一种GLP-1类似物的半重组制备方法与流程

文档序号:24335578发布日期:2021-03-19 12:15阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种融合基因,其特征在于,所述的融合基因具有以下结构通式:f-l-a;其中,f为伴侣蛋白的编码基因,l为连接肽的编码基因,a为glp-1类似物的编码基因;所述的伴侣蛋白为不含有赖氨酸的酸性蛋白;所述的连接肽的氨基酸序列如seqidno:10或seqidno:11所示;所述的glp-1类似物选自glp-1(7-37)、glp-1(9-37)或glp-1(11-37)多肽类似物。

2.根据权利要求1所述的融合基因,其特征在于,所述的伴侣蛋白为trxa,其氨基酸序列如seqidno:9所示。

3.根据权利要求2所述的融合基因,其特征在于,所述的融合基因核苷酸序列为seqidno:1,其编码的融合蛋白的氨基酸序列为seqidno:5。

4.根据权利要求2所述的融合基因,其特征在于,所述的融合基因核苷酸序列为seqidno:2,其编码的融合蛋白的氨基酸序列为seqidno:6。

5.根据权利要求2所述的融合基因,其特征在于,所述的融合基因核苷酸序列为seqidno:3,其编码的融合蛋白的氨基酸序列为seqidno:7。

6.根据权利要求2所述的融合基因,其特征在于,所述的融合基因核苷酸序列为seqidno:4,其编码的融合蛋白的氨基酸序列为seqidno:8。

7.一种glp-1类似物的半重组制备方法,其特征在于,所述的半重组制备方法包括如下步骤:

s1.构建权利要求1-5任一项所述的融合基因并连接到表达载体上,将顺式助溶蛋白因子dsba表达单元连接到表达载体的下游,将表达载体转化至大肠杆菌中,经筛选得到重组工程菌株;

s2.将步骤s1所得重组工程菌株进行发酵,经诱导表达得到融合蛋白,提取并纯化融合蛋白溶液;

s3.将步骤s2所得融合蛋白溶液与dmf充分混合均匀,用二异丙基乙胺将融合蛋白溶液的ph调节至11-12,并加入一定量的脂肪酸链活化物进行修饰反应;

s4.待步骤s3反应完后加入赖氨酰内切酶进行酶切反应,反应结束后经hplc纯化、冷冻干燥获得glp-1类似物。

8.根据权利要求7所述的半重组制备方法,其特征在于,所述的脂肪酸链活化物为n-棕榈酰基谷氨酸-γ-n-羟基琥珀酰亚胺酯或17-{(s)-1-叔丁氧基羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十七烷酸叔丁酯。

9.根据权利要求7所述的半重组制备方法,其特征在于,所述的脂肪酸链活化物的用量为:1mol融合蛋白加入1.7-2.2mol脂肪酸链活化物。

10.根据权利要求7所述的半重组制备方法,其特征在于,所述的赖氨酰内切酶的用量为:1g融合蛋白加入1-2au赖氨酰内切酶。


技术总结
本发明公开了一种GLP‑1类似物的半重组制备方法。本发明通过将具有融合基因和顺式助溶蛋白因子DsbA的大肠杆菌重组工程菌株进行发酵,经诱导表达得到融合蛋白,提取并纯化融合蛋白,在特定的体外条件下定点化学修饰获得经脂肪酸侧链修饰的融合蛋白分子,最后经特异性酶切获得利拉鲁肽和索马鲁肽分子。所述的融合基因具有以下结构通式:f‑l‑a;其中,f为伴侣蛋白的编码基因,l为连接肽的编码基因,a为GLP‑1类似物的编码基因。本发明结合了重组表达和化学合成的技术优势,具有发酵产量高、可溶性表达蛋白比例高、修饰正确率高、纯化制备简单等特点,适用于工业化放大生产利拉鲁肽和索马鲁肽。

技术研发人员:赖红星;祝捷;马文柱;姚元锋;夏玉平;李正;蒋婷
受保护的技术使用者:珠海冀百康生物科技有限公司
技术研发日:2020.12.24
技术公布日:2021.03.19
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