一种检测诺如病毒GI和GII基因型的试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及病原体核酸检测领域，尤其涉及一种检测诺如病毒gi和gii基因型的试剂盒及检测方法。
背景技术：
：诺如病毒，是人类杯状病毒科(humancalicivirus，hucv)中诺如病毒(norovirus，nv)属的一种病毒。诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。美国每年在所有的非细菌性腹泻爆发中，60％-90％是由诺如病毒引起。荷兰、英国、日本、澳大利亚等发达国家也都有类似结果。在中国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒检出率为15％左右，血清抗体水平调查表明中国人群中诺如病毒的感染亦十分普遍。因此对诺如病毒的检测应该被重视。诺如病毒被分为6个基因群(genogroup，gi-gvi)，gi和gii是引起人类急性胃肠炎的两个主要基因群，giv也可感染人，但很少被检出。giii、gv和gvi分别感染牛、鼠和狗。诺如病毒主要通过粪口途径感染，感染后人和动物能够分泌大量的诺如病毒颗粒。因诺如病毒具有较强的离体存活力和感染性，小剂量诺如病毒即可感染(<100个病毒颗粒)，人群对其普遍易感。人体被诺如病毒感染后的临床症状主要是呕吐和腹泻，与其他病原造成的胃肠炎症状也难以区别。目前，临床上较为常见的检测方法为：1.核酸检测和基因型鉴定：现有的荧光定量pcr均需要先将rna反转录为cdna，然后再以cdna为模板进行荧光定量pcr，因此传统的诺如病毒基因检测需要逆转录酶和taqdna聚合酶，随着体外诊断原料价格的上涨，试剂盒添加原料越多，成本也会越高，并且检测时间较长；2.抗原检测：由于诺如病毒抗原高度变异，开发广泛反应的elisa方法存在较大挑战。taqdna聚合酶是最早发现的热稳定dna聚合酶之一，通常作为pcr所依赖dna聚合酶被大家所归类。但是，taqdna聚合酶与mmlv逆转录酶属于同一dna聚合酶超家族，已有研究表明taqdna聚合酶具有逆转录酶活性。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种检测诺如病毒gi和gii基因型的试剂盒，旨在降低诺如病毒检测的成本，缩短检测时间。为实现以上目的，本发明提供一种检测诺如病毒gi和gii基因型的试剂盒，包括：a液，所述a液为酶液mix，包括taq-wt酶液、udg酶以及rnainhibitor；b液，所述b液即2xonestepbuffer包括诺如病毒gi和gii基因型特异性引物和特异性检测探针与10xtaqbuffer以及d(u)ntp。可选地，所述诺如病毒gi基因型特异性引物和特异性检测探针分别为：gi-primer-f：5'-atgttggtgaccaacaagctgtatcatggtctgctaatg-3'(seqidno.1)；gi-primer-r：5'-gcgagtggaccccaatagttttaccttgcc-3'(seqidno.2)；gi-probe：5'-[fam-dt]tggagtgaacattggcgttagtgatctgaccactgtccgtggacca[bhq1-dt]-3'(seqidno.3)；所述诺如病毒gii基因型特异性引物和特异性检测探针分别为：gii-primer-f：5'-gtgacgccaacccatctgatgggtccgcagccaacct-3'(seqidno.4)；gii-primer-r：5'-gcacttcaaaaccacctgcataaccgttgt-3'(seqidno.5)；gii-probe：5'-[rox-dt]ggtcaacaatgaggttatggctctggagcccgttgttggtgccgcca[bhq2-dt]-3'(seqidno.6)。可选地，所述10xtaqbuffer包括：200mm的tris-hcl，20mm的(nh4)2so4，300mm的kcl，40mm的mgso4，1％的tritonx-100，ph为8.0。本发明还提供一种利用上述任一项所述的试剂盒检测诺如病毒gi和gii基因型的方法，包括以下步骤：(1)提取待测样品的rna；(2)配制反应体系：反应体系为30μl，配置时依次向反应管中加入15μlb液，3.5μlnucletide-freewate，1.5μla液，震荡混匀、离心备用；(3)向反应管中加入rna样本10μl，置于混匀器上充分混匀后离心；(4)反应过程：将反应管置于实时荧光定量pcr仪内，50℃恒温孵育15min，95℃15s，55℃30s为1个循环采集1次荧光信号，共40个循环，整个反应过程共60min。本发明的有益效果：本发明技术方案的检测诺如病毒gi和gii基因型的试剂盒通过使用优化的pcr扩增buffer，使得taq酶具有反转录酶活性与dna聚合酶活性，由同一个酶完成诺如病毒核酸实时荧光定量pcr检测，其灵敏度与特异性与传统的real-timert-pcr法相当，但检测时间缩短三分之一，适用于即时快速诊断，降低原料成本和时间成本。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定。图1a为不同ph的10xtaqbuffer对gi基因型检测影响结果图；图1b为不同ph和mg2+浓度的10xtaqbuffer对gi基因型检测影响结果图；图1c为不同nh42+浓度的10xtaqbuffer对gi基因型检测影响结果图；图1d为不同k+浓度的10xtaqbuffer对gi基因型检测影响结果图；图2为本发明实施例的试剂盒对诺如病毒gi和gii基因型检测灵敏性的试验结果图；图3为本发明实施例的试剂盒对诺如病毒gi和gii基因型检测特异性的试验结果图。具体实施方式如本文所用之术语：本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。本发明提供一种检测诺如病毒gi和gii基因型的试剂盒，包括：a液，所述a液为酶液mix，包括taq-wt酶液、udg酶以及rnainhibitor；b液，所述b液即2xonestepbuffer包括诺如病毒gi和gii基因型特异性引物和特异性检测探针与10xtaqbuffer以及d(u)ntp。。可选地，所述诺如病毒gi基因型特异性引物和特异性检测探针分别为：gi-primer-f：5'-atgttggtgaccaacaagctgtatcatggtctgctaatg-3'(seqidno.1)；gi-primer-r：5'-gcgagtggaccccaatagttttaccttgcc-3'(seqidno.2)；gi-probe：5'-[fam-dt]tggagtgaacattggcgttagtgatctgaccactgtccgtggacca[bhq1-dt]-3'(seqidno.3)；所述诺如病毒gii基因型特异性引物和特异性检测探针分别为：gii-primer-f：5'-gtgacgccaacccatctgatgggtccgcagccaacct-3'(seqidno.4)；gii-primer-r：5'-gcacttcaaaaccacctgcataaccgttgt-3'(seqidno.5)；gii-probe：5'-[rox-dt]ggtcaacaatgaggttatggctctggagcccgttgttggtgccgcca[bhq2-dt]-3'(seqidno.6)。可选地，所述10xtaqbuffer包括：200mm的tris-hcl，20mm的(nh4)2so4，300mm的kcl，40mm的mgso4，1％的tritonx-100，ph为8.0。本发明还提供一种利用上述任一项所述的试剂盒检测诺如病毒gi和gii基因型的方法，包括以下步骤：(1)提取待测样品的rna；(2)配制反应体系：反应体系为30μl，配置时依次向反应管中加入15μlb液，3.5μlnucletide-freewater，1.5μla液，震荡混匀、离心备用；(3)向反应管中加入rna样本10μl，置于混匀器上充分混匀后离心；(4)反应过程：将反应管置于实时荧光定量pcr仪内，50℃恒温孵育15min，95℃15s，55℃30s为1个循环采集1次荧光信号，共40个循环，整个反应过程共60min。下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1诺如病毒gi和gii基因型引物、探针的设计及制备从genebank分别下载诺如病毒gi和gii基因型核酸序列，对诺如病毒gi和gii基因组序列进行分析，其中稳定的保守区域作为检测的靶序列，并针对该靶序列设计合成特异性的检测引物和探针：其中，gi基因型检测所用的引物和探针的序列分别为：gi-primer-f：5'-atgttggtgaccaacaagctgtatcatggtctgctaatg-3'(seqidno.1)gi-primer-r：5'-gcgagtggaccccaatagttttaccttgcc-3'(seqidno.2)gi-probe：5'-[fam-dt]tggagtgaacattggcgttagtgatctgaccactgtccgtggacca[bhq1-dt]-3'(seqidno.3)gii基因型检测所用的引物和探针的序列分别为：gii-primer-f：5'-gtgacgccaacccatctgatgggtccgcagccaacct-3'(seqidno.4)gii-primer-r：5'-gcacttcaaaaccacctgcataaccgttgt-3'(seqidno.5)gii-probe：5'-[rox-dt]ggtcaacaatgaggttatggctctggagcccgttgttggtgccgcca[bhq2-dt]-3'(seqidno.6)上述引物及探针序列均由上海生工生物工程有限公司合成。实施例22xonestepbuffer配方优化本发明的2xonestepbuffer由10xtaqbuffer配置而来，在优化10xtaqbuffer过程中，分别检测gi/gii特异性探针，利用单因素变量法分别优化10xtaqbuffer的ph、mg2+浓度、nh42+浓度以及k+浓度对检测结果的影响，10xtaqbuffer优化过程配方见表1所示。本实施例中以gi基因型为例进行单重测试检测10xtaqbuffer对gi基因型检测的影响，单重测试反应体系配制如表2所示，配制反应体系：反应体系为30μl，配置时依次向反应管中加入15ulb液，3.5ulnucletide-freewater，1.5ula液，震荡混匀、离心备用；向反应管中加入rna样本10μl，置于混匀器上充分混匀后离心；反应过程：将反应管直接置于罗氏96实时荧光定量pcr仪内，50℃恒温孵育15min，95℃15s，55℃30s为1个循环采集1次荧光信号，共40个循环，整个反应过程共60min，通过观测荧光曲线进行结果判读。扩增曲线gi与gii结果类似，不同单因素变量影响gi检测结果分别如图1a至图1d所示，gii不再赘述。首先探究不同ph的10xtaqbuffer1对gi基因型检测结果的影响，结果如图1a所示，图1中pc是阳性对照，从图1a中可看出，ph8.0的10xtaqbuffer对gi基因型检测效果最好。然后选择ph8.0或ph7.5的10xtaqbuffer2探究不同mg2+浓度对gi基因型检测结果的影响，结果如图1b所示，从图1b中可看出，ph为8.0，mg2+浓度为40mm时，gi基因型检测效果最好。然后探究不同nh42+浓度对gi基因型检测的影响，结果如图1c所示，从图1c看出，20mm的nh42+浓度时，gi基因型检测效果最好。最后再探究不同k+浓度对gi基因型检测的影响，结果如图1d所示，从图1d得出，k+浓度为300mm时，gi基因型检测效果最好。因此，选取最终优化最佳组合即10xtaqbuffer4中buffera-3，配制2xonestepbuffer如表3所示。表.110xtaqbuffer优化过程配方表.2反应体系配制表(以gi基因型为例)组分体积(ul)a液taqdnapolymerase0.9udg酶0.3rnainhibitor0.3b液(单重测试)10xtaqbuffer3gi-primer-f0.6gi-primer-r0.6gi-probe0.3d(u)ntp0.3nfwater13.7rnatemplate10total30表.32xonestepbuffer(b液)试验例1试剂盒检测灵敏性评价采用qiagen公司的qiaamprnaminikit试剂盒提取诺如病毒rna，取提取的样本rna核酸，然后以10倍梯度稀释方式，依次稀释成105、104、103、102、101、1copies/ml数量级的样本，备用，并采用本发明实施例提供的检测诺如病毒gi和gii基因型试剂盒对提取的诺如病毒rna进行检测。试验结果如图2所示，从图2中可看出，本发明提供的检测诺如病毒gi和gii基因型试剂盒对诺如病毒的最低检出限为10copies/ml，灵敏度好。试验例2试剂盒检测特异性评价为评价本发明实施例提供的检测诺如病毒gi和gii基因型试剂盒的检测特异性，从临床样本中筛选了一组常见的肠道常见病原体及感染部位与诺如病毒相同或感染症状相似的其他病原体，包括：轮状病毒、札幌病毒、肠道腺病毒、星状病毒、沙门氏菌、志贺氏菌。采用qiagen公司的qiaamprna/dnaminikit试剂盒对上述病原体分别进行核酸提取，并采用本发明实施例提供的诺如病毒gi和gii基因型检测试剂盒进行检测。试验结果如图3所示，评价结果表明，本发明实施例提供的诺如病毒gi和gii基因型检测试剂盒检测常见肠道病原体结果均为阴性，检测与诺如病毒感染部位相同或感染症状相似的其他病原体，结果亦为阴性，只有诺如病毒gi和gii基因型阳性质控品的检测结果都为阳性。证明本发明实施例提供的诺如病毒gi和gii基因型检测试剂盒采用的的引物及探针的特性强，与其他病原体不发生交叉反应。上述试验结果表明，本发明实施例提供的诺如病毒gi和gii基因型检测试剂盒的灵敏性和特异性都较好，并且由于该试剂盒不需要单独进行rna逆转录为cdna的步骤，且只需要一个taq酶就能实现实时荧光定量pcr的逆转录和扩增步骤，节约试剂盒成本，缩短检测时间。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该
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部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体
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的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。序列表<110>深圳市碳域科技有限公司<120>一种检测诺如病毒gi和gii基因型的试剂盒及检测方法<130>2020-12-03<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atgttggtgaccaacaagctgtatcatggtctgctaatg39<210>2<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gcgagtggaccccaatagttttaccttgcc30<210>3<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tggagtgaacattggcgttagtgatctgaccactgtccgtggacca46<210>4<211>37<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gtgacgccaacccatctgatgggtccgcagccaacct37<210>5<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gcacttcaaaaccacctgcataaccgttgt30<210>6<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ggtcaacaatgaggttatggctctggagcccgttgttggtgccgcca47当前第1页12