子遗传学的发展，通过开发全基因组高密度的分子标记，结合表型数据，利用连锁分析方法可以在基因组上定位到多个控制目标农艺性状的qtl位点。通过qtl紧密连锁的标记对表型性状进行选择，可以提高目标性状的育种效率。

目前检测到的花生含油量qtl数目相对较少，qtl效应值偏低，在不同环境表达的稳定性未知，在花生高油育种中应用有限。因此，有必要进行进一步开发研究。

技术实现要素：

本发明提供两个花生含油量主效稳定的qtl位点qocb06和qocb10.1及其连锁的标记，可用于高油花生材料的分子标记辅助选择。

具体地，本发明提供如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种与花生含油量主效qtl位点连锁的分子标记，所述分子标记为ai06b29452或aggs2133-1；

分子标记ai06b29452与qtl位点qocb06连锁，所述分子标记ai06b29452能够通过如seqidno.1-2所示的引物对扩增得到；

分子标记aggs2133-1与qtl位点qocb10.1连锁，所述分子标记aggs2133-1能够通过如seqidno.3-4所示的引物对扩增得到。

第二方面，本发明提供与花生含油量主效qtl位点连锁的分子标记组合，所述分子标记组合包括ai06b29452和aggs2133-1，分子标记ai06b29452和分子标记aggs2133-1如上所述。

第三方面，本发明提供用于扩增上述分子标记或分子标记组合的引物。

本发明的引物包括如seqidno.1-2和/或seqidno.3-4所示的序列。

第四方面，本发明提供含有上述引物的试剂或试剂盒。

第五方面，本发明提供上述分子标记或分子标记组合或引物或试剂或试剂盒的以下任一应用：

(1)在鉴定花生含油量性状表型中的应用；

(2)在花生种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；

(3)在花生含油量性状早期预测中的应用；

(4)在筛选或创制花生含油量性状不同的花生中的应用；

(5)在花生含油量基因分型中的应用。

第六方面，本发明提供鉴定花生含油量性状表型的方法，其包括：

(1)提取待鉴定花生的dna；

(2)以dna为模板，利用seqidno.1-2或seqidno.3-4所示引物进行pcr扩增；

(3)根据pcr扩增产物中dna片段的大小判断待鉴定花生含油量性状表型。

其中，步骤(3)中判断待鉴定花生含油量性状表型的方法如下：

当利用seqidno.1-2所示引物进行pcr扩增后，产物中dna片段的大小为222bp时，判断待鉴定花生具有高含油量；当利用seqidno.3-4所示引物进行pcr扩增后，产物中dna片段的大小为203bp时，判断待鉴定花生具有高含油量。

第七方面，本发明提供鉴定花生含油量性状表型的另一种方法，其包括：

(1)提取待鉴定花生的dna；

(2)以dna为模板，分别利用seqidno.1-2和seqidno.3-4所示引物进行pcr扩增；

(3)根据pcr扩增产物中dna片段的大小判断待鉴定花生含油量性状表型。

其中，步骤(3)中判断待鉴定花生含油量性状表型的方法如下：

当利用seqidno.1-2所示引物进行pcr扩增后，产物中dna片段的大小为222bp，且当利用seqidno.3-4所示引物进行pcr扩增后，产物中dna片段的大小为203bp时，判断待鉴定花生具有高含油量。

本发明发现当采用seqidno.1-2所示引物对待鉴定花生的dna进行pcr扩增后，若dna片段大小为222bp，则该待鉴定花生具有一个含油量qtl位点的优异等位基因，具有相对高的含油量。

当采用seqidno.3-4所示引物对待鉴定花生的dna进行pcr扩增后，若dna片段大小为203bp，则该待鉴定花生具有另一个含油量qtl位点的优异等位基因，具有相对高的含油量。

若待鉴定花生同时具有上述两个含油量qtl位点的优异等位基因，则该待鉴定花生相比于具有单一上述含油量qtl位点的优异等位基因的待鉴定花生具有更高的含油量。

本发明的有益效果在于：

本发明开发了两个花生含油量主效稳定的qtl位点qocb06和qocb10.1，进而提供了与其连锁的分子标记，能够在花生育种中辅助选择高含油量的材料，有利于推动高油花生品种的选育，提高育种效率。

附图说明

图1为本发明的花生含油量主效qtl位点qocb06和qocb10.1在染色体的定位；其中，左侧上图代表qocb10.1在染色体b10的定位，左下图代表qtl的置性区间；右侧图代表qocb06在染色体b06的定位；

图2为不同基因型材料含油量平均值比较图，图中，小写字母abc不同代表材料含油量表型存在显著差异。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

以栽培花生中花10号为母本，遗传资源材料icg12625为父本进行杂交并通过单粒传法构建重组自交系(ril)群体f11(2018年)代和f12(2019年)代。

采用ctab法提取亲本和ril群体142份样本叶片基因组dna。选用花生20条染色体上均匀分布，覆盖全基因组的9881对ssr引物在亲本间筛选引物多态性，获得了1443个多态性引物。用这些多态性引物扩增140个ril群体单株，获得群体基因型，并使用joinmap4.0软件构建全基因组20条染色体的遗传连锁图谱。该连锁图包含1443个位点，总长度为2279.10cm，标记间平均距离为1.58cm。

分别在2018-2019年襄阳市农业科学院实验基地和2019年中国农业科学院油料作物研究所阳逻实验基地种植双亲和ril群体140个株系。采用完全随机区组实验设计三次重复。每次重复每个株系种植1行12个单株，行距30厘米，株距20厘米。采取标准的田间管理方式，收获生长正常的8个单株成熟的荚果。每个株系挑选10克左右饱满成熟无病斑的种子，使用核磁共振仪(pq001,上海纽迈电子科技有限公司)测定种子的含油率和含水率。种子含油量(％)＝含油率/(100-含水率)×100。

结合表型和基因型数据，采用windowsqtlcartographer2.5软件的复合区间作图法开展含油量的连锁分析。分别在b10和b06染色体上鉴定获得qtlqocb06和qocb10.1。qtlqocb06在2018年和2019年襄阳的lod值为5.9-9.6，遗传解释率为13.51-22.59％，其加性等位基因来源于父本icg12625，ai06b29452在遗传连锁图上位置与qocb06区间峰值最接近，认定其为与qocb06紧密连锁的分子标记(参见图1)。qtlqocb10.1在2018年和2019年襄阳检测得到lod值为4.38-5.64，遗传解释率为9.18-12.55％，其加性等位基因来源于母本中花10号，aggs2133-1在遗传连锁图上位置与qocb10.1区间峰值最接近，认定其为与qocb10.1紧密连锁的分子标记(参见图1)。

实施例2

利用实施例1中得到的与两个含油量主效位点紧密连锁的分子标记ai06b29452和aggs2133-1对27份花生资源材料进行pcr扩增。

以27份花生资源材料的dna为模板，分别利用seqidno.1-2和seqidno.3-4所示引物进行pcr扩增。当利用seqidno.1-2所示引物进行pcr扩增后，若产物中dna片段的大小为222bp时，判断该花生材料在qocb06位点具有与父本icg12625相同带型记为aa；若产物中dna片段的大小为225bp时，判断该花生材料在qocb06位点具有与母本中花10号相同带型记为aa。当利用seqidno.3-4所示引物进行pcr扩增后，若产物中dna片段的大小为201bp时，判断该花生材料在qocb10.1位点具有与父本icg12625相同带型记为bb；若产物中dna片段的大小为203bp时，判断该花生材料在qocb10.1位点具有与母本中花10相同带型记为bb。如表1所示，8份材料同时具有两个含油量qtl位点的优异等位基因(aabb)，11份材料只具有qocb10.1位点的优异等位基因(aabb)，4份材料只具有qocb06位点的优异等位基因(aabb)，4份材料不具有两个含油量位点的优异等位基因(aabb)。分析这些材料2013-2015含油量表型数据发现，aabb基因型材料的三年含油量平均为51.36±0.98％，aabb为49.43±0.70％，aabb为49.78±0.58％，aabb为48.49±0.55％(参见图2)。结果表明同时具有两个含油量qtl位点的优异等位基因型材料的含油量高于只具有一个或者不具有两个位点优异等位基因型的材料。进一步说明同时用两个与含油量主效主效位点qocb06和qocb10.1位点紧密连锁的标记ai06b29452和aggs2133-1可以较好的选择高油材料。

表1花生材料含油量表型和基因型

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业科学院油料作物研究所

<120>与花生含油量主效qtl位点连锁的分子标记及其应用

<130>khp201115922.3

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gggtcgtactctcttgcgtc20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gaagagagctttgacggtgg20

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atcgaagaccatcttcaaccac22

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

acgagttaatgacccaatcagc22