用于慢性疼痛的多蛋白酶治疗剂

with a neurotoxin to improve patient function,美国专利号6,368,605(2002年4月9日)；stephen donovan,method for treating cancer with a neurotoxin,美国专利号6,139,845(2000年10月31日)；以及mitchell f.brin和stephen donovan,methods for treating diverse cancers,美国专利公布号2005/0031648(2005年2月10日)；
18.h)耳病症，参见例如，stephen donovan,neurotoxin therapy for inner ear disorders,美国专利号6358926(2002年3月19日)；以及stephen donovan,method for treating otic disorders,美国专利号6265379(2001年7月24日)；
19.i)自主神经病症，参见例如，pankai j.pasricha和anthony n.kalloo,method for treating gastrointestinal muscle disorders and other smooth muscle dysfunction,美国专利5,437,291(1995年8月1日)；
20.j)以及其他病症，参见例如，william j.binder,method for treatment of skin lesions associated with cutaneous cell
‑
proliferative disorders,美国专利5,670,484(1997年9月23日)；eric r.first,application of botulinum toxin to the management of neurogenic inflammatory disorders,美国专利6,063,768(2000年5月16日)；marvin schwartz和brian j.freund,method to reduce hair loss andstimulate hair growth,美国专利6,299,893(2001年10月9日)；jean d.a.carruthers和alastair carruthers,cosmetic use of botulinum toxin for treatment of downturned mouth,美国专利6,358,917(2002年3月19日)；stephen donovan,use of a clostridial toxin to reduce appetite,美国专利公布号2004/40253274(2004年12月16日)；以及howard i.katz和andrew m.blumenfeld,botulinum toxin dental therapies and procedures,美国专利公布号2004/0115139(2004年6月17日)；kei roger aoki等人,treatment of neuromuscular disorders and conditions with different botulinum,美国专利公布号2002/0010138(2002年1月24日)；以及kei roger aoki等人,use of botulinum toxins for treating various disorders and conditions and associated pain,美国专利公布号2004/0013692(2004年1月22日)。
21.以下表2提供各种当前已知的肉毒杆菌相关的(bont和tetx)梭菌属毒素的同种型的氨基酸序列。这些毒素彼此具有最少约35％氨基酸同一性且共享相同的功能性结构域组织和总体结构架构。天然存在的梭菌属毒素各自被翻译为约150kda的单链多肽，所述单链多肽的二硫环随后被天然存在的蛋白酶(例如像内源性梭菌属毒素蛋白酶或环境中产生的天然存在的蛋白酶)通过蛋白水解切割作用而裂解。这种翻译后加工产生成熟双链分子，所述分子包含约50kda轻链(lc)和约100kda重链(hc)，二者通过单个链间二硫键和非共价相互作用结合在一起。
22.各成熟双链梭菌属毒素分子包含三个功能上不同的结构域：1)位于lc中的酶结构域，其包含含有特异性地靶向介导突触囊泡与细胞膜的融合的一种或多种snare蛋白的锌依赖性内肽酶活性的金属蛋白酶区；2)含于h链的氨基端半部(称为“h
n”)内的易位结构域，其促进毒素的至少lc链从内体释放至靶细胞的细胞质中；以及3)存在于h链的羧基端半部(h
c
)中的结合结构域，其决定毒素的结合活性和结合特异性。
23.h
c
包含h
cn
和h
cc
亚结构域(分别h
c
的n
‑
末端部分和c末端部分)。现在存在大量证据表明大多数或所有bont/x毒素使用“双重受体”结合靶细胞，其中毒素的包含h
cn
和h
cc
亚结
构域两者的h
c
部分结合某些细胞表面神经节苷脂和蛋白质受体(可能糖基化的)；所述蛋白质受体的结合有助于细胞内的毒素的内化。“x”意指肉毒杆菌毒素的任一血清型。虽然术语“bont/x”通常用于指示肉毒杆菌毒素的血清型，但所述术语还可包括其tetx区。h
cc
结合在靶细胞的表面处复杂定位的受体。
24.应理解存在这些毒素的每种血清型的菌株或亚型；这些可在其氨基酸序列中、特别是(但非排他性地)在所指示毒素或毒素结构域的同一性或活性特征中无显著变化的非关键区(所谓的“可变”区)中在某种程度上不同。
25.在一些表1中，提供标准单字母和三字母氨基酸代码：
26.表1
[0027][0028][0029]
表2
[0030][0031]
本领域的普通技术人员认识到，梭菌属亚型毒素变体可存在于自然中，具有以上所示的氨基酸序列(或编码这些氨基酸序列的核苷酸序列)的变化。如本文所用，术语“天然存在的梭菌属结构域变体”意指由天然存在的过程产生的任何梭菌属结构域(内肽酶、易位和/或结合结构域)，包括但不限于由选择性剪接的转录物产生的梭菌属结构域同工型、由自发突变产生的梭菌属结构域同工型和梭菌属结构域亚型。如本文所用，天然存在的梭菌属结构域变体可与所述天然存在的梭菌属结构域变体所基于的参考梭菌属结构域实质上相同的方式起作用，且在本发明的任何方面中可取代参考梭菌属结构域。
[0032]
天然存在的梭菌属结构域变体可取代来自所述天然存在的梭菌属结构域变体所基于的参考梭菌属结构域的一个或多个氨基酸、两个或更多个氨基酸、三个或更多个氨基酸、四个或更多个氨基酸、五个或更多个氨基酸、十个或更多个氨基酸、20个或更多个氨基酸、30个或更多个氨基酸、40个或更多个氨基酸、50个或更多个氨基酸或100个或更多个氨基酸。天然存在的梭菌属结构域变体还可取代来自所述天然存在的梭菌属结构域变体所基于的参考梭菌属结构域的至少10个连续氨基酸、至少15个连续氨基酸、至少20个连续氨基酸或至少25个连续氨基酸，所述天然存在的梭菌属结构域变体与所述天然存在的梭菌属结构域变体所基于的参考梭菌属结构域具有至少50％氨基酸同一性、65％氨基酸同一性、75％氨基酸同一性、85％氨基酸同一性或95％氨基酸同一性，只要所述天然存在的梭菌属结构域的生物或生物化学活性被基本上保留。还应了解，还可进行保守性氨基酸插入和缺失，只要所述结构域的特征性功能和同一性未基本上改变。
[0033]
由于遗传密码的简并性，本领域的普通技术人员将认识到这些氨基酸序列可由一组有限的具有不同但限定的核苷酸序列的不同dna分子编码。例如，编码给定肽或蛋白质的简并核苷酸序列可具有适于或被选择用于有利于在特定宿主细胞中表达的不同密码子。使用这一信息，能够构建可表达的开放核酸阅读框以用于组装包含这些氨基酸结构域编码区的任何组合的核酸分子，单独地或与另外的核酸序列组合，插入至适合的表达载体中且随后在所选择的宿主细胞中表达。例如，国际专利公布wo01/14570公开制备单链可裂解的重组修饰或未修饰的梭菌属神经毒素衍生物的方法以及使用这类方法制备其嵌合和杂合形式。公开制备可表达的重组神经毒素及其衍生物的方法的另外公布包括美国专利5,989,545；6,203,794；6,395,513；美国公布号u.s.2003/0166238；u.s.2002/169942；u.s.2004/
176299；u.s.2004/126397；u.s.2005/035730；u.s.2005/068494；u.s.2006/011966；国际专利公布w095/32738；wo 99/55359；w096/33273；w098/07864；w099/17806；wo98/07864；wo02/44199；wo02/40506以及2012年10月4日提交的美国专利申请序列号13/644,386。在本专利申请中引用的这些和所有其他专利、专利公布以及非专利公布(无论是否如此具体地指示)据此以引用的方式作为本说明书的一部分单独地并入。
[0034]
使用重组dna技术允许从天然存在的毒素亚型及其菌株构建具有不同或修饰的功能特性的修饰的梭菌属神经毒素。
[0035]
例如，改变天然神经毒素轻链的天然存在的氨基酸序列和/或添加不同的治疗性部分允许构建被设计用于在神经元内携带治疗剂的转运蛋白。参见美国专利号6,203,794(据此以引用的方式并入本文)。
[0036]
改变靶向(细胞结合)结构域允许毒素在胰腺细胞如腺泡细胞内转运，从而防止由这类细胞分泌活化的消化酶，参见美国专利号6,843,998(据此以引用的方式并入本文)；或在感觉传入神经元内转运，从而防止神经递质、细胞因子和特通肽释放且因此提供疼痛缓解；参见美国专利号6,395,513(据此以引用的方式并入本文)。
[0037]
此外，美国专利号7,422,877(据此以引用的方式并入本文)公开了嵌合神经毒素衍生物的产生，所述嵌合神经毒素衍生物包含例如一种神经毒素亚型(例如bont/a)的结合结构域和易位结构域(或其修饰型式)以及另一种神经毒素亚型(例如bont/e)的轻链区。由此可见鉴于神经毒素亚型之间的总体结构同源性，三种基本梭菌属神经毒素结构域的任何组合可在单一氨基酸链中(或在裂解的双链分子中)进行。因此例如，来自神经毒素亚型a、b、c1、d、e、f、g或tetx中的任一种的结合结构域可独立地与来自神经毒素亚型a、b、c1、d、e、f、g或tetx的易位结构域组合，且进一步独立地与来自神经毒素亚型a、b、c1、d、e、f、g或tetx中的任一种的内肽酶结构域组合。这可例如通过重组构建且表达随后裂解以产生双链毒素的单一嵌合链或通过单独表达单一h链和l链来进行，所述单一h链和l链然后通过例如产生链间二硫键且随后纯化进行组合。此外，使用这类技术，可改变不同结构域的活性(例如，可在lc结构域中引入突变以破坏lc的蛋白酶活性)，或可用其他部分置换天然存在的结构域，如本文其他地方所描述，其中例如bont/a的hc结构域(或其一部分)突变或缺失且附加靶向配体(tl)。
[0038]
当讨论每种梭菌属神经毒素亚型的三种一般神经毒素结构域(结合、易位和内肽酶)时，应了解梭菌属神经毒素研究是发展良好的领域，并且矫正包含具有其功能的这些结构域中的每种的氨基酸序列是熟知的。提及这些术语中的每种(“易位结构域”、“结合结构域”、以及“蛋白酶”、“内肽酶”、“lc”或“轻链”结构域)应被理解为包括包含于如表2中列举的seq id no:7
‑
14中列举的梭菌属神经毒素亚型的氨基酸序列中的任一个中的相应结构域以及这些序列或这些序列内的结构域的保守性修饰和优化的变体。
[0039]
另外，这些一般结构域细分成亚结构域也是已知的。例如，结合结构域h
c
细分成亚结构域h
cn
(所述结构域的氨基末端部分，大致对应于bont/a的氨基酸871
‑
1091)和h
cc
(h
c
结构域的羧基末端部分，大致对应于bont/a的氨基酸1092
‑
1296)也是熟知的。参见例如，lacy db和stevens rc,sequence homology and structural analysis of the clostridial neurotoxins,1999,j.mol.biol.291:1091
‑
1104。亚结构域h
cn
在肉毒杆菌毒素亚型之中是高度保守的，然而，关于其功能所知甚少。h
cc
亚结构域是不太保守的。
[0040]
另外，这些结构域和亚结构域各自的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的并且已在本说明书中公开，且因此使用本公开与遗传密码的知识的组合，可制备编码待表达的蛋白质的核苷酸序列。当然，鉴于本说明书对于本领域的普通技术人员来说立即设想编码所指示多肽的其他核苷酸序列将是常规问题。此外，由于遗传密码的冗余，对于每种多肽来说有限数目的核苷酸序列是可能的。此外，清楚的是可合成在同源性区中包含这些核苷酸序列(或它们的独特部分)的含有与参考序列的不超过10％、8％或5％碱基对差异的保守性修饰的变体。
[0041]
此外，应了解在表2和本说明书中其他地方或相关序列表中提出的氨基酸序列提供编码这些氨基酸序列及其指示区域的任何和所有核苷酸序列的完整公开。编码给定神经毒素亚型的内肽酶结构域、易位结构域或结合结构域(包括任何亚结构域)的核苷酸序列分别可与表2或其他地方中列举的这类参考氨基酸序列区域中的任一者具有60％或更大、或65％或更大、或70％或更大、或75％或更大、或80％或更大、或85％或更大、或90％或更大、或95％或更大或100％同一性。
[0042]
肉毒杆菌神经毒素由梭菌属细胞表达，所述细胞还产生与神经毒素非共价缔合以形成血凝素复合物(还被称为祖细胞复合物)的一种或多种非毒素“神经毒素相关蛋白”或nap。这些nap帮助神经毒素在其于污染的食物中消化时抵抗肠中的蛋白酶降解。
[0043]
nap蛋白包括三种血凝素(ha)蛋白(ha1、ha2和ha3)以及非毒性非血凝素蛋白(ntnh)。bont a2型、e型和f型不具有ha基因，并且仅产生包含bont和ntnh的12s(约300kda)复合物。“s”代表斯维德伯格单位(离心沉降率的单位)。b型、c型和d型产生12s和16s(约500kda)复合物；16s复合物包括bont、ntnh、ha1、ha2和ha3。a1型具有12s和16s复合物加约900kda的19s复合物，其可表示16s复合物的二聚体。
[0044]
当前，bont/a1
‑
和/b
‑
血凝素复合物已被批准用于这类临床用途。bont/a1复合物的治疗益处比bont/b的治疗益处更持久，这是由于其在神经元中具有较长寿命的蛋白酶。
[0045]
如以上所指示，bont由轻链相关蛋白酶结构域(lc)组成，所述结构域通过单个共价二硫键和另外非非共价键连接至重链(hc)。hc的羧基末端(c末端)部分(h
c
)结合在各种神经类型(包括运动、自主和感觉神经元)上表达的其特异性受体。当结合靶细胞时，bont分子通过内吞作用转运至囊泡中；hc的氨基末端(n末端)半部(h
n
)形成允许lc从
‘
内体样’膜囊泡易位至细胞溶质中的通道。此后，lc裂解特异性snare蛋白质底物，从而破坏snare介导囊泡
‑
膜融合且因此神经递质、细胞因子和疼痛肽从细胞释放的能力。
[0046]
不同bont血清型的lc是类似的，但不是相同的，并且两个不同的lc可裂解不同的snare蛋白，或不同地裂解同一snare蛋白。例如，lc/a、lc/c和lc/e裂解snap
‑
25；lc/b、lc/d、lc/f和lc/g裂解小突触泡蛋白
‑
2(vamp
‑
2)；此外，lc/c裂解突触融合蛋白，其是据报道为细胞分裂所需的另一种snare蛋白。tetx的lc裂解vamp
‑
2。每种血清型的lc在分子中的独特位置处裂解其底物。
[0047]
例如，bont/a(lc/a)的轻链从snap
‑
25的c末端去除9个氨基酸，而lc/e缺失另外17个c末端残基，并且因此通过通过对稳定的snare复合物去稳定而得到神经
‑
胞外分泌的更具破坏性的阻断(meng等人,2009；wang等人,2011)。例如，通过lc/a抑制神经递质释放通常可通过升高ca
2+
流入逆转，但在lc/e的情况下不能，这可能是由于snap
‑
25底物的更大破坏。然而，尽管通过lc/e更大的活性“稳健性”，因为lc/e诱导仅较短的瞬时神经肌肉麻痹，所以
其临床应用受到限制。
[0048]
高度希望产生具有新特性的治疗剂。例如，其中两种或更多种源自多于一种血清型的轻链内肽酶可组合在bont或tetx衍生物中(其中每个轻链是活性的且识别其底物snare蛋白中的不同氨基酸序列)的治疗剂可被设计成靶向如慢性疼痛、慢性炎性病状(包括关节炎)的病状和/或涉及细胞因子释放的病状。
[0049]
在一个实例中，设计将lc/e的强效蛋白酶与lc/a的长效作用组合的治疗剂。对于提高用于治疗慢性疼痛(包括紧张性头痛/偏头痛和慢性炎性疾病如关节炎)的bont/a的功效来说这是特别重要的，因为bont/a复合物本身据发现在一些但并非所有这类患者中是有效的。参见例如，naumann m.等人(2008)a
ssessment
:b
otulinum neurotoxin in the treatment of autonomic disorders and pain(an evidence
‑
based review):report of the therapeutics and technology assessment subcommittee of the american academy o
f n
eurology 70:1707
‑
1714(据此以引用的方式并入本文)。阻断疼痛相关因子如疼痛蛋白和细胞因子的胞外分泌可证明适用于治疗慢性疼痛、神经性疼痛和炎性病状。
[0050]
当通过活化trpv1(瞬时受体电位香草酸1)(参与大多形式的疼痛的信号转导的阳离子通道)引发时，bont/a不能阻断疼痛刺激肽[例如降钙素基因相关肽(cgrp)和底物p]从感觉神经元的胞外分泌(meng等人,2007；meng等人,2009)。
[0051]
bont/e也未能抑制来自感觉神经元的辣椒素刺激的、trpv1介导的cgrp和物质p释放，这是由于其细胞表面受体(糖基化的突触囊泡蛋白2a(svp2a)和糖基化的svp2b)稀疏或从感觉神经元缺失。然而，其中bont/e的h
c
(受体结合结构域)被来自bont/a的其对应物置换的嵌合蛋白能够阻断这些疼痛介导的肽的释放，从而表明bont/a细胞表面受体有助于lc/e内吞和递送至伤害性c纤维中。
[0052]
一旦在神经元内部，lc/e蛋白酶就去除26个snap
‑
25氨基酸残基，由此防止为神经
‑
胞外分泌所需的稳定snare复合物的形成(meng等人,2009)。虽然lc/a也裂解snap
‑
25，但它仅裂解9个氨基酸残基，并且胞外分泌活性的阻断不太完全和稳定。
[0053]
为了使临床上使用lc/e蛋白酶的这种有利特征变得实际，希望极大地延伸其作用持续时间。
[0054]
附图简述
[0055]
图1是用于通过产生编码经由接头连接至bont/a的n末端lc/a部分的活性lc/e的基因构建体以产生含有两种活性蛋白酶的复合神经毒素lc/e
‑
bont/a而产生复合神经毒素的示意图。
[0056]
图2a是示出使用superflow树脂(由clonetech laboratories,inc.制造)(一种对his6标签(seq id no:15)具有高度灵敏度的co
2+
带电荷的琼脂糖树脂)通过固定金属亲和色谱法(imac)纯化his6标记的(“his6”公开为seq id no:15)lc/e
‑
bont/a构建体的sds
‑
page电泳的照片。
[0057]
图2b示出随后经受阳离子交换色谱法的汇集的含lc/e
‑
bont/a imac级分的洗脱曲线中吸光度和传导率对时间。
[0058]
图3是示出用生物素化的凝血酶处理纯化的lc/e
‑
bont/a以产生双链毒素且除去his6(seq id no:15)标签的sds
‑
page电泳的照片。符号+和
–
分别指示用或不用试剂二硫苏糖醇(dtt)处理以减少连接lc/e
‑
lc/a和hc/a链的二硫键。
[0059]
图4是蛋白质印迹的照片，其中将bont/a(上部凝胶)和lc/e
‑
bont/a(下部凝胶)的连续稀释液针对其裂解培养的大鼠小脑颗粒神经元(cgn)中的snare蛋白snap
‑
25的能力进行测定。
[0060]
图5示出注射lc/e
‑
bont/a、bont/e或bont/a的腓肠肌中肌肉麻痹的持续时间，其中将最大耐受剂量(td
max
)对比天数的时间长度进行绘图。
[0061]
图6a是蛋白质印迹的照片，其中将lc/e
‑
bont/a的连续稀释液与大鼠tgn(三叉神经节神经元)孵育过夜，然后使用抗snap
‑
25和抗突触融合蛋白抗体针对lc/e
‑
bont/a裂解snap
‑
25(主要产生由lc/e产生的26个残基截短的snap
‑
25裂解产生)而不裂解突触融合蛋白的能力测定溶解产物。
[0062]
图6b是lc/e
‑
bont/a的剂量反应曲线，其示出通过60mm kcl引发的a)snap
‑
25的裂解和b)cgrp释放的抑制或c)大鼠tgn中的辣椒素，以及bont/a未能显著降低与bont/a一起孵育的tgn中由辣椒素引发的cgrp释放。
[0063]
图7a是从术前4天至术后约21天进行的用盐水、bont/a或lc/e
‑
bont/a处理动物、接着将爪置于冷(4℃)板中且测量大鼠从所述板缩回其爪所需的时间的大鼠模型保留神经损伤(sni)测试中抗伤害性活动持续时间的曲线图。
[0064]
图7b是从术前4天至术后约21天进行的用盐水、bont/a或lc/e
‑
bont/a处理动物、接着通过对施加校准的von frey毛发到后爪的趾面上的敏感性测量诱导的异常性疼痛的大鼠模型保留神经损伤(sni)测试中抗伤害性活动持续时间的曲线图。
[0065]
图8a是本发明的双蛋白酶多肽的示意图。这种多肽使两种不同的snare蛋白失活：通过lc/b使vamp失活且通过lc/a使snap
‑
25失活。将合成lc/b基因经由接头序列(编码“di”残基)融合至bont/a的5端以产生复合神经毒素lc/b
‑
bont/a。后者还包含两个凝血酶识别序列。
[0066]
图8b说明使用superflow树脂(由clonetech laboratories,inc.制造)通过imac纯化his6标记的lc/b
‑
bont/a的通过考马斯蓝染色的sds
‑
page凝胶。
[0067]
图8c在用生物素化的凝血酶处理以产生双链(dc)毒素之后imac纯化的lc/b
‑
bont/a的sds
‑
page。符号+和
–
分别指示用或不用还原剂二硫苏糖醇(dtt)处理。
[0068]
图8d示出sds
‑
page凝胶的蛋白质印迹，其中将lc/b
‑
bont/a的连续稀释液与大鼠cgn在37℃下孵育24小时。然后使用抗snap
‑
25抗体和抗vamp 2抗体测定溶解产物以监测毒素对两种snare蛋白snap
‑
25和vamp 2的裂解。通过其特异性抗体探测且通过lc/b或lc/a未识别的突触融合蛋白1充当内部负载对照。
[0069]
图8e示出lc/b
‑
bont/a的剂量/反应曲线，其示出在较高浓度的lc/b
‑
bont/a构建体下snap
‑
25(矩形)和vamp 2(倒三角形)的裂解。
[0070]
图9是本发明的另一个实施例，其中多snare裂解治疗性候选物具有是所有三种主要类型的snare蛋白质失活的能力：通过lc/c1使snap
‑
25和突触融合蛋白1
‑
3失活且通过lc/d使vamp1
‑
3失活。di是lc/d与lc/c1之间的接头。
[0071]
图10a是从术前4天至术后约21天进行的用盐水、pk(gmp符合的lc/e
‑
bont/a)或普瑞巴林处理动物、接着用von frey细丝刺激爪且测量大鼠缩回其爪的机械阈值的大鼠模型保留神经损伤(sni)测试中抗伤害性活动持续时间的曲线图。
[0072]
图10b是从术前4天至术后约21天进行的用盐水、pk(使用适于gmp符合生产的方法
制造的lc/e
‑
bont/a)或普瑞巴林处理动物、接着将爪置于冷(4℃)板中且测量大鼠从所述板缩回其爪所需的时间的大鼠模型保留神经损伤(sni)测试中抗伤害性活动持续时间的曲线图。
[0073]
图11是从术前4天至术后约36天进行的用盐水或pk(使用适于gmp符合生产的方法制造的lc/e
‑
bont/a)处理动物、接着用von frey细丝刺激爪且测量大鼠缩回其爪的机械阈值的大鼠模型保留神经损伤(sni)测试中抗伤害性活动持续时间的曲线图。在术后第10天对一组动物进行第二pk注射。
[0074]
发明详述
[0075]
本发明涉及与源自肉毒杆菌神经毒素的治疗性多肽分子相关的方法和组合物。具体地说，所述分子包含至少两个源自不同bont血清型的轻链的活性内肽酶结构域。非常优选地，所述内肽酶结构域识别且裂解其底物中的不同氨基酸序列。尤其优选地，所述内肽酶结构域源自两种或更多种bont血清型，或bont血清型和tetx lc。
[0076]
组合来自选定bont的重链与至少两个不同的活性梭菌属轻链内肽酶结构域的能力提供具有增强的和耐受特性的工程化的治疗分子。这类治疗剂首先通过设计和产生编码两种不同bont血清型的复合物的基因构建体以及展示多重和协同生物活性与治疗应用的重组蛋白的原核表达/纯化来举例说明。
[0077]
通过这类多内肽酶治疗剂阻断胞外分泌可具有累加活性，如阻断痛觉受体运输至感觉神经元的表面。因此，这类治疗剂不仅抑制可溶性突触因子的胞外分泌，而且可抑制为神经膜内部的蛋白质的运输。
[0078]
在未在实施例部分中说明的某些治疗剂中，天然存在的结合结构域可被改变以使得治疗剂重新靶向不同或另外的细胞类型。例如，在aoki等人，美国专利6,776,990中，bont的结合区被人缩胆囊素或其类似物置换，从而使毒素(具有仅单一内肽酶)靶向胰腺腺泡细胞。类似地，在2012年10月4日提交的美国专利申请序列号13/644,386中，在某些实例中靶向配体置换天然存在的结合结构域。在这样一个实例中，编码人白细胞介素
‑
1受体拮抗剂(il
‑
1ra)的基因用于置换天然存在的h
c
区或其部分，从而靶向分泌细胞因子的细胞。
[0079]
例证本发明的当前优选的分子是基于使用分子生物学方法用于产生表达包含融合至活性重组bont/a的lc/a部分的bont/e的lc的蛋白质的核酸构建体的新颖概念。这种独特分子包含lc/e
‑
bont/a(在图1中示出)，其结合bont/a受体(例如，突触囊泡蛋白2和/或神经节苷酯)，经历受体介导的内吞作用且易位至细胞溶质，其中snare蛋白snap
‑
25有效的裂解，从而产生神经递质、细胞因子和疼痛肽释放的抑制。“有效裂解”意指其中大多数snap
‑
25分子具有足够数目的氨基酸裂解以通过提高ca
2+
流量防止胞外分泌阻断的逆转；例如像由通过lc/e裂解snap
‑
25引起。
[0080]
上述构建体优选地被设计成包含位于/a的hc与lc之间的编码特异性氨基酸残基的短序列，所述氨基酸残基由凝血酶蛋白酶选择性地识别和裂解，因此所获得的单链(sc)重组蛋白可通过暴露于凝血酶体外转化成双链(dc)形式。
[0081]
非常优选地，本发明由经由双氨基酸接头(例如，天冬氨酸
‑
异亮氨酸；di)连接至bont/a的lc/a部分的lc/e例证，从而产生新颖的复合毒素。在涉及使感觉神经元暴露于此构建体的实验中，蛋白酶显示被递送在培养的神经元内，并且连接的lc/e被稳定化，其进而产生长效神经性麻痹像lc/a。
[0082]
重要地，与lc/a不同，这种长效分子主要产生具有lc/e特征的蛋白水解产物并且阻断由来自大鼠培养的感觉神经元的辣椒素引发的疼痛介体的释放，这是由于/e裂解的snap
‑
25不能介导神经递质、细胞因子和疼痛肽释放。此外，这种复合蛋白质证明在减弱神经性疼痛(保留神经损伤诱导的)的大鼠模型中的疼痛行为方面比单独lc/a更有效。
[0083]
示例性嵌合分子因此提供作为用于治疗慢性疼痛的治疗剂的主要优点：(a)凭借存在于连接的lc/a中的神经末端保留/稳定化基序，正常瞬时作用/e蛋白酶的高度合乎需要和极大延长的寿命；(b)通过/e蛋白酶显著裂解snap
‑
25使snare复合物不稳定，以及(c)抑制来自感觉神经元的疼痛肽的trpv1介导的胞外分泌。这些新发现突出了展示协同复合作用的这种专有工程化蛋白的抗伤害性潜力。其相对于第一代天然bont的优点已决定性地证明且因此应带来更多改进的治疗剂。
[0084]
因为天然bont仅具有一个蛋白酶结构域，递送额外lc的创新概念—其裂解在不同位置处的相同底物(或另一种底物)—不仅显著增强其抑制特性，而且原始lc/a的额外稳定化影响产生出人意料的协同作用，即相较于bont/e大大延长的治疗益处持续时间。
[0085]
在其他实例中，不同的多内肽酶治疗剂通过使用用于构建lc/e
‑
bont/a核酸的技术构建lc/b
‑
bont/a核酸构建体来举例说明。在表达由lc/e
‑
bont/a开放阅读框编码的多肽且产生凝血酶位点的缺口之后，所得蛋白质裂解snap
‑
25和vamp
‑
2两者。裂解参与突触融合三元复合物的两种snare蛋白可导致更有效。
[0086]
根据本发明的一般概念，提供一种包含梭菌属神经毒素衍生物的组合物，所述梭菌属神经毒素衍生物包含多肽，所述多肽包含：结合结构域、易位结构域、第一内肽酶结构域以及第二内肽酶结构域，其中所述第一内肽酶结构域和所述第二内肽酶结构域各自具有针对snare蛋白的选择性蛋白水解活性且识别snare蛋白中的不同裂解位点。
[0087]
还考虑使用这种一般概念组合物的核酸和治疗方法。此外，还考虑一种用于治疗慢性疼痛的包含梭菌属神经毒素衍生物的治疗性组合物，所述梭菌属神经毒素衍生物包含多肽，所述多肽包含：结合结构域、易位结构域、第一内肽酶结构域以及第二内肽酶结构域，其中所述第一内肽酶结构域和所述第二内肽酶结构域各自具有针对snare蛋白的选择性蛋白水解活性且识别snare蛋白中的不同裂解位点。此外，还考虑包含梭菌属神经毒素衍生物的治疗性组合物用于制造用以治疗慢性疼痛的药剂的用途，所述梭菌属神经毒素衍生物包含多肽，所述多肽包含：结合结构域、易位结构域、第一内肽酶结构域以及第二内肽酶结构域，其中所述第一内肽酶结构域和所述第二内肽酶结构域各自具有针对snare蛋白的选择性蛋白水解活性且识别snare蛋白中的不同裂解位点。
[0088]
根据本发明的优选实施方案，提供一种包含梭菌属神经毒素衍生物的组合物，所述梭菌属神经毒素衍生物包含多肽，所述多肽包含：
[0089]
a)结合结构域，
[0090]
b)易位结构域，以及
[0091]
c)源自梭菌属神经毒素bont/a亚型的第一内肽酶结构域，以及
[0092]
d)源自梭菌属神经毒素bont/e亚型的第二内肽酶结构域。
[0093]
根据本发明的另一个优选实施方案，提供一种编码包含梭菌属神经毒素衍生物的多肽的核酸，所述核酸包含从羧基端至氨基端依次编码以下各项的单个开放阅读框：结合结构域、易位结构域、源自梭菌属神经毒素bont/a亚型的第一内肽酶结构域以及源自梭菌
属神经毒素bont/e亚型的第二内肽酶结构域。
[0094]
根据本发明的另一优选实施方案，提供一种用于治疗慢性疼痛的包含梭菌属神经毒素衍生物的治疗性组合物，所述梭菌属神经毒素衍生物包含多肽，所述多肽包含：结合结构域、易位结构域、源自梭菌属神经毒素bont/a亚型的第一内肽酶结构域以及源自梭菌属神经毒素bont/e亚型的第二内肽酶结构域。
[0095]
根据本发明的另一优选实施方案，提供包含梭菌属神经毒素衍生物的治疗性组合物用于制造用以治疗慢性疼痛的药剂的用途，所述梭菌属神经毒素衍生物包含多肽，所述多肽包含：结合结构域、易位结构域、源自梭菌属神经毒素bont/a亚型的第一内肽酶结构域以及源自梭菌属神经毒素bont/e亚型的第二内肽酶结构域。
实施例
[0096]
实施例1
[0097]
将具有针对在大肠杆菌中的增强表达优化的其密码子和编码lys残基的三个额外核苷酸(aaa)的合成bont/a基因克隆至真核表达载体pet29a(+)的nde i和sal i位点中以产生pet
‑
29a
‑
bont/a。
[0098]
然后将pet
‑
29a
‑
bont/a进一步修饰以便提供受控的特异性缺口和同时除去由pet
‑
29a克隆载体编码的六组氨酸(his6(seq id no:15))标签的能力。将编码凝血酶裂解位点的核苷酸序列工程化至编码毒素的hc/lc环的核酸区中。这在以下以核酸和氨基酸形式分别作为seq id no:1和seq id no:2示出。
[0099]
修饰的bont/a环核苷酸序列(seq id no:1)及其编码氨基酸序列(seq id no:2)
[0100][0101]
此外，另外的凝血酶位点被插入编码所表达蛋白质的hc/a与his6(seq id no:15)区之间的区域。这在以下以核酸和氨基酸形式分别作为seq id no:3和seq id no:4示出。
[0102]
融合至bont/a基因的3’端的核苷酸序列(seq id no:3)及其编码氨基酸序列(seq id no:4)
[0103][0104]
以上提供的核苷酸序列从左至右分别包含以下区：
[0105]
a)核苷酸1
‑
3：编码额外lys的插入的aaa密码子以提供任选的胰蛋白酶裂解位点，以便除去c末端his6(seq id no:15)；
[0106]
b)单下划线：sal i限制性核酸内切酶位点；
[0107]
c)双下划线：hind iii限制性核酸内切酶位点
[0108]
d)粗体：凝血酶识别序列；
[0109]
e)单下划线：pst i限制性核酸内切酶位点；
[0110]
f)双下划线：xho i限制性核酸内切酶位点；
[0111]
g)核苷酸49
‑
66：编码his6(seq id no:15)标签的核苷酸区。对比氨基酸序列在相应核苷酸上方展示。箭头指示凝血酶裂解位点，并且星号表示翻译“终止”密码子。
[0112]
包含上述bont/a开放阅读框且包含seq id no:1和seq id no:3的此核酸构建体被称为pet29a
‑
bont/a
‑
2t。
[0113]
pcr产物(扩增子)是从编码lc/e蛋白酶(残基1
‑
411)的合成核酸扩增的，并且两个限制位点(nde i和eco rv)在扩增期间分别并入在所述核酸扩增子的5’端和3’端。然后将此pcr扩增子通过nde i和eco rv消化且克隆至也用nde i和eco rv消化的pet29a(+)载体中。所得中间载体构建体被称为pet29a
‑
lc/e。
[0114]
将bont/a
‑
2t的上述完整“单链”开放阅读框bont基因区使用pet29a
‑
bont/a
‑
2t作为模板用一对引物(噬菌体t7末端反向引物和含有bont/a5’编码序列上游的ecorv限制序列的正向引物)通过pcr进行扩增。将所得pcr扩增子通过ecorv和xho i酶消化，纯化且插入eco rv
‑
和xho i
‑
裂解的pet29a
‑
lc/e质粒中。此最终构建体被称为pet29a
‑
lc/e
‑
bont/a，并且开放核酸阅读框被公开为seq id no:5，而相应氨基酸序列在本文公开为seq id no:6。
[0115]
实施例2
[0116]
为了表达lc/e
‑
bont/a，将序列验证的构建体转化至大肠杆菌菌株bl21(de3)中，并且使用studier的自动诱导培养基诱导靶蛋白质的表达(studier,f.w.,41protein expr.purif.207(2005))。用固定金属(co
2+
)亲和色谱法(imac)使用talon超流树脂实现细菌溶解产物中的his6(seq id no:15)标记的蛋白质的部分纯化(约60％)。通过大于或等于50mm咪唑洗脱mr约200kda的主要蛋白质；这在图2a中示出，其示出sds
‑
page和凝胶的考马斯蓝染色。凝胶泳道是如下：泳道1：在施加至imac柱之前的澄清溶解产物；泳道2：imac柱流过级分；泳道3：imac柱洗涤级分；泳道4
‑
9，来自imac柱的使用咪唑洗脱的级分。
[0117]
将汇集的imac洗脱级分缓冲交换至0.02m磷酸钠缓冲液(ph6.5)中，且然后通过负载至uno
‑
s1阳离子交换柱上进一步纯化，接着用达150mm nacl洗涤，且然后用nacl梯度洗脱；将毒素用等于或大于220mm的nacl浓度进行洗脱。图2b示出lc/e
‑
bont/a单链多肽随时间变化的洗脱曲线(在280nm下的吸光度)，其中nacl梯度的传导率增加叠加。箭头示出含有lc/e
‑
bont/a的吸光度峰的位置。
[0118]
实施例3
[0119]
在将洗脱的完整毒素缓冲交换至25mm hepes/145mm nacl(ph 7.4)中之后，将纯化的单链(“sc”)蛋白质储存在
‑
80℃下，且取得等分试样以用于sds
‑
page分析。图3示出纯化的多肽的还原(+)和非还原(
‑
)sds
‑
page以及蛋白质印迹分析的结果，从而证实这种纯化的蛋白质确实以sc形式表达，如通过以约200kda的表观分子量迁移的单一条带所揭示。此条带在不存在或存在还原剂的情况下观察到。参见例如图3的考马斯亮蓝染色的凝胶照片的泳道sc(
‑
)和sc(+)。
[0120]
通过与生物素化的凝血酶(1单位/mg蛋白质)在22℃下孵育3小时来尝试这种sc多肽的缺口；然后通过用链霉亲和素琼脂糖处理样品来除去凝血酶蛋白酶。具有约100kda表观分子量的条带在还原条件下在sds
‑
page凝胶上运行的样品中的蛋白质的凝血酶处理之
后出现；约200kda条带在这些条件下未观察到，但存在于在非还原条件下运行的凝胶中，而约100kda条带在这些后者样品中不存在。参见例如图3的考马斯亮蓝染色的凝胶照片的泳道dc(
‑
)和dc(+)。
[0121]
约100kda条带据信表示lc/e
‑
lc/a和hc/a链，其具有类似大小。此条带中的多肽的身份通过使用针对假定单链多肽lc/e和bont/a中的每种特异性的抗体在缺口的和未缺口的lc/e
‑
bont/a上运行的sds
‑
page凝胶的蛋白质印迹得以证实。
[0122]
如图3中所示，在还原剂不存在下缺口的样品基序以约200kda迁移，从而指示lc/e
‑
lc/a与hc/a之间的链间二硫键形成，且在所有样品中存留，如使用抗
‑
lc/e或抗
‑
bont/a抗体在蛋白质印迹标记的(
‑
)和显影的泳道中所示。因此，在还原和非还原条件下的sds
‑
page和蛋白质印迹突出在无复合毒素的降解的情况下发生的环区域处的特异性缺口。未缺口的和缺口的蛋白质的迁移率的略微差异是由于凝血酶处理的样品中his6(seq id no:15)标签的除去；这使用针对此标签的特异性抗体得以证实。参见图3的使用抗
‑
his6(seq id no:15)抗体的蛋白质印迹，其中his6(seq id no:15)标签不可检测。此实验因此还证明凝血酶蛋白酶可同时使hc与第一lc之间的二硫键的连接的半胱氨酸残基之间的毒素缺口，且除去his6(seq id no:15)。
[0123]
实施例4
[0124]
将重组产生的lc/e
‑
bont/a和bont/a各自以0.01pm至1000pm毒素的10倍连续稀释浓度与培养的大鼠小脑颗粒神经元(cgn)孵育过夜。将这些细胞从7
–
8天龄大鼠的小脑解离并且以约1
×
106/ml悬浮于3份的基础伊格尔培养基和1份的40mm hepes
‑
naoh(ph7.3)、78.4mm kcl、37.6mm d
‑
葡萄糖、2.8mm cacl2、1.6mm mgso4以及1.0mm nah2po4以及1x n2补充物、1mm l
‑
谷氨酰胺、60单位/ml青霉素、60μg/ml链霉素以及2％(v/v)马透析血清中。将此细胞悬浮液的等分部分(1ml)添加至16
‑
mm
‑
直径聚
‑
d
‑
赖氨酸涂覆的孔(即24
–
格式)中的每个，并且在5％(v/v)co2中培养20
–
24小时之后添加胞嘧啶
‑
β
‑
d
‑
阿拉伯呋喃糖苷水解酶(40μm)；通过每10天用相同新鲜制备的培养基置换来维持神经元。在规定的情况下，将所述神经元暴露于培养基中的bont/a或lc/e
‑
bont/a(灭菌的0.2
‑
μm过滤器)持续24小时。
[0125]
在与bont/a或lc/e
‑
bont/a蛋白质孵育24小时之后，然后收获细胞且使用识别完整snap
‑
25的抗
‑
snap
‑
25抗体以及lc/a
‑
裂解的snap
‑
25和lc/e
‑
裂解的snap
‑
25使其经受sds
‑
page和蛋白质印迹。snare蛋白质突触融合蛋白1用作阳性内部负载对照。
[0126]
使用抗
‑
snap
‑
25抗体进行蛋白质印迹。如可在图4中观察到，在裂解完整snap
‑
25方面lc/e
‑
bont/a几乎与bont/a活性一样，其中在每种情况下显著裂解在高于1pm的毒素浓度下发生。值得注意的，如可观察到，当使用低于约1pm的毒素时，用lc/e
‑
bont/a处理cgn还得到lc/a裂解产物。当lc/e
‑
bont/a毒素的浓度升高至约0.01nm以上时，此裂解产物(“snap
‑
25
a”)似乎通过共同递送lc/e蛋白酶基本上进一步裂解成lc/e的裂解产物(“snap
‑
25
e”)(图4)。这些结果表明bont/a重链易位结构域能够将共价连接的lc/a和lc/e蛋白酶递送至cgn的细胞溶质，其中所述蛋白酶保持活性以裂解snap
‑
25，从而使snare蛋白全部或部分失活。
[0127]
实施例5
[0128]
lc/e
‑
bont/a的特异性神经毒性通过以据此以引用的方式并入的maisey,e.a.,等人,177e
ur
.j.b
iochem
.683
–
691(1988)中描述的方式腹膜内注射至小鼠中来测定。在4天内杀
死50％小鼠的毒素的最低量被定义为一个最小致死剂量(mld50)。毒素的特异性活性可表示为mld50单位的数目/mg毒素。
[0129]
lc/e
‑
bont/a制剂的mld50据观察为0.7x 108。这种特异性活性介于针对重组bont/e所观察到的特异性活性(0.4x 108)与针对bont/a所观察到的特异性活性(2x 108)之间。使用例如据此以引用的方式并入的aoki,k.r.,39 t
oxicon 1815
‑
1820(2001)中描述的小鼠趾外展评分(das)测定来评定体外神经性麻痹作用的持续时间。
[0130]
将重组lc/e
‑
bont/a以0.5mld
50
单位的剂量注射至小鼠腓肠肌中，其是可施用至实验动物而不产生全身症状的最大耐受剂量。此剂量的lc/e
‑
bont/a引起持续约27天的麻痹；类似于由6单位的天然bont/a诱导的作用；参见图5。相较于bont/e，lc/e
‑
bont/a的长效作用似乎是由于融合蛋白中的lc/a部分稳定化连接的lc/e部分的能力；单独bont/e得到比其他毒素更短的麻痹；参见图5中bont/e对lc/e
‑
bont/a的比较。
[0131]
实施例6
[0132]
使用三叉神经神经节神经元(tgn)检查lc/e
‑
bont/a蛋白的抗伤害性潜力。这些细胞是用于此实验的良好模型，这是由于由于其参与疼痛传播和培养中的这些细胞提供用于研究通过不同刺激物触发的疼痛肽(cgrp，sp)的释放的良好模型；参见例如，bacccaglini和hogan,80p
roc n
atl a
cad s
ci u.s.a.594
‑
598(1983)。从红辣椒分离的辣椒素活化trpv1，其主要在感觉神经元的c
‑
纤维上表达。因此，复合毒素阻断由其激动剂辣椒素引发的cgrp的释放的能力应是其抑制活性的良好指示。
[0133]
bont/a仅从snare蛋白snap
‑
25的c末端除去9个氨基酸残基(“/a
‑
截短的”snap
‑
25裂解产物)，并且不会影响由tgn中的辣椒素引发的cgrp胞外分泌。相比之下，通过lc/e蛋白酶除去17个另外残基(产生“/e
‑
截短的”snap
‑
25裂解产物)阻断这种辣椒素刺激的cgrp释放；参见例如据此以引用的方式并入的meng等人,29j n
eurosci 4981
‑
4992(2009)。
[0134]
因为长效毒素lc/e
‑
bont/a的主要snap
‑
25裂解产物是“/e
‑
截短的”snap
‑
25裂解产物，而不是cgn中的“/a
‑
截短的”snap
‑
25裂解产物(残基图4)，所以预期lc/e
‑
bont/a将阻断cgrp疼痛肽的释放。
[0135]
简言之，在用腹膜内注射dolethal(50mg/kg体重)深度麻醉之后从出生后第5天的wistar大鼠解剖tgn。将所述组织置于冰冷的l15培养基中，且然后在冰冷的无菌cmf
‑
hbss中洗涤两次，之后在170g下离心1分钟。在将所述组织切成小片且通过预先涂覆有l15培养基的10
‑
ml falcon移液管之后，将所述组织在振荡下在37℃下在含有2.4u/ml分散酶ii和1mg/ml胶原酶i的不含钙和镁的hanks平衡盐溶液(cmf
‑
hbss)的1:1混合物中孵育30分钟。然后将悬浮液温和研磨通过预先涂覆l15培养基的10
‑
ml falcon移液管直到浑浊，之后添加1mg/ml dna酶i持续15分钟。
[0136]
在170g下离心5分钟之后，将细胞沉淀悬浮且在培养基[含有10％(v/v)热灭活的胎牛血清(fbs)、100iu/ml青霉素和100μg/ml链霉素的ham's f12溶液(sigma
‑
aldrich,st.louis,mo)]中洗涤三次。将细胞接种到补充有神经生长因子(ngf)(50ng/ml)的f12培养基中的预先涂覆有聚
‑
l
‑
赖氨酸(0.1mg/ml)和层粘连蛋白(20μg/ml)的24孔板上并且在37℃下维持在co2孵育箱中。在24小时之后(且其后的每天)，用含有抗有丝分裂剂胞嘧啶
‑
β
‑
d
‑
阿拉伯呋喃糖苷(10μm)的新鲜培养基替换培养上清液。
[0137]
在37℃下在用lc/e
‑
bont/a的连续稀释液过夜孵育大鼠tgn之后，通过sds
‑
page、
接着使用能够结合完整以及a
‑
截短的和e
‑
截短的产物的抗
‑
snap
‑
25抗体进行蛋白质印迹来监测裂解程度。
[0138]
如图6a中所示，lc/e
‑
bont/a得到snap
‑
25的剂量依赖性裂解，具有主要“/e
‑
截短的”snap
‑
25裂解产物。
[0139]
此外，如所预期，复合毒素以剂量依赖性方式通过由60mm kcl或辣椒素引发的tgn阻断cgrp的释放(图6b)。通过用hbs(用nacl等渗平衡)中的60mm kcl处理刺激ca
2+
‑
依赖性cgrp释放。为了用辣椒素刺激，分别在乙醇或二甲亚砜中制备储备液(1mm)并且在br
‑
hbs中稀释至所需浓度。在所有情况下，将媒介物的最终浓度保持在0.1％；当测量基础流出时这也包括于br
‑
hbs中。
[0140]
将细胞用k
+
或辣椒素刺激并且监测cgrp的释放持续30分钟。为了测定所释放的cgrp的量，将0.1ml的样品添加至涂覆有针对cgrp的单克隆抗体的96孔板，并且按照试剂盒的说明书进行酶免疫测定。
[0141]
所述结果表明lc/e
‑
bont/a多肽抑制从大致密核心囊泡释放疼痛肽的能力，而用bont/a类似处理细胞在活化trpv1阳离子通道时未能抑制cgrp的释放。参见图6b。
[0142]
实施例7
[0143]
在持久性外周神经性疼痛，即保留神经损伤(sni)测定的大鼠模型中评价lc/e
‑
bont/a的抗伤害性活性。此模型是基于以下观察结果：实质上所有神经性疼痛(除了由通过截肢的完全损害引起的幻肢痛的特殊情况)由部分神经损伤造成。这些神经性疼痛包括糖尿病性神经病变、治疗后神经痛、中毒性神经病、压迫性神经病和创伤，并且特征在于自发刺痛、灼痛和休克样疼痛以及痛觉过敏，包括触觉异常痛敏、针刺痛觉过敏和痛觉过敏。
[0144]
sni手术在麻醉的成年大鼠(如spague
‑
dawley大鼠)上进行，并且涉及坐骨神经的末端远端分支中的两个(胫骨和常见腓神经)的连接和横断，其流而下第三分支(腓肠神经)完整；参见以引用的方式并入本文的decosterd,i.&woolf,c.j.,87p
ain 580
‑
587(2000)。此模型具有技术上易于进行且经受所产生的损失程度的最小变化的优点。
[0145]
将所述毒素注射至末端后肢的趾(掌)侧。lc/e
‑
bont/a和bont/a(不影响运动功能)的最大趾内剂量据发现分别是75和15小鼠ld50单位/kg。相较于假对照小鼠(其经受坐骨神经的暴露而无任何损伤)，具有sni的大鼠显示长效神经性疼痛样行为。
[0146]
神经性疼痛的两个模型是冷异常性疼痛和机械异常性疼痛。在第一测试中，冷超敏性的那些，将手术的爪与在4℃下的冷板相接触，并且在不同时间点记录爪缩回持续时间，如图7a中所示。作为冷超敏性调节的测量，处理后值被表示为处理前值的百分比。
[0147]
如图7a所示，在处理之后冷超敏性通过lc/e
‑
bont/a有效降低持续2周(相较于盐水处理的p<0.001)，特别是持续前10天。lc/e
‑
bont/a的抗伤害性作用显著大于由bont/a诱导的抗伤害性作用(在注射后第5天和第7天p<0.05)。无论给予毒素还是盐水，在假对照中未观察到冷诱导的异常性疼痛。
[0148]
在第二测试中，通过将动物置于升高的丝栅上且用一组von frey毛发刺激处理的爪的趾表面以测定在检测到疼痛(由爪的敏锐缩回指示)之前能够耐受的感觉刺激的量来测量机械异常性疼痛。将von frey毛发(或单丝)校准以提供大约实际力的对数尺度，以及感知强度的线性尺度。机械阈值表示为引起爪缩回所需的平均最小克的力的50％。
[0149]
如在图7b中所示，机械阈值通过神经损伤显著降低(将假对照与仅给予盐水的sni
大鼠相比较)。令人鼓舞地，lc/e
‑
bont/a开始在注射之后2天内逆转这种机械超敏性，并且在处理后7天观察到镇痛作用的最大值。在注射之后3至10天记录比盐水处理的大鼠显著更高的机械阈值(对比盐水p<0.001)。此外，即使用bont/a处理诱导损伤后机械阈值的适度增加，但lc/e
‑
bont/a据发现显著更有效(p<0.05)。
[0150]
当施用至假动物时，毒素和盐水均不影响通过冷和机械刺激触发的疼痛行为(图7a、b)。lc/e
‑
bont/a证明在降低冷缩回持续时间方面比bont/a更有效(图7a)并且尤其增加机械缩回阈值(图7b)。重要地，将lc/e
‑
bont/a注射至对冷和机械刺激具有sni标准化灵敏度的大鼠中在第3天和第7天至类似于所有假对照的那些的值。总之，lc/e
‑
bont/a诱导在慢性神经性疼痛的大鼠模型中诱导强效抗伤害性作用。
[0151]
实施例8
[0152]
以下提供的复合合成神经毒素开放阅读框lc/e
‑
bont/a基因序列及其编码氨基酸(分别seq id no:5和6)分布包含以下区(相对于核苷酸氨基鉴定的)：残基1
‑
1233，lc/e；残基1240
‑
5130，bont/a。包含核苷酸(1234
‑
1239)的dna序列作为接头引入且确保正确阅读框。对比氨基酸序列在相应核苷酸上方展示。将凝血酶蛋白酶识别序列插入lc/a与hn/a之间的环中；类似地，将另一个凝血酶位点工程化为具有bont/a基因的羧基位点的裂解序列；这些允许同时缺口和c
‑
末端his6(seq id no:15)的去除。
[0153]
复合神经毒素基因(lc/e
‑
bont/a)序列及其编码氨基酸(seq id no:5和6)
[0154]
[0155]
[0156]
[0157]
[0158][0159]
本发明的此实施例解决了现有技术提出的至少两个主要问题。首先，它提供长效bont嵌合体，其具有扩大的抗伤害性治疗潜力。第二，它提供对于慢性疼痛治疗具有独特潜力的长效bont来源的治疗剂。
[0160]
管理慢性疼痛对现代医疗保健提出主要挑战，因为患者代表超过20％的成人群体。相当大部分的群体对通常使用的止痛药无反应。另外，与处方鸦片制剂的挥霍相关的药物依赖和滥用的增加和在大多数情况下针对疼痛原始开处方的许多麻醉剂的短半衰期使类鸦片制剂和非类固醇抗炎药物的使用成为无吸引力的选择。
[0161]
bont/a复合物的治疗性用途证明有益于一些而不是所有偏头痛患者，这是由于假定疼痛途径的假定干扰。bont/a未能减弱由由疼痛肽或原位c
‑
纤维的trpv1活化引发的神经元方便并且不能阻断来自培养的神经元的cgrp释放突出有必要开发长效且更广泛有效的形式。
[0162]
bont/a和bont/e的bont
‑
衍生物嵌合体成功进入tgn，并且得到/e
‑
样snap
‑
25裂解产物，其进而抑制疼痛介体的释放；然而，其短作用持续时间限制临床应用。
[0163]
本发明将不同血清型的至少两种bont的结构域组合在一起以产生新颖治疗剂。这种创新策略可用于产生其他嵌合多链治疗剂，包括包含来自不同bont血清型的多个lc以产生具有所需特性的治疗剂的构建体；例如多
‑
snare
‑
裂解毒素(裂解不同的snare蛋白质)治疗剂，其可例如通过将lc/c1连接至bont/a而不是lc/e来构建。
[0164]
实施例9
[0165]
在另一个实施例中，以基本上类似于上述的方式通过用合成lc/b基因取代lc/e
‑
bont/a核酸中的lc/e基因以产生编码作为单一开放阅读框的lc/b
‑
bont/a的最终质粒来产生多内肽酶构建体。
[0166]
为了表达lc/b
‑
bont/a，将序列验证的构建体转化至大肠杆菌菌株bl21(de3)中，并且如先前针对lc/e
‑
bont/a所描述表达所得蛋白质。部分纯化来自澄清的细菌溶解产物的his6‑
标记的毒素使用imac亲和分离步骤使用talon超流树脂实现。通过≥150mm咪唑洗脱mr约200k的主要蛋白质；这在图8b中示出，其示出在还原条件下的sds
‑
page和凝胶的考马斯蓝染色。凝胶泳道是如下：泳道1：在施加至imac柱之前的澄清溶解产物；2：imac柱流过级分；3：imac柱洗涤级分；4
‑
8，使用咪唑洗脱的级分。
[0167]
将汇集的imac洗脱液缓冲交换至25mm hepes/145mm nacl(ph 7.4)中并且通过sds
‑
page分析等分部分。图8c示出纯化的蛋白质的sds
‑
page，其中等分部分在还原(+)和非还原(
‑
)下电泳。电泳证实蛋白质确实以单链(“sc”)形式表达，如由异约200kda的表观分子量迁移的主要条带揭示。此条带在不存在或存在还原剂的情况下观察到。参见例如图8c中的考马斯亮蓝染色的凝胶的泳道sc(
‑
)和sc(+)。
[0168]
通过与生物素化的凝血酶(1单位/mg毒素)在22℃下孵育3小时来实现这种单链蛋白质的缺口(和his6标签的除去)；然后通过用固定在琼脂糖上的链霉亲和素处理样品来除去凝血酶蛋白酶。具有约100k表观分子量的两个条带(未通过sds
‑
page良好解析，这是由于两个蛋白质链的迁移率的相似性)在于还原条件下在sds
‑
page凝胶上运行的样品中蛋白质的凝血酶处理之后出现；约200k条带未在这些条件下观察到，但存在于在非还原条件下运行的凝胶中，而约100kda条带在这些后者样品中不存在。参见例如图8c中的考马斯亮蓝染色的凝胶的泳道dc(
‑
)和dc(+)。约100k条带据信表示lc/b
‑
lc/a和hc/a链，其具有大小的较小差异。
[0169]
将大鼠培养的小脑颗粒神经元(cgn)与凝血酶处理的lc/b
‑
bont/a以0.32pm至5000pm的5倍连续稀释浓度孵育。在37℃下在与lc/b
‑
bont/a孵育24小时之后，然后守活细胞且使其经受sds
‑
page和蛋白质印迹，使用a)识别完整snap
‑
25用lc/a处理的大裂解产物的抗
‑
snap
‑
25抗体和b)拾取完整型式的抗
‑
vamp2抗体。抗突触融合蛋白1抗体用于检测snare蛋白突触融合蛋白1，其用作阳性内部负载对照。来自多个印迹的代表性蛋白质印迹(图8d)和定量数据(图8e)表明lc/b
‑
bont/a裂解snap
‑
25以及vamp2；然而，vamp2在较高浓度的lc/b
‑
bont/a下有效裂解。虽然不希望受理论约束，但这一结果可能起因于将降低vamp裂解的bont/a的lc[fern
á
ndez
‑
salas等人,proc.natt.acad.sci.usa.2004,101(9):3208
‑
3213]。
[0170]
实施例10
[0171]
如由来自lc/e
‑
bont/a(识别同一底物的两个不同序列的两种活性蛋白酶)和lc/b
‑
bont/a(裂解两种不同底物的两种蛋白酶)的阳性功能结果所说明，且鉴于本专利申请的公开内容，本领域的技术人员将意识到本发明的另外实施例可涉及用于通过组合用于抑制来自不同神经类型(例如感觉神经元和交感神经元)的疼痛肽、细胞因子和神经递质的释放的不同梭菌属神经毒素或梭菌属神经毒素亚型来产生各种其他多内肽酶治疗剂的组合物和方法。此外，多蛋白酶毒素的作用活性将间接阻断细胞因子释放细胞的这类介体的活性。
[0172]
例如，使所有三种snare蛋白质失活的单一治疗剂通过将bont/d的轻链(lc/d)经由接头重组融合至bont/c1的n末端来产生(残基图9)。简言之，将编码lc/d内肽酶的核酸“框内”插入lc/e
‑
bont/a中以置换lc/e。编码lc/d的合成基因被设计为具有针对在大肠杆菌中最佳表达优化的密码子。所得质粒编码包含lc/d
‑
bont/a的中间体蛋白质。
[0173]
随后，编码bont/c1的合成基因(像bont/a构建体，在其环区域中具有凝血酶裂解位点)用于置换lc/d
‑
bont/a中的bont/a基因以产生包含lc/d
‑
bont/c1开放阅读框的最终核酸构建体。所表达的纯化的和缺口的lc/d
‑
bont/c1治疗剂将具有通过用lc/d裂解使vamp 1
‑
3失活的能力；lc/c1蛋白酶将裂解突触融合蛋白1
‑
3和snap
‑
25。这种构建体将适合用于治疗慢性炎性和神经性疼痛。
[0174]
实施例11
[0175]
60岁男性在左髋中具有严重慢性关节疼痛，并且行走困难。在检查之后，患者被诊断为患有髋臼股(髋)关节的类风湿性关节炎。
[0176]
通过直接注射至股骨神经节和坐骨神经节中来向所述患者施用有效量的梭菌属神经毒素衍生物lc/e/bont/a。如上所述制备基因构建体且在其表达之后使用his6标签(seq id no:15)亲和纯化梭菌属毒素衍生物，接着凝血酶缺口且在使用之前离子交换色谱
法。
[0177]
在48小时内，存在疼痛程度和剧烈的显著改善，并且在一周内患者能够不费力的行走。
[0178]
实施例12
[0179]
用于人使用的足够量的梭菌属神经毒素衍生物lc/e/bont/a的计划最终需求使用于表达和纯化与在良好生产规范(gmp符合的)设备中生产相容的lc/e
‑
bont/a蛋白质的生产/纯化平台成为必要。lc/e
‑
bont/a蛋白质的按比例扩大的生产和纯化实质上如上针对工作台规模实验所述进行。此过程产生在sds
‑
page中具有预期表观分子量(约200kda)的纯活化产物。在还原链间二硫键之后，hc链和lc/e
‑
lc/a链在还原sds page凝胶上共迁移，各自具有约100kda的表观分子量；用考马斯亮蓝染色揭示与图3中所示的迁移图案基本上相同的迁移图案。使用适于gmp符合生产的方法制造的lc/e
‑
bont/a被称为“pk”。
[0180]
用于裂解snap
‑
25的gmp pk蛋白的活性及其在小鼠中的特异性神经毒性匹配在工作台规模下产生的相同蛋白质的活性和特异性神经毒性。类似地，pk的抗伤害性潜力通过其结合且进入感觉神经元的能力得以证明，从而主要产生lc/e
‑
截短的snap
‑
25且抑制去极化或辣椒素刺激的cgrp释放，如通过用pk材料重复实施例6的实验并且获得与图6a和6b中所示的那些基本上相同的结果所示。
[0181]
最重要地，这种有前景的pk蛋白向在工作台规模下产生的lc/e
‑
bont/a蛋白还证明体内同等稳健抗伤害。在慢性疼痛的保留神经损伤(sni)模型(参见例如实施例7和图7a和7b)将pk单次注射至大鼠的一个后爪中不会影响运动活性(如在旋转棒上所定量)或诱导任何可检测的副作用，但在14天的延长时间段内减轻对假组的对照水平的机械超敏性。此外，在sni模型中升高水平的冷异常性疼痛也类似地减弱，如通过缩回持续时间的显著减少所示。将盐水媒介物注射至假手术动物不会改变在例如图7a和7b中测量的两个伤害性参数的基线水平。pk蛋白令人信服地减轻升高水平的疼痛。
[0182]
这些发现证明是从多组广泛动物实验可再现的并且突出pk用于逆转由于严重神经损伤所致的剧烈疼痛的体内治疗功效，并且揭示单独bont/a用于治疗疼痛、特别是慢性疼痛的不适当。
[0183]
实施例13
[0184]
这种新颖gmp
‑
样抗伤害性的高效率进一步通过在涉及每日全身(i.p.)施用10mg/kg普瑞巴林的单次注射(75u/kg)pk的sni模型中评定来证明，普瑞巴林是在临床上用作神经性疼痛的一线治疗、还已知施加显著不良反应且在一定比例的患者中具有有限镇痛作用的镇痛药物。
[0185]
再次使用大鼠中慢性疼痛的保留神经损伤(sni)和冷异常性疼痛模型以及如在先前段落中相同剂量的活性剂，单次足底注射pk产生比每日普瑞巴林的益处持续时间长得多的益处持续时间，与pk相比，普瑞巴林不能显著实现机械超敏性的逆转(图10a)并且诱导对冷的升高反应性的更适度减弱(图10b)。pk的第二注射延长其在机械敏感性(图11)和冷异常性疼痛(未图示)方面的强效镇痛作用，从而产生在初始治疗之后持续超过25天的显著高于对照基线的疼痛缓解。
[0186]
本发明不限于本文所述的实施方案，而是可在不脱离本发明的范围的情况下修正或修改。
[0187]
现将通过下文以权利要求格式提出的以下组的实施方案描述本发明。
[0188]
1)一种组合物，其包含梭菌属神经毒素衍生物，所述梭菌属神经毒素衍生物包含多肽，所述多肽包含：结合结构域、易位结构域、第一内肽酶结构域以及第二内肽酶结构域，其中所述第一内肽酶结构域和所述第二内肽酶结构域各自具有针对snare蛋白的选择性蛋白水解活性且识别snare蛋白中的不同裂解位点。
[0189]
2)如权利要求1所述的组合物，其中所述结合结构域、所述易位结构域、所述第一内肽酶结构域以及所述第二内肽酶结构域包含在单一多肽链中。
[0190]
3)如权利要求2所述的组合物，其中所述多肽还包含选择性内肽酶裂解位点，所述选择性内肽酶裂解位点位于包含所述结合结构域和所述易位结构域的第一区域与包含所述第一内肽酶结构域和所述第二内肽酶结构域的第二区域之间。
[0191]
4)如权利要求1所述的组合物，其中所述结合结构域、所述易位结构域、所述第一内肽酶结构域以及所述第二内肽酶结构域包含在多于一个多肽链中。
[0192]
5)如权利要求4所述的组合物，其中至少两个所述多肽链通过二硫键连接。
[0193]
6)如权利要求1所述的组合物，其包含第一多肽链，所述第一多肽链包含所述结合结构域和所述易位结构域；以及第二多肽链，所述第二多肽链包含所述第一内肽酶结构域和所述第二内肽酶结构域。
[0194]
7)如权利要求5所述的组合物，其包含第一多肽链，所述第一多肽链包含所述结合结构域和所述易位结构域；以及第二多肽链，所述第二多肽链包含所述第一内肽酶结构域和所述第二内肽酶结构域。
[0195]
8)如权利要求1所述的组合物，其中所述结合结构域和所述易位结构域源自第一梭菌属神经毒素或梭菌属神经毒素亚型，并且其中所述第一内肽酶结构域和所述第二内肽酶结构域中的至少一个源自第二梭菌属神经毒素或梭菌属神经毒素亚型。
[0196]
9)如权利要求8所述的组合物，其中所述结合结构域、所述易位结构域以及所述第一内肽酶结构域和所述第二内肽酶结构域中的至少一个源自第一梭菌属神经毒素或梭菌属神经毒素亚型。
[0197]
10)如权利要求9所述的组合物，其中所述结合结构域、所述易位结构域和所述第一内肽酶结构域源自第一梭菌属神经毒素或梭菌属神经毒素亚型，并且所述第二内肽酶结构域源自第二梭菌属神经毒素或梭菌属神经毒素亚型。
[0198]
11)如权利要求10所述的组合物，其中所述第一梭菌属神经毒素或梭菌属神经毒素亚型是bont/a，并且所述第二梭菌属神经毒素或梭菌属神经毒素亚型是bont/e。
[0199]
12)如权利要求11所述的组合物，其中所述第一梭菌属神经毒素或梭菌属神经毒素亚型是bont/a，并且所述第二梭菌属神经毒素或梭菌属神经毒素亚型是bont/c1。
[0200]
13)如权利要求11所述的组合物，其包含第一多肽链，所述第一多肽链包含所述结合结构域和所述易位结构域；以及第二多肽链，所述第二多肽链包含所述第一内肽酶结构域和所述第二内肽酶结构域。
[0201]
14)如权利要求13所述的组合物，其中所述第一多肽链和所述第二多肽链通过二硫键连接。
[0202]
15)如权利要求11所述的组合物，其中所述结合结构域、所述易位结构域、所述第一内肽酶结构域以及所述第二多肽链全部包含在单一多肽链中。
[0203]
16)如权利要求11所述的组合物，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列包含位于所述易位结构域与所述第一内肽酶结构域之间的第一蛋白酶裂解位点。
[0204]
17)如权利要求11所述的组合物，其还包含：
[0205]
a)聚组氨酸氨基酸序列，其位于所述结合结构域的羧基端侧上或所述第二内肽酶结构域的氨基端处；
[0206]
b)第一氨基酸序列，其包含位于所述易位结构域与所述第一内肽酶结构域之间的第一蛋白酶裂解位点；以及
[0207]
c)第二氨基酸序列，其包含位于所述第二内肽酶结构域与所述聚组氨酸氨基酸序列之间或所述结合结构域与所述聚组氨酸氨基酸序列之间的第二蛋白酶裂解位点。
[0208]
18)一种编码包含梭菌属神经毒素衍生物的多肽的核酸，所述核酸包含从羧基端至氨基端依次编码以下各项的单个开放阅读框：结合结构域、易位结构域、第一内肽酶结构域以及第二内肽酶结构域，其中所述第一内肽酶结构域和所述第二内肽酶结构域各自具有针对snare蛋白的选择性蛋白水解活性且识别snare蛋白中的不同裂解位点。
[0209]
19)如权利要求18所述的核酸，其中编码所述结合结构域、所述易位结构域、所述第一内肽酶结构域以及所述第二内肽酶结构域中的每个的密码子针对在选自由以下各项组成的组的细胞类型中表达而进行优化：细菌细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞以及昆虫细胞。
[0210]
20)如权利要求19所述的核酸，其中所述密码子针对在大肠杆菌细菌细胞中表达而进行优化。
[0211]
21)如权利要求18所述的核酸，其中至少两个选自由所述结合结构域、所述易位结构域、所述第一内肽酶结构域以及所述第二内肽酶结构域组成的组的结构域由源自选自由以下组成的组的不同梭菌属神经毒素或梭菌属神经毒素亚型的核酸序列编码：bont/a、bont/b、bont/c1、bont/d、bont/e、bont/f、bont/g以及tetx。
[0212]
22)如权利要求21所述的核酸，其中所述第一内肽酶结构域和所述第二内肽酶结构域由源自选自由以下组成的组的不同梭菌属神经毒素或梭菌属神经毒素亚型的核酸序列编码：bont/a、bont/b、bont/c1、bont/d、bont/e、bont/f、bont/g以及tetx。
[0213]
23)如权利要求22所述的核酸，其中所述第一内肽酶结构域由源自bont/a的核酸序列编码，并且所述第二内肽酶结构域由源自bont/c1的核酸序列编码。
[0214]
24)如权利要求22所述的核酸，其中所述第一内肽酶结构域由源自bont/a的核酸序列编码，并且所述第二内肽酶结构域由源自bont/e的核酸序列编码。
[0215]
25)如权利要求24所述的核酸，其中所述开放阅读框编码核苷酸序列(所述核苷酸序列编码内肽酶结合结构域)与终止密码子之间的至少六个组氨酸残基。
[0216]
26)一种治疗慢性疼痛的方法，所述方法包括施用包含梭菌属神经毒素衍生物的治疗性组合物，所述梭菌属神经毒素衍生物包含多肽，所述多肽包含：结合结构域、易位结构域、第一内肽酶结构域以及第二内肽酶结构域，其中所述第一内肽酶结构域和所述第二内肽酶结构域各自具有针对snare蛋白的选择性蛋白水解活性且识别snare蛋白中的不同裂解位点。
[0217]
27)如权利要求26所述的方法，其中所述慢性疼痛选自由以下组成的组：炎性伤害性疼痛和神经性疼痛。
[0218]
28)如权利要求27所述的方法，其中所述慢性疼痛是神经性疼痛。
[0219]
29)如权利要求28所述的方法，其中所述神经性疼痛选自由以下组成的组：癌症疼痛、术后疼痛、神经性疼痛、异常性疼痛、疱疹后神经痛、肠易激综合症以及其他内脏痛、骨痛、周围神经病变、循环系统附属疼痛以及头痛疼痛。
[0220]
30)如权利要求27所述的方法，其中所述慢性疼痛是炎性伤害性疼痛。
[0221]
31)如权利要求27所述的方法，其中所述慢性疼痛是关节炎疼痛。
[0222]
32)如权利要求26所述的方法，其中所述治疗性组合物的所述结合结构域和所述易位结构域源自第一梭菌属神经毒素或梭菌属神经毒素亚型，并且其中所述组合物的所述第一内肽酶结构域和所述第二内肽酶结构域中的至少一个源自第二梭菌属神经毒素或梭菌属神经毒素亚型。
[0223]
尽管已参考所公开的实施方案描述了本发明的各个方面，但本领域的技术人员将显而易见，所公开的特定实施例仅说明所述方面且决不限制本发明。可在不脱离本发明的精神的情况下进行各种修改。本文描述的每个和各个特征以及这类特征的每个和各个组合包括在本发明的范围内，条件是包括在所述组合中的特征不是互相对立的。此外，本发明的任何组合物或装置应理解为包括权利要求的一个或多个要素、基本上由权利要求的一个或多个要素组成或由权利要求的一个或多个要素组成，并且此外未明确包括作为权利要求的要素的每个和各个要素应视为在本文具有明确排除对所述权利要求的负面限制的基础。
[0224]
在本说明书中引用的任何和所有专利、公布、专利申请以及通过登录号提及的核苷酸和/或氨基酸序列据此以引用的方式作为本说明书的一部分整体并入。