一种针对人源化免疫系统小鼠的基因编辑方法及其用途与流程

[0001]
本发明涉及动物基因工程和基因遗传修饰技术领域，具体为针对人源化免疫系统小鼠的基因编辑方法及其用途。


背景技术：

[0002]
在生物医药实验中，为了更好地研究和治疗人类疾病，往往需要利用多种不同种属的动物，如大小鼠等等，来模拟人类疾病，在其中进行相关研究。但是啮齿类动物和人往往有较大的种属差异，基于大小鼠的动物模型所取得的实验结果往往和人群中的结果有较大的差距，并不能如实反映人体中药物的作用情况。而灵长类动物的应用则受到成本，动物福利和伦理学等的诸多限制。在此情况下，为了更好的研究人类血和免疫系统的功能，人源化免疫系统小鼠应运而生。申请人此前研发了用于制作人源化免疫系统小鼠所用的重度免疫缺陷的转基因nplg小鼠(cn202010373356.5)，及具有髓系细胞的人源化免疫系统小鼠(cn202010290960.1)，较好的满足了新药评价需求。
[0003]
此前的免疫系统人源化小鼠，包括第一代人源化免疫系统小鼠，及具有髓系免疫细胞的人源化小鼠，均有各自的缺点。其中第一代人源化免疫系统小鼠，由于其体内的鼠源髓系免疫细胞功能基本完整，且促进髓系免疫细胞发育的细胞因子在人和小鼠之间基本没有同源性，故其体内移植的人源干细胞只能发育成为t，b淋巴细胞，而基本不能发育成髓系免疫细胞。故第一代人源化免疫系统小鼠体内的人源髓系免疫系统是基本缺失的，无法用于针对髓系免疫细胞相关靶点的药物筛选。而目前的具有髓系免疫细胞的人源化免疫系统小鼠，基本均是基于在极重度免疫缺陷小鼠体内，通过转基因技术，过表达促进人髓系免疫细胞发育的细胞因子，包括gm-csf (csf2), il3, g-csf或m-csf等。通过表达这些细胞因子，可以促进小鼠体内移植的人源造血干细胞发育为髓系免疫细胞。但是，普通的转基因手段转入的人源细胞因子表达的相关基因，均使用功能较强的启动子和增强子，且不可再次调控。故相关细胞因子在小鼠体内的表达量远高于正常的生理水平，可达正常人体水平的1000倍以上。在高剂量的gm-csf和il3等细胞因子的作用下，人源髓系免疫细胞会过度发育，得到高于正常水平的髓系免疫细胞，包括巨噬细胞，粒细胞和dc细胞等等。而髓系细胞的发育过程和淋巴细胞不同，不会因其在小鼠体内发育就与小鼠的组织相兼容。过高的髓系免疫细胞会造成小鼠贫血，并产生针对小鼠的移植物抗宿主反应，即髓系gvhd。导致其寿命相比第一代人源化免疫系统小鼠缩短，从超过一年缩减到半年左右，可能影响药物的给药周期，从而限制了该动物的使用。


技术实现要素：

[0004]
为了解决上述现有技术存在的问题，本发明设计并制作了新一代具有髓系免疫细胞的人源化小鼠。这种小鼠将此前常见的人源细胞因子转基因过表达技术，改为直接对小鼠的髓系免疫细胞发育的细胞因子基因进行人源基因的原位替换。该技术可以解决此前的人源免疫细胞小鼠中常见的具有过高水平的人源细胞因子及髓系免疫细胞的问题，可以在
保证拥有人源髓系免疫功能的同时，有效延长小鼠的寿命。同时，由于小鼠的相关细胞因子基因被替换，使小鼠的髓系免疫系统发育受到了进一步抑制。这在一定程度上解除了小鼠髓系免疫细胞，对移植的人源造血干细胞及其发育得来的人源免疫细胞的攻击和抑制。从而使其可以更好的定植在小鼠体内，并提高人源细胞移植的成功率和重建比例。总之，在此技术上发展得来的人源化免疫系统小鼠，拥有更高的人源细胞重建比例及成功率，更长的寿命，可以更好的发挥其应用价值。
[0005]
为解决上述技术问题，本发明提供一种人源化nplg il3 gm-csf kitlg小鼠的制备方法，所述方法包括对重度免疫缺陷小鼠nplg小鼠的il3，gm-csf（csf2）和kitlg基因进行人源基因的原位敲入替换。
[0006]
进一步的，具体包括如下步骤：1）制备人源化il3 gm-csf小鼠；并通过pcr扩增鉴定筛选人源化il3 gm-csf纯合小鼠；2）制备人源化kitlg小鼠；并通过pcr扩增鉴定筛选人源化kitlg 纯合小鼠；3）将步骤1）获得的人源化il3 gm-csf纯合小鼠与步骤2）获得的人源化kitlg纯合小鼠杂交，得到人源化il3 gm-csf kitlg杂合小鼠。
[0007]
进一步的，所述步骤3），还包括将人源化il3 gm-csf kitlg杂合小鼠通过多次同胞交配，并进行pcr鉴定，获得il3 gm-csf kitlg纯合小鼠。
[0008]
进一步的，所述人源化il3 gm-csf小鼠是将nplg小鼠il3基因的p.a27信号肽至gm-csf基因的tga终止密码子区段整体替换为如下区段： 人类il3基因的p.a20信号肽至tga终止密码子序列 + 小鼠il3基因的utr非翻译区序列 + 小鼠il3基因5号外显子下游500bp的序列 + 小鼠csf2基因atg起始密码子上游5kbp的序列 + 小鼠csf2基因的p.m1到p.s17信号肽序列 + 人类csf2基因的p.a18信号肽到tga终止密码子序列。小鼠il3的信号肽p.m1-p.q26及小鼠csf2的信号肽p.m1-p.s17将保留在该敲入策略中。
[0009]
进一步的，所述人源化kitlg小鼠是将nplg小鼠kitlg基因2号外显子的部分蛋白编码区(cds区)替换为人kitlg基因的cds区(p.e26-p.v273 + 3
×
sv40 polya)。小鼠的信号肽(p.m1-p.t25)将保留在该敲入策略中。
[0010]
优选的，所述步骤1）制备人源化il3 gm-csf小鼠包括构建供体载体，其含有核苷酸序列seq no.1；将cas9，grna和供体载体共同显微注射到小鼠受精卵中，以产生拥有目标敲入基因片段的小鼠；进一步优选的，所述grna选自：grna-a1 (与正向序列互补): ggactccaagcttcaatcag-tgg（seq no .3）；grna-a2 (与反向序列互补): ggcctgggcttcctcatttt-tgg（seq no .4）；和grna-b1 (与正向序列互补): cccggccactgattgaagct-tgg（seq no .5）；grna-b2 (与反向序列互补): gggcttcctcatttttggac-tgg（seq no .6）。
[0011]
优选的，所述步骤2）制备人源化kitlg小鼠包括构建供体载体，其含有核苷酸序列seq no.2；将cas9, grna和供体载体共同显微注射到小鼠受精卵中，以产生拥有目标敲入基因片段的小鼠；进一步优选的，所述grna选自：grna-c1 (与正向序列互补): atctccttggttttgacgag-agg（seq no .10）；grna-c2 (与反向序列互补): tcaaaaccaaggagatctgc-ggg（seq no .11）。
[0012]
进一步的，所述步骤1）pcr扩增鉴定筛选采用如下引物：
同源臂引物primer f: gctcctgatgctcttcca（seq no .7）插入片段引物primer r1: tgattgtcataacaatcc （seq no .8）小鼠基因组引物primer r2: tgaagacccctggcagcg（seq no .9）。
[0013]
进一步的，所述步骤2）pcr扩增鉴定筛选采用如下引物：human kitlg prime 1f: tctgcaggaatcgtgtga（seq no .12）；human kitlg prime 1r: gtaggctggagtctccag（seq no .13）；同源臂引物prime 2f: aaagatggacaccaagaa（seq no .14）同源臂引物prime 2r: ggtcagcaagcacaggga（seq no .15）。
[0014]
所述小鼠il3基因的p.a27信号肽至gm-csf基因的tga终止密码子区段的核苷酸序列为（19578bp）：seq no .16。
[0015]
所述人类il3基因的p.a20信号肽至tga终止密码子序列为（2028bp）：seq no .17。
[0016]
所述小鼠il3基因的utr非翻译区序列（101bp）为：seq no .18。
[0017]
所述小鼠il3基因5号外显子下游500bp的序列为：seq no .19。
[0018]
所述小鼠il3的信号肽p.m1-p.q26核苷酸序列（78bp）为：seq no .20。
[0019]
所述小鼠csf2基因atg起始密码子上游5kbp的序列为：seq no .21。
[0020]
所述小鼠csf2基因的p.m1到p.s17信号肽序列（51bp）为：seq no .22。
[0021]
所述人类csf2基因的p.a18信号肽到tga终止密码子序列（1978bp）为：seq no .23。
[0022]
所述人kitlg基因的cds区中p.e26-p.v273核苷酸序列（747bp）为：seq no .24。
[0023]
所述人kitlg基因的cds区中3
×
sv40 polya的核苷酸序列（843bp）为：seq no .25。
[0024]
所述小鼠kitlg基因p.m1-p.t25信号肽（75bp）序列为：seq no .26。
[0025]
本发明还提供一种人源化免疫系统小鼠的制备方法，使用本发明方法制备的人源化nplg il3 gm-csf kitlg小鼠制备人源化免疫系统小鼠，包括如下步骤：选用新生或1至5周龄的人源化nplg il3 gm-csf kitlg小鼠，全身辐照或给予化疗药物清髓；清髓后，对小鼠尾静脉注射cd34阳性的人源造血干细胞；干细胞接种12周后，对小鼠外周血中，人源免疫细胞的比例和亚群进行流式检测，外周血中人源免疫细胞占总免疫细胞数量超过25%的小鼠即为人源化免疫系统小鼠。
[0026]
优选的，所述辐照的放射源是x射线、或者co60/cs137来源的gamma射线，射线的剂量为0.5-2gy每只小鼠。
[0027]
进一步优选的，所述的cd34阳性的人源造血干细胞注射剂量为1
×
104~1
×
106每只小鼠，并根据前处理情况，包括辐照剂量及周龄进行调整。
[0028]
本发明还提供一种上述方法制备的人源化nplg il3 gm-csf kitlg小鼠或人源化免疫系统小鼠在肿瘤免疫治疗单抗的药效评价中的应用。
[0029]
本发明所述的nplg小鼠是指重度免疫缺陷小鼠；优选按照专利cn202010373356.5公开的方法获得的重度免疫缺陷小鼠。其是通过crispr/cas9技术敲除小鼠染色体中编码白介素-2受体的gamma链的基因，选择白介素-2受体的gamma链的基因的外显子1和2作为敲除位点，然后cas9信使rna和引导rna被共同通过显微注射进小鼠的受精卵内，从而获得重度免疫缺陷小鼠nplg小鼠。因此，cn202010373356.5公开的内容全文引入本申请。
[0030]
本发明的有益效果：1）将此前的人源细胞因子过表达技术，改为使用小鼠的天然的相应细胞因子表达调控原件来进行表达量控制。使得小鼠体内的人源细胞因子恢复到了正常的生理水平，解决了此前同类小鼠中常见的具有过高水平的人源细胞因子，及人髓系免疫细胞带来的gvhd和贫血等问题。可以在保证人源髓系免疫系统得以发育的同时，有效延长小鼠的寿命。且相关细胞因子的表达更为稳定，动物的个体差异得到有效控制。
[0031]
2）由于小鼠的髓系免疫系统发育相关的细胞因子基因被人源基因替换，使小鼠的髓系免疫系统发育受到了进一步抑制。在一定程度上减轻了小鼠髓系免疫细胞，对移植的人源造血干细胞及其发育得来的人源免疫细胞的攻击和抑制。从而使其可以更好的定植在小鼠体内，并提高人源细胞移植的成功率和重建比例。
[0032]
3）在具体的人源化小鼠制备过程中，设计筛选了合适的grna，确保本申请制备方法能够高效的获得阳性克隆，获得较好的阳性率。特别针对il3和gm-csf (csf2)的基因敲入，设计筛选到合适的grna，一次性同时替换2个基因，省去一次小鼠的杂交过程。此外，也设计筛选到合适的pcr扩增引物，使制备过程中，能够顺利筛选出目标小鼠。
附图说明
[0033]
图1 il3 gm-csf (csf2)基因敲入策略图；图2 il3 gm-csf (csf2)基因线性化的载体设计图；图3 il3 gm-csf (csf2)基因重组载体限制性内切酶消化产物电泳图；图4 kitlg基因敲入策略图；图5 kitlg基因线性化的载体设计图；图6 kitlg基因重组载体限制性内切酶消化产物电泳图；图7 il3 和csf2人源化小鼠的鉴定；图8 kitlg人源化小鼠的鉴定；图9 kitlg人源化纯合小鼠的鉴定和筛选；图10a至图10c f1子代小鼠il3 csf2 kitlg人源化纯合小鼠鉴定，其中：图10a为使用引物primer f，primer r1以及primer r2进行f1代小鼠的基因组pcr扩增鉴定；图10b为使用引物prime 1f 以及prime 1r对f1代小鼠基因组进行pcr扩增鉴定；图10c为使用引物prime 2f 以及prime 2r进行pcr扩增鉴定；图11人源化免疫系统小鼠外周血人源免疫细胞占比；图12人源化免疫系统小鼠外周血人源髓系免疫细胞占比；图13不同品系的小鼠经人源化重建后的红细胞含量；图14不同品系的小鼠经人源化重建后血红蛋白含量；图15不同品系的小鼠经人源化重建后的生存状况。
具体实施方式
[0034]
下面结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述和说明。
[0035]
基于发明人此前研发制作的重度免疫缺陷小鼠nplg小鼠(cn202010373356.5)，在
该小鼠的基础上进一步使用基于crispr cas9技术，对nplg小鼠的il3，gm-csf(csf2)和kitlg基因进行人源基因的原位敲入替换。
[0036]
一、基因敲入位点确定和供体载体构建1、各基因分布情况小鼠il3基因（ensembl数据库转录本：mgp_nodshiltj_t0028883.1）位于小鼠染色体11上。已鉴定出5个外显子，其中第1外显子为atg起始密码子，第5外显子为taa终止密码子。
[0037]
人类il3基因（ncbi数据库参考序列：nm_000588.4）位于人类5号染色体上。已鉴定出5个外显子，其中外显子1为atg起始密码子，外显子5为tga终止密码子。
[0038]
小鼠gm-csf(csf2)基因（ensembl数据库转录本：mgp_nodshiltj_t0028882.1）位于小鼠11号染色体上。已鉴定出4个外显子，其中外显子1为atg起始密码子，外显子4为tga终止密码子。
[0039]
人类gm-csf(csf2)基因（ncbi数据库参考序列：nm_000588.4）位于人类5号染色体上。已鉴定出4个外显子，其中外显子1为atg起始密码子，外显子4为tga终止密码子。
[0040]
小鼠kitlg基因（ensembl转录本：mgp_nodshiltj_t0026766.1）位于小鼠10号染色体上。已鉴定出10个外显子，第1外显子的atg起始密码子，第9外显子的taa终止密码子。
[0041]
人类kitlg基因(ncbi数据库参考序列：nm_000899.5)位于人类12号染色体上。已鉴定出10个外显子，第1外显子的atg起始密码子，第9外显子的taa终止密码子。
[0042]
、il3和gm-csf (csf2)的基因敲入策略及供体载体的构建2.1 il3和gm-csf (csf2)的基因敲入策略因il3和gm-csf (csf2)的基因均位于11号染色体的同一条同源臂上，且相隔距离不远，故本方法通过设计合适的grna (guiderna, 引导rna)， 一次性同时替换2个基因，即可省去一次小鼠的杂交过程。对il3和csf2基因的敲入策略如图1所示，将小鼠il3基因的p.a27信号肽到小鼠csf2基因的tga终止密码子区段整体替换为如下区段：“人类il3基因的p.a20信号肽至tga终止密码子序列 + 小鼠il3基因的utr非翻译区序列 + 小鼠il3基因5号外显子下游500bp的序列 + 小鼠csf2基因atg起始密码子上游5kb的序列 + 小鼠csf2基因的p.m1到p.s17信号肽序列 + 人类csf2基因的p.a18信号肽到tga终止密码子序列。”小鼠il3的信号肽（p.m1-p.q26）及csf2的信号肽（p.m1-p.s17）将保留在该敲入策略中。
[0043]
和gm-csf (csf2)基因线性化的载体构建为了构建敲除用载体，使用nplg小鼠的基因组作为模板，通过高保真taq酶，使用pcr反应生成目标区段的同源臂。随后，将其和重组位点及选择标记一同组装进载体中。线性化的载体设计如图2所示。
[0044]
将重组完成的载体，通过限制性内切酶消化。对消化产物片段的尺寸进行电泳，验证结果如图3所示。其理论酶切产物为：1. xmni: 8.7/4.8/3.6/0.92. aflii+ecorv: 7.1/4.2/3.6/1.9/1.0/0.13. apali+nhei: 9.4/4.6/2.0/1.2/0.74. asci: 18.0
从电泳条带显示，酶切结果符合理论预期。
[0045]
最终的供体载体经测序验证含有如下核苷酸序列：seq no.1，符合预期。
[0046]
、kitlg基因敲入策略和供体载体的构建3.1 kitlg基因敲入策略kitlg基因单独存在于小鼠第10号染色体，故对其单独进行基因打靶敲入。其敲入策略如图4所示，将小鼠2号外显子的部分蛋白编码区(cds区)替换为人kitlg基因的cds区(p.e26-p.v273 + 3
×
sv40 polya), 小鼠的信号肽(p.m1-p.t25)将保留在该敲入策略中。
[0047]
基因线性化的载体构建为了构建敲除用载体，使用nplg小鼠的基因组作为模板，通过高保真taq酶，使用pcr反应生成目标区段的同源臂。随后，将其和重组位点及选择标记一同组装进载体中。线性化的载体设计如图5所示。将重组完成的载体，通过限制性内切酶消化。对消化产物片段的尺寸进行电泳，结果如图6所示。其理论酶切产物为：1. ncoi: 4.4/1.8/1.5/0.62. apali+bamhi: 2.7/2.3/1.2/1.0/0.7/0.23. avai+sspi: 3.4/2.1/1.5/1.0/0.1/0.1/0.14. pvui+noti: 3.6/2.8/1.0/0.9可见电泳条带显示，酶切结果符合理论预期。
[0048]
最终的供体载体经测序验证含有如下核苷酸序列：seq no.2，符合预期。
[0049]
二、显微注射流程第一天，选取3-4周龄的nplg雌性小鼠，作为供体，每只小鼠腹腔注射5iu pmsg；47~48小时后，每只小鼠腹腔注射5iu hcg，并与性成熟的正常公鼠合笼交配；交配后的次日，即第四天进行阴道栓检查，并将供体雌鼠拿出用于受精卵采集，同天准备好适龄的代孕母鼠。
[0050]
采集受精卵时，安乐死供体雌鼠，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3 mg/m2液中，显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，洗涤和采集受精卵，最终将受精卵放在5% co2，37℃培养箱培养待用。在显微镜下观察，挑选形态正常，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵用于显微注射。通过加样器，将混合的供体载体、cas9和引导rna加入到注射针内；安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴m2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。200-400倍镜下进行显微注射，将混合的供体载体、cas9和引导rna注射到受精卵细胞质中；注射400枚左右受精卵，注射完毕后，放入5% co2，37℃培养箱培/0.5-1h，筛选掉即时死亡的受精卵；将受体代孕鼠麻醉，手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口，将注射后的受精卵移植到代孕鼠输卵管内，每只母鼠移植20-30枚注射后受精卵；移植完毕后，将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤，将小鼠放到干净的笼盒内，待苏醒后，转移到动物饲养间饲养；定期观察手术后代孕鼠的健康和怀孕情况；手术后19~21天母鼠分娩，待幼崽出生2-3周后，剪耳、编号，剪尾，进行pcr和测序鉴定，确认基因是否敲入成功。
[0051]
三、人源化基因小鼠的制备及鉴定筛选1、制备人源化il3 gm-csf小鼠及其鉴定筛选将cas9, grna和il3 gm-csf (csf2)基因供体载体共同显微注射到小鼠受精卵中，以
产生拥有目标敲入基因片段的小鼠。
[0052]
其中打靶用的grna序列如下：grna-a1 (与正向序列互补): ggactccaagcttcaatcag-tgg（seq no .3）grna-a2 (与反向序列互补): ggcctgggcttcctcatttt-tgg（seq no .4）grna-b1 (与正向序列互补): cccggccactgattgaagct-tgg（seq no .5）grna-b2 (与反向序列互补): gggcttcctcatttttggac-tgg（seq no .6）敲入成功的il3 csf2 f1子代小鼠均为杂合小鼠，将其进行同胞交配，并进行pcr鉴定，直到最终获得il3 csf2纯合小鼠；为了鉴定纯合、杂合和野生型小鼠，共设计了3条pcr引物：同源臂引物primer f: gctcctgatgctcttcca（seq no .7）插入片段引物primer r1: tgattgtcataacaatcc （seq no .8）小鼠基因组引物primer r2: tgaagacccctggcagcg（seq no .9）用上述三条引物同时对小鼠基因组进行pcr扩增，仅出现418bp大小条带的，为纯合il3 csf2人源化小鼠；仅出现314bp大小条带的，为野生型小鼠，出现两条带的则为杂合小鼠。鉴定结果如图7所示，可见，其中1，4，8号为野生型小鼠，3,5,6,7号为杂合小鼠，2号为敲入人源il3 csf2的纯合小鼠。
[0053]
2、制备人源化kitlg小鼠及其鉴定筛选将cas9, grna和kitlg基因供体载体共同显微注射到小鼠受精卵中，以产生拥有目标敲入基因片段的小鼠。
[0054]
其中打靶用的grna序列如下：grna-c1 (与正向序列互补): atctccttggttttgacgag-agg（seq no .10）grna-c2 (与反向序列互补): tcaaaaccaaggagatctgc-ggg（seq no .11）敲入成功的kitlg小鼠亦均为杂合小鼠，将其进行同胞交配，并进行pcr鉴定，直到最终取得kitlg纯合小鼠；为了鉴定敲入是否成功，使用如下引物对小鼠基因组进行pcr扩增：human kitlg prime 1f: tctgcaggaatcgtgtga（seq no .12）human kitlg prime 1r: gtaggctggagtctccag（seq no .13）如果人源kitlg基因敲入成功，则会出现578bp条带，否则为野生型小鼠。结果如图8所示，除6及12号小鼠为野生型外，其余均为敲入人源kitlg基因的纯合或杂合小鼠。进一步对非野生型小鼠，用如下引物再次对基因组进行pcr扩增：同源臂引物prime 2f: aaagatggacaccaagaa（seq no .14）同源臂引物prime 2r: ggtcagcaagcacaggga（seq no .15） 如为杂合小鼠，则会出现200bp大小的条带，如为人源化kitlg纯合小鼠，则因为引物间序列长度过长无法扩增。结果如图9所示，1号，2号，4号，7号，8号，11号为人源化kitlg纯合小鼠。
[0055]
3、制备人源化il3 gm-csf kitlg小鼠及其鉴定筛选将上述步骤获得的il3 csf2纯合小鼠和kitlg纯合小鼠进行杂交，得到il3 csf2 kitlg杂合小鼠，再次将此杂合小鼠通过多次同胞交配，并进行pcr鉴定，直到最终获得人源化il3 csf2 kitlg纯合小鼠。具体如下：
将杂交后的f1子代小鼠用上述引物进行pcr扩增：用primer f，primer r1以及primer r2对f1代小鼠的基因组进行pcr扩增；结果如图10a所示，其中3号为敲入人源il3 csf2基因的纯合小鼠。
[0056]
使用prime 1f 以及prime 1r对f1小鼠基因组进行pcr扩增；结果如图10b所示，其中1号，6号，12号为野生型小鼠，其余为敲入kitlg的纯合或杂合小鼠。
[0057]
将剩余非野生型小鼠再次使用prime 2f 以及prime 2r进行pcr扩增；结果如图10c所示，除14号和17号外，其他均为人源化kitlg纯合小鼠。
[0058]
综上所述，根据本次鉴定结果，3号小鼠为敲入人源il3 csf2 kitlg基因的纯合小鼠。
[0059]
鉴定出更多敲入人源il3 csf2 kitlg基因的纯合小鼠后，使用该小鼠制作cd34造血干细胞移植的人源化免疫系统小鼠，进行功能验证。
[0060]
四、人源化免疫系统小鼠的制备及功能验证1、人源化免疫系统小鼠的制备使用上述方法制备的人源化nplg il3 gm-csf kitlg小鼠进行制备：选用新生，或年龄为1至5周龄的人源化nplg il3 gm-csf kitl小鼠。小鼠进行全身辐照清髓，放射源是x射线、或者co60/cs137来源的gamma射线，射线的剂量为0.5-2gy每只小鼠，或者通过给予化疗药物来代替辐照。
[0061]
经辐照或化疗药物处理后，对小鼠尾静脉注射cd34阳性的人源造血干细胞，注射剂量为1
×
104~1
×
106每只小鼠，根据前处理情况，包括辐照剂量及周龄进行调整；干细胞接种12周后，对该人源化免疫系统小鼠的外周血中，人源免疫细胞的比例和亚群进行流式检测，当外周血中人源免疫细胞占总免疫细胞数量超过25%，则说明造模成功。
[0062]
2、人源化免疫系统小鼠功能验证本发明方法获得的人源化免疫系统小鼠的人源免疫细胞及其中的髓系免疫细胞重建情况如图11和图12所示。经过人源cd34造血干细胞移植后，gm-csf和il3过表达小鼠中，髓系免疫细胞所占百分比显著高于普通nplg小鼠中的重建情况，接近外周血免疫细胞的30%。该比例的人源髓系免疫细胞，包括巨噬细胞等，会对宿主小鼠产生较强的排斥作用，且会吞噬小鼠的红细胞，造成贫血并影响小鼠寿命。而nplg il3 gm-csf和kitlg原位敲入小鼠，因可以表达生理水平的相应细胞因子，故其体内的人源髓系免疫细胞更加接近真实情况，介于普通nplg和gm-csf il3过表达小鼠两者之间。
[0063]
不同品系的小鼠经人源化重建后的红细胞及血红蛋白含量如图13和图14所示，可见该原位替换人源细胞因子的nplg il3 gm-csf kitlg基因敲入小鼠，其经重建后，小鼠红细胞和血红蛋白含量相比普通的人源化nplg小鼠略有下降，但相比gm-csf il3过表达小鼠更高。证明该小鼠可在保证基础的免疫细胞功能和数量的基础上，改善小鼠的贫血情况，延长其寿命。
[0064]
从图15不同品系的小鼠经人源化重建后的生存状况来看，证明了采用本发明方法获得的人源化nplg il3 gm-csf kitlg小鼠可以在保证拥有人源髓系免疫功能的同时，有效延长小鼠的寿命，从而使其在药物筛选中具有更大的应用价值。
[0065]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论
从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。