技术特征：
1.一种鸭黄病毒e蛋白，包括两种不同表达方式得到的鸭黄病毒e蛋白1和鸭黄病毒e蛋白2。以鸭黄病毒基因组为模板，利用一对克隆引物和一对表达引物进行pcr扩增得到dfv-e基因，将dfv-e基因分别与pet-32a、pgex-6p-1质粒连接构建得到表达质粒pet-32a-e、pgex-6p-1-e，再将表达质粒pet-32a-e和pgex-6p-1-e分别转入原核表达宿主大肠杆菌bl21中诱导表达得到分别融合蛋白1和融合蛋白2，融合蛋白1和融合蛋白2分别经纯化得到鸭黄病毒e蛋白1和鸭黄病毒e蛋白2；其特征在于：所述一对克隆引物包括引物c1：5
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gcaggattgtgcagaag-3’，引物c2：5
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ccatgcagtgtcaccca-3’；所述一对表达引物包括引物e1：5
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ccggaattcaccgctgagatggagga-3’，引物e2：5
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ccgctcgagctggtacctgatctgtc-3’；所述的鸭黄病毒e蛋白1和鸭黄病毒e蛋白2的序列如seq id no:1所示。2.根据权利要求1所述的一种鸭黄病毒e蛋白，其特征在于：所述的鸭黄病毒e蛋白1和鸭黄病毒e蛋白2为不同表达方式得到的相同序列蛋白。3.根据权利要求1所述的一种鸭黄病毒e蛋白，其特征在于：所述的融合蛋白1和融合蛋白2的纯化为经过his和gst柱层析纯化。4.根据权利要求1所述的一种鸭黄病毒e蛋白，其特征在于：所述pcr扩增的具体步骤如下：步骤a：以鸭黄病毒病e基因为模板，利用第1对克隆引物c1、c2扩增得到包含dfv-e基因的序列，然后用第2对表达引物e1、e2扩增此序列得到dfv-e1基因；步骤b：以步骤a扩增得到的dfv-e基因进行纯化，连接pmd18-t载体，构建pmd18-t-e克隆载体；步骤c：以步骤b构建pmd18-t-e为模板，利用表达引物e1、e2进行pcr扩增，纯化回收pcr产物，用ecorⅰ和xholⅰ内切酶对此pcr纯化产物和表达载体pet-32a、pgex-6p-1分别进行双酶切。5.一种用于制备权利要求1-4任一项所述的鸭黄病毒e蛋白及其单抗的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：步骤a)、动物免疫：利用表达质粒pet-32a-e诱导得到的鸭黄病毒e蛋白1免疫5～7周龄的balb/c雌性小鼠，经过3次免疫后，筛选出免疫测定效价>1:12800的小鼠；步骤b)、细胞融合：取步骤a)得到的免疫小鼠的脾细胞，与骨髓瘤细胞sp2/0进行细胞融合，利用表达质粒pgex-6p-1-e诱导得到的鸭黄病毒e蛋白2作为包被抗原，对融合后的细胞进行间接elisa筛选得到杂交瘤细胞；步骤c)、单抗的大量克隆：将步骤b)得到的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔中，饲养注射后的小鼠1～3周，收集腹部膨大的小鼠腹水，对腹水进行纯化得到鸭黄病毒e蛋白单抗。6.根据权利要求5所述的鸭黄病毒e蛋白及其单抗的制备方法，其特征在于，所述的鸭黄病毒e蛋白1、鸭黄病毒e蛋白2为不同表达方式得到的相同序列蛋白，两者蛋白序列均为seq id no:1所示。7.一种基于权利要求1～6任一项所述的鸭黄病毒e蛋白及其单抗的竞争elisa方法，该方法包括样品稀释、抗原包被、封闭、加样与加单抗、加酶标记抗体、显色与终止、测值、数据处理，其特征在于：该竞争elisa检测方法中：
步骤1)、样品稀释：血清样品的稀释为原体积的2倍，得到待测血清样品；步骤2)、抗原包被：所用到的包被抗原为表达质粒pgex-6p-1-e诱导得到的鸭黄病毒e蛋白2，包被抗原的包被浓度为0.5μg/ml；步骤3)、封闭：用封闭液封闭步骤2)包被的抗原，封闭时间为40～60min，得到封闭后的酶标板；步骤4)、加样与加单抗：将步骤1)得到的待测血清样品加入到步骤3)得到的封闭后的酶标板中，使血清抗体与包被抗原结合，再加入稀释度为1:400的鸭黄病毒e蛋白单抗，使鸭黄病毒e蛋白单抗结合未与血清抗体反应的剩余包被抗原，得到样品、单抗反应后的酶标板；步骤5)、加酶标记抗体：在步骤4)得到的样品、单抗反应后酶标板中加入酶标抗体，酶标记抗体的稀释浓度为1:2000，酶标记抗体与鸭黄病毒e蛋白单抗结合，而不与血清抗体结合，得到加酶标记抗体后的酶标板；步骤6)、显色与终止：在步骤5)得到的加酶标记抗体后的酶标板中加入新鲜配制的底物溶液，振荡混合后室温避光孵育10～20min进行显色，再每孔加入终止液，混匀终止反应，得到可进行测定的溶液；步骤7)、测值：测定步骤6)得到的可进行测定的溶液在od
450nm
处的吸光值a
450nm
；步骤8)、数据处理：利用步骤7)测定的吸光值a
450nm
计算出待测样品抑制率，所述待测样品抑制率pi％＝(1-a
450
样品/a
450
阴性对照)
×
100。8.根据权利要求7所述的基于鸭黄病毒e蛋白单抗的竞争elisa方法，其特征在于：步骤3)中，所述封闭液为浓度为：1％bsa溶液、1％明胶溶液、5％胎牛血清溶液、5％脱脂奶粉溶液中任一种。9.根据权利要求7所述的基于鸭黄病毒e蛋白单抗的竞争elisa方法，其特征在于：步骤5)中，所述酶标记抗体的抗体为山羊抗小鼠igg-hrp；所述的a
450
阴性对照为用未感染鸭黄病毒的血清测定出来的吸光值a
450
。
技术总结
本发明涉及一种基于鸭黄病毒E蛋白及其单抗的竞争ELISA方法，同时涉及鸭黄病毒E蛋白表达及其单抗制备方法，属于动物免疫学检测技术领域。本发明利用引物对C1、C2和引物对E1、E2扩增得到鸭黄病毒E蛋白的基因序列，通过表达质粒构建、表达质粒导入原核表达宿主，诱导表达、纯化得到鸭黄病毒E蛋白，以鸭黄病毒E蛋白为抗原，通过杂交瘤技术获得鸭黄病毒E蛋白单抗，并基于鸭黄病毒E蛋白及其单抗建立了能够用于检测鸭黄病毒抗体的竞争ELISA方法。本发明检测方法特异性强、稳定性好，可用于鸭黄病毒血清抗体的检测。本发明以鸭黄病毒病E蛋白1为包被抗原，鸭黄病毒病E蛋白的单抗为竞争抗体。鸭黄病毒病E蛋白的单抗为竞争抗体。鸭黄病毒病E蛋白的单抗为竞争抗体。
技术研发人员：马琳 苏文广 魏大伟 熊毅 易春华 刘捷 温新瑞 孙晓琳
受保护的技术使用者：北海市动物疫病预防控制中心
技术研发日：2020.10.30
技术公布日：2022/4/12