本发明涉及以高纯度纯化抗体的方法。
背景技术：
近来，单克隆抗体作为药物引起了极大关注和期待。抗体由于其对靶标抗原的特异性结合能力，因此被期待具有高功效和更少的副作用，并且特别是作为抗癌剂受到关注。
许多治疗性抗体是通过使用cho细胞作为宿主的生产系统制造的（非专利文献1）；但是，细胞培养上清液不仅含有作为期望产物的抗体，而且也含有源自宿主细胞的杂质（例如，蛋白、dna），产物相关杂质（例如，聚集体、变体），以及病毒样颗粒。已知由于源自宿主细胞的蛋白（宿主细胞蛋白；hcp）被人类识别为异源蛋白，因此其不仅具有抗原性，而且还具有致瘤风险。担心源自宿主细胞的dna也具有致瘤性。作为产物相关杂质的聚集体可能具有免疫原性，并且经过翻译后修饰的片段和期望蛋白在安全性和有效性上具有不利影响。此外，还担心内源性病毒和源自内源性病毒的dna具有传染性。还需要采取措施防止外源性病毒的污染。大多数情况中，重要的是采取措施以避免被来自细胞系（例如，主要用于生产中的cho细胞）、培养基原材料和制备的培养基的外源性病毒污染的风险，和通过测试诸如体外和体内病毒测试来确认不存在可能在生产工序中混入的代表性病毒的污染。进而，必须通过评价纯化工序中的代表性病毒的降低和去除率来尽可能地减少最终获得的原料药的病毒污染的风险，并由此生产安全的药物。因此，在纯化工序中，需要建立纯化方法，用于有效和可重复地去除杂质，同时以高产率回收抗体（期望产物）。
为上述目的而开发的抗体纯化方法组合使用多步层析。通常使用包括蛋白a层析的亲和层析、离子交换层析、疏水相互作用层析和陶瓷羟基磷灰石层析。基于期望产物和杂质的电荷、疏水性程度或分子大小，或期望产物与固定化配体之间的特异性结合功能，源自宿主细胞的杂质、产物相关杂质、浸出蛋白a和病毒样颗粒可通过这些层析而被有效地分离和去除。
特别地，作为抗体纯化的一般色谱方法，许多文献报道了通过组合使用三个色谱步骤将抗体纯化为高纯度的方法：蛋白a层析、阴离子交换（aex）色谱和阳离子交换（cex）色谱。这些层析通常以结合/洗脱（b/e）模式或流动-通过（f/t）模式进行。这些模式中，在蛋白a层析和cex层析中，经常使用其中抗体（期望产物）被捕获到例如树脂上，然后在适当条件下将杂质分离的b/e模式。由于以b/e模式进行的蛋白a层析和cex层析，除了杂质中包括内源性病毒的病毒的去除之外，可以高度地纯化期望产物。但是，在b/e模式中，由于期望产物被捕获到例如树脂上，因此需要大量的树脂和大尺寸的柱子，这会增加生产成本。
同时，随着最近的技术进步，已经报道了通过包括过载模式的f/t模式的cex层析的纯化方法。使抗体（期望产物）通过柱子，同时将杂质吸附到例如树脂上，所述杂质的量低于产物的量。这样，可以减小柱的尺寸，并且可以更简便且有效地进行该操作工序，结果可以减少层析树脂的使用量，实现成本降低。实际上，在常规使用的b/e模式中，即使使用高性能树脂，生产量也为100g/l树脂或更少；而在f/t模式中，即使生产量为1000g/l树脂或更多，换而言之，即使样品量增加10倍，也可以纯化期望产物。换而言之，由于即使将树脂量减少到1/10或更少，也能够得到相同的纯化性能，因此可以期待减小柱的尺寸，实现成本降低。柱尺寸的减小引起所用缓冲液体积、罐尺寸和工作负荷的减小。这种显著的减小有助于生产效率的改善（在专利文献1，非专利文献2和非专利文献3中报道）。但是，期望达到高效纯化步骤的cex层析的f/t模式中，由于共存的杂质通过吸附到例如少量的树脂上而被分离/去除，因此与b/e模式中不同，分离性能受到共存的杂质的量和种类的影响，这成为问题。
进而，近来，培养工序中的生产率已得到改进。根据该改进，大量的细胞培养产物开始被加载到层析柱上，结果层析柱上的负担增加。为了解决该问题，提出了将被期待作为高效率纯化步骤的以f/t模式进行的aex层析和cex层析与活性炭材料组合使用，并报道了包括hcp的杂质的量得到减少，结果可以延长层析柱的寿命（专利文献2）。
但是，这些报道仅仅阐述了去除源自宿主细胞的一般杂质（蛋白、dna）和源自期望产物的产物相关杂质（例如，聚集体,变体）的可能性。因此，期望开发一种特定的纯化工序，其不仅实现作为纯化工序的基本功能而期望的源自宿主细胞的杂质和产物相关杂质的可靠去除，而且还以低成本实现内源性和外源性病毒的可靠去除。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开号wo2011/150110
专利文献2：国际公开号wo2013/028330
非专利文献
非专利文献1：reichert,j.（2012）.marketedtherapeuticantibodiescompendium.mabs4:3,413-415.
非专利文献2：brown,a.,bill,j.,tully,t.,radhamohan,a.,&dowd,c.（2010）.overloadingion-exchangemembranesasapurificationstepformonoclonalantibodies.biotechnol.appl.biochem.,56:59-70.
非专利文献3：liu,h.f.,mccooey,b.,duarte,t.,myers,d.e.,hudson,t.,amanullah,a.,vanreis,r.,&kelley,b.d.（2011）.explorationofoverloadedcationexchangechromatographyformonoclonalantibodypurification.j.chromatogr.a.,1218,6943-6952。
技术实现要素：
发明要解决的问题
与b/e模式不同，被期待作为高效率纯化步骤的cex层析的f/t模式具有下述问题：分离性能受到共存杂质的量和种类的影响。在将以f/t模式进行的aex层析和cex层析与活性炭材料组合使用的抗体纯化方法中，可以延长层析柱的寿命，但随之而来的问题是需要多个纯化步骤。更具体地，因为不仅进行蛋白a层析、aex层析和cex层析这三个层析步骤，而且还进行利用活性炭材料的处理步骤，多个纯化步骤增加了生产成本和纯化周期。在减少纯化工序步骤数目以减少成本中，存在不仅去除源自宿主细胞的杂质和产物相关杂质的性能可能降低，而且内源性和外源性病毒清除率也可能降低的担忧。因此，杂质的可靠去除，特别是内源性和外源性病毒清除率是重要目的。如果达到该目的，不仅可以提供以低成本且具有高效率的治疗性抗体的制造方法，而且可以稳定供给高品质的治疗性抗体，结果患者的安全性得以确保。因此，从工业观点出发，达到该目的是极其重要的。
用于解决问题的方案
本发明人为了达到该目的进行了深入研究。作为结果，他们发现了在保持与常规纯化方法相当的质量的同时减少了纯化步骤的数目的有效的纯化方法。更具体地，他们发现了期望抗体药物能够通过以f/t模式进行的cex层析与可以减少杂质量的活性炭材料的组合而可靠地纯化至高纯度，该以f/t模式进行的cex层析被期望以低成本使用但具有分离性能取决于共存杂质的量和种类而低的问题。本发明人还发现，通过活性炭材料可以可靠地去除病毒；并且补充了aex层析在使用cho细胞纯化治疗性抗体中实现病毒清除率的功能，结果开发了可以省略aex层析步骤的生产工序。总之，本发明人通过组合使用由以f/t模式进行的蛋白a层析和cex层析组成的两个层析步骤与利用活性炭材料的处理步骤，发现了有效的纯化方法。由于该方法，与常规方法相比，可以减少纯化步骤的数目和生产成本，并且可将抗体有效地纯化至足以用于人的治疗用途的质量。基于此，完成了本发明。
本发明概括如下。
[1]从含有一种或更多种杂质的组合物中纯化抗体的方法，其包括下述步骤：
a1.提供含有抗体的细胞培养上清液；
b1.将细胞培养上清液经由亲和层析树脂处理，得到含有抗体的亲和层析合并物（pool）；
c1.将亲和层析合并物中的病毒灭活，得到病毒灭活液；
d1.用活性炭材料处理病毒灭活液，得到活性炭材料合并物；和
e1.将活性炭材料合并物经由阳离子交换材料处理，得到阳离子交换材料合并物。
[2]根据[1]的从含有一种或更多种杂质的组合物中纯化抗体的方法，其包括下述步骤：
a2.提供含有抗体的细胞培养上清液；
b2.将细胞培养上清液经由亲和层析树脂处理，得到含有抗体的亲和层析合并物；
c2.将亲和层析合并物中的病毒灭活，得到病毒灭活液；
d2.将病毒灭活液经由深层过滤器处理，得到深层过滤合并物；
e2.用活性炭材料处理深层过滤合并物，得到活性炭材料合并物；和
f2.将活性炭材料合并物经由阳离子交换材料处理，得到阳离子交换材料合并物。
[3]根据[1]或[2]的方法，其中，亲和层析树脂是蛋白a树脂。
[4]根据[3]的方法，其中，蛋白a树脂是kancapa、kancapa3g、mabselectsure、mabselectsurepcc、mabselectprisma或amspherea3。
[5]根据[1]至[4]中任一项的方法，其中，病毒灭活是用选自酸、表面活性剂、化学物质、核酸交联剂、紫外线、γ射线和热中的至少一种进行的处理。
[6]根据[5]的方法，其中，病毒灭活包括将亲和层析合并物的ph降低至3～4。
[7]根据[6]的方法，其中，在病毒灭活期间，将亲和层析合并物孵育60～120分钟。
[8]根据[6]或[7]的方法，其中，在病毒灭活期间，在15～30℃下孵育亲和层析合并物。
[9]根据[1]至[8]中任一项的方法，其中，要加载于活性炭材料中的溶液、以及活性炭材料的平衡缓冲液和清洗缓冲液各自具有4.5～7.5的ph。
[10]根据[9]的方法，其中，要加载于活性炭材料中的溶液、以及活性炭材料的平衡缓冲液和清洗缓冲液各自具有4.5～5.5的ph。
[11]根据[1]至[10]中任一项的方法，其中，要加载于活性炭材料中的溶液、以及活性炭材料的平衡缓冲液和清洗缓冲液各自具有2～10ms/cm的电导率。
[12]根据[11]的方法，其中，要加载于活性炭材料中的溶液、以及活性炭材料的平衡缓冲液和清洗缓冲液各自具有2～5ms/cm的电导率。
[13]根据[1]至[12]中任一项的方法，其中，利用活性炭材料的处理通过使用含有活性炭材料的过滤器来进行。
[14]根据[13]的方法，其中，过滤器是millistak+podcr40、zetaplus活性炭吸附深层过滤器或supracap50seitzaks过滤器。
[15]根据[1]至[14]中任一项的方法，其中，活性炭材料合并物以超过阳离子交换材料的结合能力的量加载于阳离子交换材料中。
[16]根据[15]的方法，其中，活性炭材料合并物以500～2000g/l的加载密度加载于阳离子交换材料中。
[17]根据[16]的方法，其中，活性炭材料合并物以1000～1500g/l的加载密度加载于阳离子交换材料中。
[18]根据[1]至[17]中任一项的方法，其中，阳离子交换材料为树脂、整体柱（monolithcolumn）或膜。
[19]根据[18]的方法，其中，阳离子交换材料具有官能团，其为磺基丙基、磺基乙基、磺基异丁基或羧基。
[20]根据[19]的方法，其中，阳离子交换材料为porosxs、eshmunocpx、eshmunocp-ft或captosimpact。
[21]根据[1]至[20]中任一项的方法，其中，要加载于阳离子交换材料中的溶液具有4～6的ph。
[22]根据[21]的方法，其中，要加载于阳离子交换材料中的溶液具有4.5～5.5的ph。
[23]根据[1]至[22]中任一项的方法，其中，要加载于阳离子交换材料中的溶液具有3～7ms/cm的电导率。
[24]根据[23]的方法，其中，要加载于阳离子交换材料中的溶液具有3～5ms/cm的电导率。
[25]根据[1]至[24]中任一项的方法，其中，阳离子交换材料合并物进一步经由疏水相互作用层析处理以得到合并物溶液。
[26]根据[25]的方法，其中，疏水相互作用层析以流动-通过模式进行。
[27]根据[26]的方法，其中，疏水相互作用层析通过使用树脂或膜进行。
[28]根据[27]的方法，其中，疏水相互作用层析树脂或膜具有苯基、苄基或己基。
[29]根据[28]的方法，其中，疏水相互作用层析材料是porosbenzylultra、porosbenzyl、hexyl-650c、phenylsepharose6fastflow、phenylsepharosehighperformance、sartobindphenyl或readytoprocessadsorberphenyl。
[30]根据[1]至[14]中任一项的方法，其中，活性炭材料合并物经由疏水相互作用层析处理以得到合并物溶液，其进一步经由阳离子交换材料处理以得到合并物溶液。
[31]根据[30]的方法，其中，疏水相互作用层析以流动-通过模式进行。
[32]根据[31]的方法，其中，疏水相互作用层析通过使用树脂或膜进行。
[33]根据[32]的方法，其中，疏水相互作用层析树脂或膜具有苯基、苄基或己基。
[34]根据[33]的方法，其中，疏水相互作用层析材料是porosbenzylultra、porosbenzyl、hexyl-650c、phenylsepharose6fastflow、phenylsepharosehighperformance、sartobindphenyl或readytoprocessadsorberphenyl。
[35]根据[30]至[34]中任一项的方法，其中，疏水相互作用层析合并物以超过阳离子交换材料的结合能力的量加载于阳离子交换材料中。
[36]根据[35]的方法，其中，疏水相互作用层析合并物以500～2000g/l的加载密度加载于阳离子交换材料中。
[37]根据[36]的方法，其中，疏水相互作用层析合并物以1000～1500g/l的加载密度加载于阳离子交换材料中。
[38]根据[30]至[37]中任一项的方法，其中，阳离子交换材料为树脂、整体柱或膜。
[39]根据[38]的方法，其中，阳离子交换材料具有官能团，其为磺基丙基、磺基乙基、磺基异丁基或羧基。
[40]根据[39]的方法，其中，阳离子交换材料为porosxs、eshmunocpx、eshmunocp-ft或captosimpact。
[41]根据[30]至[40]中任一项的方法，其中，要加载于阳离子交换材料中的溶液具有4～6的ph。
[42]根据[41]的方法，其中，要加载于阳离子交换材料中的溶液具有4.5～5.5的ph。
[43]根据[30]至[42]中任一项的方法，其中，要加载于阳离子交换材料中的溶液具有3～7ms/cm的导电性。
[44]根据[43]的方法，其中，要加载于阳离子交换材料中的溶液具有3～5ms/cm的电导率。
[45]根据[1]至[44]中任一项的方法，其中，至少一种杂质选自源自宿主细胞的蛋白（宿主细胞蛋白；hcps）、磷脂酶b-样2（plbl2）、病毒、病毒样颗粒、高分子量种类（hmws）、低分子量种类（lmws）、培养基组分、浸出蛋白a和/或dna。
[46]根据[1]至[45]中任一项的方法，其中，这些步骤是连续进行的。
[47]通过[1]至[46]中任一项的方法纯化的抗体。
[48]从含有一种或更多种杂质的组合物中纯化抗体的方法，其包括下述步骤：
a1.提供含有抗体的细胞培养上清液；
b1.将细胞培养上清液经由亲和层析树脂处理，得到含有抗体的亲和层析合并物；
c1.将亲和层析合并物中的病毒灭活，得到病毒灭活液；和
d1.用活性炭材料处理病毒灭活液，得到活性炭材料合并物，
其中，plbl2清除性能通过进行步骤d1得到改进。
[49]从含有一种或更多种杂质的组合物中纯化抗体的方法，其包括下述步骤：
a2.提供含有抗体的细胞培养上清液；
b2.将细胞培养上清液经由亲和层析树脂处理，得到含有抗体的亲和层析合并物；
c2.将亲和层析合并物中的病毒灭活，得到病毒灭活液；
d2.将病毒灭活液用深层过滤器处理，得到深层过滤合并物；和
e2.用活性炭材料处理深层过滤合并物，得到活性炭材料合并物，
其中，plbl2清除性能通过进行步骤e2得到改进。
[50]从含有一种或更多种杂质的组合物中纯化抗体的方法，其包括下述步骤：
a1.提供含有抗体的细胞培养上清液；
b1.将细胞培养上清液经由亲和层析树脂处理，得到含有抗体的亲和层析合并物；
c1.将亲和层析合并物中的病毒灭活，得到病毒灭活液；
d1.用活性炭材料处理病毒灭活液，得到活性炭材料合并物；和
e1.将活性炭材料合并物经由阳离子交换材料处理，得到阳离子交换材料合并物，
其中，plbl2清除性能通过进行步骤d1得到改进。
[51]从含有一种或更多种杂质的组合物中纯化抗体的方法，其包括下述步骤：
a2.提供含有抗体的细胞培养上清液；
b2.将细胞培养上清液经由亲和层析树脂处理，得到含有抗体的亲和层析合并物；
c2.将亲和层析合并物中的病毒灭活，得到病毒灭活液；
d2.将病毒灭活液经由深层过滤器处理，得到深层过滤合并物；
e2.用活性炭材料处理深层过滤合并物，得到活性炭材料合并物；和
f2.将活性炭材料合并物经由阳离子交换材料处理，得到阳离子交换材料合并物，
其中，plbl2清除性能通过进行步骤e2得到改进。
发明的有益效果
本发明人等在常规抗体纯化工序中追加了利用活性炭材料的处理，发现无论共存杂质的量和种类如何，均能够减少对后续纯化步骤的杂质负担，并且能够将抗体可靠地纯化至期望的纯度。本发明人等进一步发现，通过利用活性炭材料的处理，补充aex层析在使用cho细胞纯化抗体药物中实现病毒清除的功能，可以实现高的病毒清除性能，结果开发了可以省略aex层析的生产工序。由于该生产工序，与常规纯化方法相比，他们成功地将抗体纯化至用于人类治疗的充分纯化程度，并且纯化步骤和生产成本降低。
具体实施方式
现在，将更具体地描述本发明。
1.定义
在说明书中，术语“抗体”是指，例如，单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体（双特异性抗体）、fc融合蛋白和具有生物活性的抗体片段。应注意，能够适用本发明的抗体并不受该抗体所要特异性结合的抗原的限定。另外，能够适用本发明的抗体也不受该抗体的氨基酸序列限定。
在说明书中，术语“结合/洗脱（b/e）模式”是指通过将样品中含有的至少一种产物与层析树脂或介质结合，然后洗脱该产物而分离产物的技术方式。
在说明书中，术语“流动-通过（f/t）模式”暗示样品中包含的至少一种产物流过层析树脂或介质，是指通过将至少一种潜在组分结合到层析树脂或介质而分离产物的技术方式。
在说明书中，术语“过载模式”暗示以超过柱等的结合能力的量进行加载，是指利用期望产物和杂质之间的吸附量的差异来分离产物的技术方式。在说明书中，将抗体的部分纯化产物以超过阳离子交换材料的结合能力的量加载于阳离子交换材料中。该抗体的部分纯化产物在阳离子交换材料上的结合能力就蛋白/阳离子交换材料（1l）而言为100g。过载模式中的加载密度就蛋白/阳离子交换材料（1l）而言为150-4000g。优选的加载密度在500-2000g/l的范围内，进一步优选的加载密度在1000-1500g/l的范围内。
在说明书中，术语“亲和层析”是指通过将靶蛋白（例如，具有期望fc区的蛋白或抗体）特异性地结合至靶蛋白特异性配体而分离蛋白的技术方法。当纯化抗体时，该配体为蛋白a、蛋白g或其功能性变体。配体与层析柱的固相材料共价结合，并且当含有抗体的溶液与该层析柱的固相材料接触时，与抗体结合。
在说明书中，术语“深层过滤器”是指一系列连续排列的具有逐渐减小的孔径的过滤器，其用于从抗体溶液中除去颗粒。深层过滤器具有三维基质，该三维基质具有迷宫样路径，抗体溶液流动通过该迷宫样路径。颗粒被整个基质随机且机械地捕获至底部。深层过滤器由缠绕棉、聚丙烯、人造丝纤维素、玻璃纤维、烧结金属、瓷器、硅藻土或除这些之外的已知成分组成。
在说明书中，术语“阳离子交换材料”和术语“cex材料”可相互交换使用，并且各自是指带有负电荷并因此具有用于与通过固相上或固相中的水溶液中的阳离子进行交换的游离阳离子的固相。
在说明书中，术语“阴离子交换材料”和术语“aex材料”可相互交换使用，并且各自是指具有单一类型或多种类型的与固相结合的带正电荷的配体的带正电荷的固相，所述带正电荷的配体例如为伯胺基团、仲胺基团、叔胺基团或季胺基团。
在说明书中，术语“疏水相互作用层析”或“hic”是指基于分子的疏水性，即从分子从水溶液中吸附至疏水性表面的能力而将分子分离的工序。疏水相互作用层析通常取决于溶质分子表面疏水性基团类型的差异而发挥功能。疏水性基团倾向于与不溶性基质表面的疏水性基团结合。hic具有比反相液相色谱更高的极性，用于低变性的环境中。因此，hic通常与离子交换或凝胶过滤层析组合用于抗体纯化。
在说明书中，术语“活性炭材料”是指由碳构成或含有碳的任意物质、或活性炭。“活性炭”是指已进行了强化其孔结构的处理的碳质材料。活性炭是具有极高表面积的多孔固体。活性炭可以从包括煤、木材、椰子壳、坚果壳和泥炭的多种供给源获得。活性炭可以由这些材料通过包括在受控环境下施加热的物理活化，或者使用强酸、碱或氧化剂的化学活化来生产。根据这些活化方法，可以生产具有大表面积的多孔结构，其为活性炭提供高的除杂质能力。与大多数其他吸附材料不同，活性炭被认为通过相对弱的范德华力与分子相互作用。作为本发明的纯化方法中使用的活性炭，可以单独使用一种类型的活性炭，或者也可以单独或混合使用两种类型或更多种类型的活性炭。
在说明书中，术语“连续地”意指具有能够实现在直接连接的材料之间的连续流动的任意其它方式。更具体地，该术语意指用于纯化期望产物的工序，并且包括2个或更多个工序步骤（或单元操作），其允许从一个工序步骤的输出直接流入后续工序步骤中而无需介入，并且其能够在该期间至少部分且同时地操作。
在说明书中，术语“除去”、“减少”和“清除”可相互交换使用，并且各自是指减少含有待纯化抗体的样品中的一种或更多种杂质的量。
在说明书中，术语“纯化”和“增加纯度”可相互交换使用，并且各自意指通过从样品中除去杂质而增加目标抗体相对于样品中的至少一种杂质的比例。
在说明书中，术语“电导率”是指水溶液在两个电极之间传输电流的能力。在水溶液中，电流通过离子传输而流动。因此，如果水溶液中存在的离子量增加，则溶液的电导率增加。电导率可通过电导率测定器来测量，并且电导率的测量单位是毫西门子每厘米（ms/cm或ms）。溶液的电导率可通过改变溶液中的离子浓度而改变。例如，溶液中的缓冲剂和/或盐的浓度可以进行改变以获得期望的电导率。优选地，缓冲液的盐浓度可以进行改变以获得期望的电导率。
在说明书中，术语“级分”是指在含有目标抗体的样品经受例如将样品加载于活性炭材料中的步骤后收集的小体积的液体。
在说明书中，术语“hcp；宿主细胞蛋白”是指源自中国仓鼠卵巢（cho）细胞培养液的源自宿主细胞的蛋白的混合物。hcp通常作为杂质存在于含有期望蛋白，例如在cho细胞中表达的抗体的细胞培养液中。
在说明书中，术语“hmws;高分子量种类”是指在比单体更高分子量的区域洗脱的分子量不同的抗体变体之一。
在说明书中，术语“lmws;低分子量种类”是指在比单体更低分子量的区域洗脱的分子量不同的抗体变体之一。
在说明书中，术语“病毒”是指只能在活细胞内复制的小型传染原或颗粒。病毒各自通常由包裹在蛋白衣壳中的核酸（rna或dna）组成，该蛋白衣壳也可任选地为脂质包膜。
在说明书中，术语“病毒样颗粒”是指通过电子显微镜观察到的被认为与已知病毒具有形态学关系的结构。
在说明书中，术语“逆转录病毒”是指rna病毒，其遗传信息可以经由逆转录dna中间体整合至被rna病毒感染的细胞的基因组dna中。
在说明书中，术语“逆转录病毒样颗粒”是指由基因组中具有源自逆转录病毒的dna部分的细胞产生的颗粒。逆转录病毒样颗粒类似于逆转录病毒，但它们大多是非传染性的。本说明书实施例中使用的鼠白血病病毒（mlv）代表模型逆转录病毒或逆转录病毒样颗粒。
在说明书中，术语“细小病毒”是指不具有包膜的线性、非节段单链dna病毒，其具有5000个核苷酸的平均基因组大小和18-26nm的直径。本说明书中描述的方法中通常使用的细小病毒是鼠微小病毒（mmv）。
在说明书中，“对数减少值”或“lrv”是指代表柱或过滤器除去杂质的性能的值，且可以通过使已知量的杂质通过该柱或该过滤器而获得。
lrv=log（cf）-log（cp）
其中，cf代表加载液中的杂质的浓度；cp代表通过柱或过滤器后的溶液中的剩余杂质的浓度。
在说明书中，“培养基组分”的实例包括血清、生长因子（例如，胰岛素）和抗生素物质。
2.通过f/t模式cex层析除去hcp
根据专利文献1、非专利文献2和非专利文献3中所示的常规技术，以f/t模式依次通过蛋白a层析、aex层析和cex层析纯化抗体细胞培养液。结果发现，取决于抗体的类型（包括由于宿主细胞和培养方法的差异导致的共存杂质的量和/或种类的差异），hcp在某些情况下不能被充分除去。由f/t模式下的蛋白a层析、aex层析和cex层析（随后按此顺序进行）组成的工序从成本、劳动力和操作时间方面来看是优异的，但发现杂质、尤其是hcp的可除去性并不可靠。
众所周知，hcp可经由多种机制诱导免疫原性。实际上，在生长激素的生物类似药的临床试验中，据报道在所有患者中均由于残留的hcp而产生hcp抗体，最多60%的患者中产生非中和性抗生长激素抗体（m.pavlovic等人，horm.res.69:14-21（2008））。通过进一步除去hcp来改善抗生长激素抗体的水平，以达到与其他生长激素抗体所报道的相同水平。在cho细胞中产生的重组ix因子的临床试验中，据报道，抗hcp抗体以相当高的百分比产生，尽管没有发现副作用，但监管机构仍然发出了临床暂停命令（https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/bloodbloodproducts/approvedproducts/licensedproductsblas/fractionatedplasmaproducts/ucm448429.pdf
食品药品监督管理局
statisticalreviewandevaluationblafinal,产品名:ib1001,适应症:b型血友病患者出血事件的控制和预防及围手术期管理，cber接收日期:2012年4月6日
或者https://www.news-medical.net/news/20120710/inspiration-receives-fda-clinical-hold-order-for-ib1001-phase-iii-studies-on-hemophilia-b.aspx
news-medical.net-anazonetworksite
inspiration收到fda对b型血友病的ib1001iii期研究的临床暂停命令，2012年7月10日）。
无论是否存在安全性不良事件报告，监管部门都担心潜在风险，并且可能会在残留hcp量得到进一步减少后下达开展临床试验的指示。近来，已报道药物产品中的聚山梨酯被残留的hcp（脂蛋白脂酶）降解，这会影响药品的稳定性（thall等人，j.chromatogr.a105:1633-1642（2016））。考虑到药品的稳定性，在纯化步骤中适当除去hcp是重要的。
残留hcp对安全性和稳定性的影响可认为不仅取决于宿主细胞的类型和残留hcp的种类、也取决于产品的剂量和给药而不同。因此，必须考虑例如制造工序、最大剂量、给药部位和给药频率而对每个产品适宜设置残留hcp的可接受值，但期望在制造工序中尽可能减少残留hcp。
如上所述，在以f/t模式使用cex层析的纯化流程中，也期望开发通常应用于任何抗体类型的减少包括hcp的杂质的方法。
3.通过施加活性炭材料来除去杂质
本发明人进行了研究，以开发一种在降低生产成本的同时可靠地将抗体纯化至高纯度的方法。结果，他们发现通过在常规纯化步骤中加入利用活性炭材料的处理可以将任意类型的抗体纯化至高纯度。
如上所述，考虑到hcp可以作为异源蛋白对人类具有抗原性；源自哺乳细胞的蛋白具有致瘤风险；以及hcp由于药品中的聚山梨酯降解而与药品稳定性相关，hcp需要通过纯化步骤除去至足够低的水平。磷脂酶b-样2（plbl2）是一种hcp，被报道作为通过与抗体的相互作用而保留的搭车hcp（hitchhikerhcp）（b.tran等人，j.chromatogr.a1438:31-38（2016））。有报道称，在来瑞组单抗（lebrikizumab）的临床试验中，抗仓鼠plbl2抗体由于药物产品中plbl2的残留而非常频繁地产生（国际公开号wo2015/038888）。目前尚未发现抗仓鼠plbl2抗体的产生的临床重要性；在来瑞组单抗的临床试验中，即使抗仓鼠plbl2抗体非常频繁地产生，与安全事件之间也没有相关性。尽管如此，仍旧存在重复给药导致的长期暴露可能会增加不良反应，如过敏性或超敏性患者群体中的过敏反应和超敏反应的风险。因此，认为理想的是尽可能地减少药物产品中plbl2的水平。
为了满足这些要求，加入了利用活性炭材料的处理。由于该处理，加载于cex层析上的杂质减少，结果hcp成功地减少至充分地的水平。此外，通过一般的纯化方法难以减少由于与抗体的相互作用而保留的plbl2（搭车hcp）的量。因此，通过活性炭材料在加载物中将plbl2减少约50%，换言之，通过活性炭材料获得0.27的plbl2对数减少值（lrv）具有重大意义。
进而，通过活性炭材料还将产物相关杂质、hmws和lmws减少。通过活性炭材料减少hmws可以减少cex层析上的加载，结果能够可靠地减少最终纯化产物中的hmws的量。由于通过一般的纯化方法难以降低lmws的量，因此活性炭材料对最终纯化产物的纯度提高的贡献大。
除此之外，调节要加载于活性炭材料上的抗体溶液的ph，结果病毒清除性能得到改善。显示逆转录病毒和/或逆转录病毒样颗粒可以通过活性炭材料除去，或者细小病毒可以通过活性炭材料除去，尽管该除去效果取决于抗体溶液而受限（国际公开号wo2015/005961）；在该情况中，溶液的ph为7.0。但是，在本发明中，发现在病毒可以在ph5.0的条件下除去，并且进一步证实与之前报道中公开的条件相比，ph5.0的条件下的病毒清除性能更佳。
一般的抗体纯化方法通过蛋白a层析和低ph下的病毒灭活处理来进行。在病毒灭活处理之后，ph有时会被中和至约ph5.0。在cex层析之后，经常采用约ph5.0的条件。由此，若在这些步骤之间进行利用活性炭材料的处理，以在没有如ph调节和稀释的特定操作的情形下进行利用活性炭材料的处理，将大大有助于简化生产操作。进而，取决于抗体类型，抗体有时会由于ph改变而变得不稳定。因此，认为在没有ph调节的情形下利用活性炭材料的处理会大大有助于保持抗体的稳定性。
在使用cho细胞的治疗性抗体的纯化工序中，通常已知aex层析会实现病毒清除。由于发现活性炭材料也实现与aex层析相同的病毒清除水平，因此可以使用利用活性炭材料的处理步骤来替代aex层析。因此，发现了省略aex层析的可能性。包括aex层析的层析在操作上是复杂的。若将活性炭材料用作吸附过滤器，则可以省略操作上复杂的层析，结果可以使纯化工序更加简单和有效。进而，因为将昂贵的aex树脂或membraneadsorber替代为廉价的活性炭吸附过滤器，因此可以显著降低运行成本。另外，由于不需要昂贵的层析设备并可以替代地使用廉价的过滤器单元，因此认为可以大大减少生产设施的初期投资。
4.本发明中采用的纯化步骤
在说明书中，提供了用于从含有一种或更多种杂质的组合物中纯化抗体的方法（以下称为改良方法2），其包括下述步骤：
a1.提供含有抗体的细胞培养上清液；
b1.将细胞培养上清液经由亲和层析树脂处理，得到含有抗体的亲和层析合并物；
c1.将亲和层析合并物中的病毒灭活，得到病毒灭活液；
d1.用活性炭材料处理病毒灭活液，得到活性炭材料合并物；和
e1.将活性炭材料合并物经由阳离子交换材料处理，得到阳离子交换材料合并物。
步骤b1中的亲和层析树脂的优选实例包括蛋白a树脂。可以采用的蛋白a树脂的实例包括但不限于：kancapa（kanekacorporation）、kancapa3g（kanekacorporation）、mabselectsure（gehealthcarelifescience）、mabselectsurepcc（gehealthcarelifescience）、mabselectprisma（gehealthcarelifescience）和amspherea3（jsrlifesciencescorporation）。
步骤c1中的病毒灭活可以通过选自利用酸、表面活性剂、化学物质、核酸交联剂、紫外线、γ射线和热的处理中的一种方法进行。若选择利用酸的处理用于灭活病毒，则优选将亲和层析合并物的ph降低至3-4的范围的处理，进一步优选的灭活病毒处理的ph为3.5。此时，优选的处理时间是60-120分钟，优选的处理温度是15-30℃。
在步骤d1中，将活性炭材料填充至层析柱中。根据另一个实施方案，活性炭材料是过滤器型，并且被置于如millistak+（r）pod的密闭的一次性装置中。根据又另一个实施方案，活性炭材料被置于套筒或胶囊中。在大多数情况中，过滤器型活性炭材料是通过将活性炭材料与如纤维素基质的刚性过滤材料混合而制备。
市售活性炭过滤器的实例包括但不限于：millistak+（r）podcr40（merckmillipore）,zetaplus活性炭吸附深层过滤器（3mcompany）和supracap50seitz（r）aks过滤器（pallcorporation）。在根据某些实施方案的活性炭过滤器中，活性炭材料被保持于纤维素基质中。在步骤d1中，要加载于活性炭材料上的溶液、以及用于活性炭材料的平衡缓冲液和清洗缓冲液的ph优选为4.5-7.5，更优选为4.5-5.5，进一步优选为5.0。在步骤d1中，要加载于活性炭材料上的溶液、以及用于活性炭材料的平衡缓冲液和清洗缓冲液的电导率优选为2-10ms/cm，更优选为2-5ms/cm。
在步骤e1中，作为阳离子交换材料，选择树脂、整体柱和膜中的任一者。阳离子交换材料的官能团是磺基丙基、磺基乙基、磺基异丁基或羧基。市售阳离子交换材料的实例包括但不限于：porosxs（thermofisherscientificinc.）、eshmuno（r）cpx（merckmillipore）、eshmuno（r）cp-ft（merckmillipore）和captosimpact（gehealthcarelifescience）。
在步骤e1中，将步骤d1中获得的活性炭材料合并物以超过结合能力的量加载于阳离子交换材料上。加载密度可以在每1l阳离子交换材料为150-4000g蛋白量的范围内选择，优选为500-2000g/l、进一步优选为1000-1500g/l的范围内。要加载的活性炭材料合并物的ph优选为4-6，更优选为4.5-5.5，进一步优选为5.0。在步骤e1中，要加载于阳离子交换材料上的溶液的电导率优选为3-7ms/cm，更优选为3-5ms/cm。
在改良方法2中，在步骤a1至e1各自的前后可以任性地添加至少一个步骤。
例如，在改良方法2的步骤c1和步骤d1之间，可以添加经由深层过滤器的处理步骤。深层过滤器是可通过使用两种作用，即，捕获作用和普通多孔过滤材料的机械过滤作用来捕获尺寸大于约1μm的颗粒的过滤器，并且其由如纤维素基质和硅藻土的过滤材料形成。深层过滤器具有通过具有无数长流路的厚过滤材料来捕获对象的特征。深层过滤器被置于如millistak+（r）pod的密闭的一次性装置中。市售深层过滤器的实例包括但不限于：millistak+（r）a1hc、d0hc和x0hc。
作为进一步包括经由深层过滤器的处理步骤的具体方法，提供从含有一种或更多种杂质的组合物中纯化抗体的方法，其包括下述步骤：
a2.提供含有抗体的细胞培养上清液；
b2.将细胞培养上清液经由亲和层析树脂处理，得到含有抗体的亲和层析合并物；
c2.将亲和层析合并物中的病毒灭活，得到病毒灭活液；
d2.将病毒灭活液经由深层过滤器处理，得到深层过滤合并物；
e2.用活性炭材料处理深层过滤合并物，得到活性炭材料合并物；和
f2.将活性炭材料合并物经由阳离子交换材料处理，得到阳离子交换材料合并物。这是在改良方法2的步骤c1和步骤d1之间添加了经由深层过滤器的处理步骤的方法（以下称为改良方法1）。
经由阴离子交换材料的处理步骤可以添加在改良方法2的步骤c1和步骤d1之间，或者改良方法1的步骤d2和步骤e2之间。作为阴离子交换材料，选择树脂、整体柱和膜的任一者。作为膜，可以选择q膜。通常，阴离子交换材料用于f/t模式中。市售阴离子交换材料的实例包括但不限于：natriflo（r）hd-q、mustang（r）q和sartobind（r）q。
在改良方法2的步骤e1或改良方法1的步骤f2中获得的阳离子交换材料合并物可以进一步经由疏水相互作用层析处理以获得合并物溶液（以下称为改良方法3）。在改良方法2的步骤d1或改良方法1的步骤e2中获得的活性炭材料合并物进一步经由疏水相互作用层析处理以获得疏水相互作用层析合并物，该疏水相互作用层析合并物可进一步经由阳离子交换材料处理以获得阳离子交换材料合并物（以下称为改良方法4）。疏水相互作用层析优选以f/t模式进行。疏水相互作用层析通过使用具有苯基、苄基或己基的树脂或膜来进行。市售疏水相互作用层析用材料的实例包括但不限于：phenylsepharosehighperformance（gehealthcarelifescience）、phenylsepharose6fastflow（gehealthcarelifescience）、sartobind（r）phenyl（sartorius）、readytoprocessadsorberphenyl（gehealthcarelifescience）、porosbenzylultra（thermofisherscientificinc.）、porosbenzyl（thermofisherscientificinc.）和hexyl-650c（tosohcorporation）。
根据本文中描述的任一方法的某些实施方案，其进一步包括回收经纯化抗体的步骤。根据某些实施方案，纯化抗体是从本文中描述的任一纯化步骤中回收的。
通过以上描述的步骤将选自hcp、plbl2、病毒、病毒样颗粒、hmws、lmws、培养基组分、浸出蛋白a和dna中的至少一种杂质除去。
实施例
本发明将通过下述实施例更具体地进行描述，但本发明不受这些实施例限制。
实施例1:常用方法
在本实施例中，将对常用于实施例2和后续实施例中的方法进行说明。
1）抗体浓度的测定
抗体浓度通过使用paidsensorcartridge（2.1mm×3mm,appliedbiosystems）柱的hplc来测定。
2）hcp测定
hcp通过使用来自cygnustechnologies的第三代cho宿主细胞蛋白试剂盒或来自biogenesgmbh的cho|360hcpelisa试剂盒按照酶联免疫吸附测定法（elisa）来测定。将获得的hcp浓度通过除以抗体浓度而转换为nghcp/mg抗体的数值。
在实施例2至5中，使用了来自cygnustechnologies的第三代cho宿主细胞蛋白试剂盒，而在实施例6至8中，使用了来自biogenesgmbh的cho|360hcpelisa试剂盒。
3）plbl2测定
plbl2通过使用来自immunologyconsultantslaboratory,inc的仓鼠磷脂酶b-样2（plbl2）elisa试剂盒按照酶联免疫吸附测定法（elisa）来测定。将获得的plbl2浓度通过除以抗体浓度而转换为ngplbl2/mg抗体的数值。在各纯化步骤中，按照下式计算plbl2清除性能（对数减少值;lrv）：
lrv=log（cf）-log（cp）
其中，cf代表加载溶液中的plbl2的浓度；cp代表通过柱或过滤器后的溶液中的剩余plbl2的浓度。
4）高分子量种类（hmws）、低分子量种类（lmws）和单体的含量
测定通过使用hplc来进行，该hplc使用tskgelg3000swxl柱（5μm,7.8mm×300mm,tosohcorporation）或acquityuplcproteinbehsec柱（1.7μm,4.6mm×300mm,waterscorporation）。使用含有0.4m氯化钠的0.1m磷酸缓冲液作为流动相。
5）蛋白a的测定
蛋白a通过使用来自cygnustechnologies的蛋白aelisa试剂盒按照酶联免疫吸附测定法（elisa）来测定。将获得的蛋白a浓度通过除以抗体浓度而转换为ng蛋白a/mg抗体的数值，以比较结果。
6）病毒滴度的测定和病毒清除性能（对数减少值;lrv）的计算
病毒滴度通过基于细胞的形态在细胞感染病毒时会发生改变的现象（细胞病变）而测定感染50%细胞的病毒加载物的方法（中位组织培养感染剂量;tcid50）来测定。供测定的病毒是鼠白血病病毒（mlv）、鼠微小病毒（mmv）、伪狂犬病毒（prv）和呼肠孤病毒3型（reo3）。使用的指示细胞是pg4细胞（mlv的指示细胞）、324k细胞或a9细胞（mmv的指示细胞）、vero细胞（prv的指示细胞）和l-929细胞（reo3的指示细胞）。在病毒清除研究之前，基于对病毒滴度测定的毒性或干扰，检查缓冲液和样品是否对指示细胞具有不期望的影响。按照下式计算病毒清除性能（对数减少值;lrv）：
lrv=log（cf）-log（cp）
其中，cf代表加载溶液中的病毒的浓度；cp代表通过柱或过滤器后的溶液中的残留病毒的浓度。
7）dna的测定
通过使用引物和cho特异性探针的qpcr法来测定dna的浓度。将获得的dna浓度通过除以抗体浓度而转换为pgdna/mg抗体的数值。
实施例2：参考例：通过f/t模式下的cex层析进行纯化（maba）
在本实施例中，将根据以下表1中所示的流程图来说明被称作maba的单克隆抗体的纯化流程中的杂质的清除。
[表1]
1）材料和方法
将含有由cho细胞产生的maba的细胞培养液用深层过滤器过滤以除去细胞，并进行澄清化以获得细胞培养上清液。将细胞培养上清液通过使用kancapa树脂的蛋白a层析进行纯化。在将柱用含有20mm氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）平衡后，加载细胞培养上清液。然后，将该柱用含有1m氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）清洗，然后用含有20mm氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）清洗。用乙酸缓冲液（ph3.6）从柱中洗脱出maba。监控280mm下的吸光度，获得含有maba的级分（亲和层析合并物）。向该亲和层析合并物添加盐酸以将ph调节为3.5。这样，进行1小时病毒灭活处理。该步骤在室温下进行。在1小时病毒灭活处理后，将所得溶液用tris水溶液中和至ph5.0。将经中和的溶液加载于用乙酸缓冲液（ph5.0）预清洗的深层过滤器（millistak（r）poda1hc）上，然后供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶（chasing）以回收maba。然后用0.2μm过滤器进行过滤，保存滤液（深层过滤合并物）。将深层过滤合并物的ph用tris水溶液调节至7.5，用作aex材料加载物。将该aex材料加载物通过用含有1m氯化钠的tris缓冲液（ph7.5）、然后用tris缓冲液（ph7.5）预平衡的aexmembraneadsorber（natriflo（r）hd-q），然后将该aexmembraneadsorber用tris缓冲液（ph7.5）追赶以回收maba。将回收的溶液的ph用乙酸调节至5.0后，将该溶液用0.2μm过滤器过滤。将滤液保存为aex材料合并物。将该aex材料合并物通过用含有1m氯化钠的乙酸缓冲液（ph5.0）、然后用乙酸缓冲液（ph5.0）预平衡的填充有porosxs的cex柱。cex柱上的加载密度设定为2000g/l树脂或更少。在加载后，供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。监控280mm下的吸光度，得到含有maba的级分，用作利用f/t模式的cex材料合并物。
2）结果
cex层析的f/t模式中的maba的回收率为92%。杂质清除的结果示于表2。
[表2]
实施例3：利用活性炭材料的杂质清除（maba、mabb、mabc、mabd）
在本实施例中，将根据以下表3中所示的纯化流程图来说明被称作maba、mabb、mabc和mabd的多个抗体的纯化流程中的杂质清除。应当注意，maba、mabb、mabc和mabd的氨基酸序列以及要结合的抗原相互不同。
[表3]
1）利用活性炭材料的杂质清除（病毒除外）
将millistak+（r）podcr40用作活性炭材料。关于mabb和maba，对抗体回收率和杂质清除进行评价。将按照实施例2所示的方法得到的mabb和maba的深层过滤合并物分别用作对活性炭过滤器的加载溶液（活性炭材料加载物）。应当注意，在mabb的情况中，为了便于评价活性炭过滤器除去hcp的清除性能，在加载细胞培养上清液后，在蛋白a层析中没有进行利用含有1m氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）的柱清洗。将活性炭过滤器按照说明书适宜地预清洗，然后用乙酸缓冲液（ph5.0）平衡。应当注意，平衡步骤之时和之后的流速设定为109lmh。平衡之后，在mabb的情况中，将活性炭材料加载物以约300l/m2的体积加载，而在maba的情况中，将该溶液以约117l/m2的体积加载并通过。之后，用乙酸缓冲液回收mabb和maba（活性炭材料合并物）。
示出各个抗体的纯化条件（表4）、抗体回收率（表5）、hcp清除（表6）、plbl2清除（表7）、以及hmws/lmws清除（表8）。在任一抗体中，hcp和plbl2的水平通过活性炭过滤降低。还证实了hmws和lmws的含量减少，单体的含量增加。特别地，hcp的水平通过活性炭过滤显著降低（实施例2中，aex层析前后的hcp的除去率低，加载于cex层析上的hcp没有减少）。进一步发现被报道为由于与抗体相互作用而按照一般抗体纯化流程不容易降低的搭车hcp的plbl2（国际公开号wo2015/038888）的水平可以通过活性炭过滤降低。由于通过一般纯化方法难以减少plbl2（搭车hcp）的量，因此通过活性炭材料减少加载物中plbl2的约50%，换言之，通过活性炭材料获得0.27的plbl2对数减少值（lrv）具有重大意义。
[表4]
表4各个抗体的纯化条件列表
[表5]
表5活性炭过滤的抗体回收率（%）
[表6]
表6活性炭过滤的hcp清除（ng/mg）
[表7]
表7活性炭过滤的plbl2清除（lrv）
[表8]
表8活性炭过滤的hmws/lmws清除（%）
2）活性炭材料的病毒清除
通过使用millistak+（r）podcr40作为活性炭材料来评价病毒清除。通过加标研究（spikingstudy）对mabb、mabc和mabd进行了病毒清除性能确认。进行加标研究的病毒是使用cho细胞的治疗性抗体的病毒清除研究中通常使用的4种病毒（mlv、mmv、reo3和prv）。作为可能对活性炭过滤的病毒清除性能有影响的因子，使用了流速、ph和抗体类型，并设计了检查他们的影响的研究。将按照实施例2中所示的方法得到的mabb、mabc和mabd的深层过滤合并物用作对活性炭过滤器的加载溶液（ph5.0）（活性炭材料加载物）。通过用tris水溶液调节ph至7.5而制备ph7.5的加载溶液。将活性炭过滤器按照说明书适宜地预清洗，然后用乙酸缓冲液（ph5.0）或tris缓冲液（ph7.5）平衡。应当注意，平衡步骤之时和之后的流速设定为109lmh或54.5lmh。平衡后，以约55l/m2或约110l/m2的体积加载活性炭材料并通过。之后，用乙酸缓冲液（ph5.0）或tris缓冲液（ph7.5）回收mabb、mabc和mabd（活性炭材料合并物）。基于活性炭材料加载物和活性炭材料合并物中的病毒滴度计算病毒对数减少值（lrv）（表9）。结果发现，活性炭过滤器实现了这4种病毒的清除。病毒清除性能不受流速、共存的抗体类型和加载体积的影响，使用cho细胞的治疗性抗体的病毒清除研究中所用的4种病毒的lrv均高（即，>=4）。相反，在mlv评价中，病毒清除性能在ph5.0和ph7.5之间进行了比较。结果发现，lrv在ph7.5下低。由此，发现ph是影响活性炭材料的病毒清除的重要参数。
[表9]
实施例4：利用改良方法1的纯化例（maba、mabc）
在本实施例中，将根据以下表10中所示的纯化流程图来说明被称作maba和mabc的单克隆抗体的纯化流程中的杂质清除。
[表10]
1）材料和方法
将含有由cho细胞产生的maba的细胞培养液用深层过滤器过滤以除去细胞，并进行澄清化。将细胞培养上清液通过使用kancapa树脂的蛋白a层析进行纯化。在将柱用含有20mm氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）平衡后，加载细胞培养上清液。然后，将该柱用含有1m氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）清洗，然后用含有20mm氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）清洗。用乙酸缓冲液（ph3.6）从柱中洗脱出maba。监控280mm下的吸光度，获得含有maba的级分（亲和层析合并物）。向该亲和层析合并物添加盐酸以将ph调节为3.5。这样，进行1小时病毒灭活处理。该步骤在室温下进行。在病毒灭活处理1小时后，将所得所得溶液用tris水溶液中和至ph5.0并用0.2μm过滤器进行过滤。保存滤液（病毒灭活液）。将病毒灭活液以约109l/m2的体积加载于用乙酸缓冲液（ph5.0）预清洗的深层过滤器（millistak+（r）poda1hc）上，然后供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。回收maba（深层过滤合并物）。
将深层过滤合并物以117l/m2的体积加载于用乙酸缓冲液（ph5.0）预清洗的活性炭过滤器（millistak+（r）podcr40）上，然后供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。回收maba。然后，用0.2μm过滤器进行过滤，保存滤液（活性炭材料合并物）。将活性炭材料合并物通过用含有1m氯化钠的乙酸缓冲液（ph5.0）、然后用乙酸缓冲液（ph5.0）预平衡的填充有porosxs的cex柱。cex柱中的加载密度为约2000g/l树脂。加载后，供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。监控280mm下的吸光度，获得含有maba的级分，用作利用f/t模式的cex材料合并物。
通过使用实施例3中制备的mabc的亲和层析合并物、深层过滤合并物和活性炭材料合并物来评价病毒清除。进行加标研究的病毒是使用cho细胞的治疗性抗体的病毒清除研究中通常使用的4种病毒（mlv、mmv、reo3和prv）。基于病毒滴度，计算病毒对数减少值（lrvs）。
2）结果
改良方法1的maba回收率和杂质清除的结果分别示于表11和表12。在mabc的情况中，改良方法1中实现病毒清除的纯化步骤的总清除示于表13。
改良方法1的maba的回收率良好。hmws和lmws被除去，获得了具有高单体含量的抗体。hcp量被适宜地减少。plbl2量被成功地减少。还证实了dna被除去至低于定量限。
在mabc的情况中，改良方法1中具有病毒清除性能的纯化步骤的总病毒清除是良好的结果。
发现通过组合使用利用活性炭材料的处理可以完成实现高纯度的纯化；以及通过利用活性炭材料的处理可以除去病毒。基于这些发现，在实施例2中示出的方法中，用活性炭材料替代aex层析变得可能。至于生产成本，由于通过将通常使用的cex层析的b/e模式替换为f/t模式可以将约100g/l树脂的加载密度增加至约2000g/l树脂，昂贵的cex树脂所需的成本可以减少至约1/20。此外，由于昂贵的aex树脂和膜可被替换为廉价的活性炭材料，因此实现了生产成本的降低。进而，当取掉了aex层析并使用过滤器套筒型深层过滤器、然后过滤器套筒型活性炭过滤器时，生产周期可减少1天。由于许多药品生产商需要实现生产效率，这通过使每年的生产批次数目最大化来实现，因此生产周期减少1天具有重大意义。
由于改良的方法，纯度被提高至足以用于人类治疗的水平；生产成本和生产周期降低，结果能够有效率地纯化抗体。
[表11]
表11改良方法1的回收率（仅列出改良步骤）
[表12]
[表13]
实施例5：改良方法2的纯化例（maba、mabd）
在本实施例中，将根据以下表14中所示的纯化流程图来说明被称作maba和mabd的单克隆抗体的纯化流程中的杂质清除，其中，深层过滤从实施例4并示于表10中的纯化流程图中省略。应当注意，mabd的氨基酸序列和要结合的抗原与maba、mabb和mabc的不同。
[表14]
1）材料和方法
1）-1）maba的情况
将含有由cho细胞产生的maba的细胞培养液用深层过滤器过滤以除去细胞，并进行澄清化。将细胞培养上清液通过使用kancapa树脂的蛋白a层析进行纯化。在将柱用含有20mm氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）平衡后，加载细胞培养上清液。然后，将该柱用含有1m氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）清洗，然后用含有20mm氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）清洗。用乙酸缓冲液（ph3.6）从柱中洗脱出maba。监控280mm下的吸光度，获得含有各抗体的级分（亲和层析合并物）。向该亲和层析合并物添加盐酸以将ph调节为3.5。这样，进行1小时病毒灭活处理。该步骤在室温下进行。在病毒灭活处理1小时后，将所得所得溶液用tris水溶液中和至ph5.0并用0.2μm过滤器进行过滤。保存滤液（病毒灭活液）。将病毒灭活液以70l/m2的体积加载于用乙酸缓冲液（ph5.0）预清洗的活性炭过滤器（millistak+（r）podcr40）上，然后供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。回收抗体。然后，用0.2μm过滤器进行过滤，保存滤液（活性炭材料合并物）。将活性炭材料合并物通过用含有1m氯化钠的乙酸缓冲液（ph5.0）、然后用乙酸缓冲液（ph5.0）预平衡的填充有porosxs的cex柱。cex柱中的加载密度设定为约2000g/l树脂。加载后，供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。监控280mm下的吸光度，得到含有各抗体的级分，然后用0.2μm过滤器过滤而得到利用f/t模式的cex材料合并物。
1）-2）mabd的情况
将含有由cho细胞产生的mabd的细胞培养液用深层过滤器过滤以除去细胞，并进行澄清化。将细胞培养上清液通过使用kancapa树脂的蛋白a层析进行纯化。在将柱用含有20mm氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）平衡后，加载细胞培养上清液。然后，将该柱用含有1m氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）清洗，然后用含有20mm氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）清洗。用乙酸缓冲液（ph3.6）从柱中洗脱出mabd。监控280mm下的吸光度，获得含有各抗体的级分（亲和层析合并物）。向该亲和层析合并物添加盐酸以将ph调节为3.4。这样，进行1小时病毒灭活处理。该步骤在室温下进行。在病毒灭活处理1小时后，将所得溶液用tris水溶液中和至ph5.0并保存（病毒灭活液）。将病毒灭活液以178l/m2的体积加载于用乙酸缓冲液（ph5.0）预清洗的活性炭过滤器（millistak+（r）podcr40）上，然后供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。回收抗体。然后，用0.2μm过滤器进行过滤，保存滤液（活性炭材料合并物）。将活性炭材料合并物通过用含有1m氯化钠的乙酸缓冲液（ph5.0）、然后用乙酸缓冲液（ph5.0）预平衡的填充有porosxs的cex柱。cex柱中的加载密度设定为约1500g/l树脂。加载后，供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。监控280mm下的吸光度。得到含有各抗体的级分，然后用0.2μm过滤器过滤而得到利用f/t模式的cex材料合并物。
2）结果
改良方法2的maba回收率和杂质清除的结果分别示于表15和表16中，并且mabd回收率和杂质清除的结果分别示于表17和表18中。应当注意，改良方法2中具有病毒清除性能的纯化步骤的总病毒清除可以期待与实施例4的表13中所示的相同，因为步骤相同。
改良方法2的maba和mabd的回收率均良好。hmws和lmws被除去，获得了具有高单体含量的抗体。在mabd的情况中，hcp被充分除去。证实了dna被除去至低于定量限的水平。此外，plbl2和浸出蛋白a的含量被成功地降低。由这些结果，证实了即使不进行深层过滤，一些抗体也可以通过该纯化方法纯化至高纯度。
[表15]
表15改良方法2的回收率（仅列出改良步骤，maba）
[表16]
[表17]
[表18]
实施例6：改良方法3的纯化例（mabf、mabg）
在本实施例中，将根据在实施例4的表10中所示的纯化流程图中的离子交换层析之后添加了疏水相互作用层析的、以下表19中所示的纯化流程图来说明抗体的纯化流程中的杂质清除。应当注意，本实施例中使用的mabe、mabf和mabg的氨基酸序列和要结合的抗原相互不同，并且也与maba、mabb、mabc和mabd的不同。
[表19]
1）疏水相互作用层析的病毒清除（mabe）
在本实施例中，将对疏水相互作用层析的被称为mabe的单克隆抗体的纯化流程中的病毒清除进行说明。通过使用porosbenzylultrahic树脂的mlv和mmv对mabe的加标研究来评价病毒清除。
将含有由cho细胞产生的mabe的细胞培养液用深层过滤器过滤以除去细胞，并进行澄清化。将细胞培养上清液通过使用kancapa树脂的蛋白a层析进行纯化。在将柱用含有20mm氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）平衡后，加载细胞培养上清液。然后，将该柱用含有1m氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）清洗，然后用含有20mm氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）清洗。用乙酸缓冲液（ph3.6）从柱中洗脱出mabe。监控280mm下的吸光度，获得含有mabe的级分（亲和层析合并物）。向该亲和层析合并物添加盐酸以将ph调节为3.4。这样，进行1小时病毒灭活处理。该步骤在室温下进行。在病毒灭活处理1小时后，将所得溶液用tris水溶液中和至ph5.0（病毒灭活液）。将病毒灭活液以114l/m2的体积加载于用乙酸缓冲液（ph5.0）预清洗的深层过滤器（millistak+（r）poda1hc）上，然后供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。回收mabe（深层过滤合并物）。将深层过滤合并物以129l/m2的体积加载于用乙酸缓冲液（ph5.0）预清洗的活性炭过滤器（millistak+（r）podcr40）上，然后供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。用0.2μm过滤器进行过滤，保存滤液（活性炭材料合并物）。将活性炭材料合并物通过用注射用水、然后用乙酸缓冲液（ph5.0）预平衡的填充有porosbenzylultra的hic柱。hic柱上的加载密度为约1000g/l树脂。加载后，供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。监控280mm下的吸光度，获得含有mabe的级分，用作利用f/t模式的hic材料合并物。基于加载溶液和合并物溶液中的病毒滴度，计算病毒对数减少值（lrvs）（表20）。结果发现，疏水相互作用层析实现了病毒清除。
[表20]
2）改良方法3的杂质清除（mabf）
在本实施例中，将根据表19中所示的纯化流程图来说明被称作mabf的单克隆抗体的纯化流程中的杂质清除。
将含有由cho细胞产生的mabf的细胞培养液用深层过滤器过滤以除去细胞，并进行澄清化。将细胞培养上清液通过使用kancapa树脂的蛋白a层析进行纯化。在将柱用含有20mm氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）平衡后，加载细胞培养上清液。然后，将该柱用含有1m氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）清洗，然后用含有20mm氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）清洗。用乙酸缓冲液（ph3.6）从柱中洗脱出mabf。监控280mm下的吸光度，获得含有mabf的级分（亲和层析合并物）。向该亲和层析合并物添加盐酸以将ph调节为3.7。这样，进行1小时病毒灭活处理。该步骤在室温下进行。在病毒灭活处理1小时后，将所得溶液用tris水溶液中和至ph5.0（病毒灭活液）。将病毒灭活液以约900g/m2的量加载于用乙酸缓冲液（ph5.0）预清洗的深层过滤器（millistak+（r）poda1hc）上，然后供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。回收mabf（深层过滤合并物）。将深层过滤合并物以约800g/m2的量加载于用乙酸缓冲液（ph5.0）预清洗的活性炭过滤器（millistak+（r）podcr40）上，然后供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。用0.2μm过滤器进行过滤，保存滤液（活性炭材料合并物）。将活性炭材料合并物通过用含有1m氯化钠的乙酸缓冲液（ph5.0）、然后用乙酸缓冲液（ph5.0）预平衡且填充有porosxs的cex柱。cex柱上的加载密度设定为约1300g/l树脂。加载后，供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。监控280mm下的吸光度，获得含有mabf的级分，然后用0.2μm过滤器进行过滤。将滤液用作利用f/t模式的cex材料合并物。将cex材料合并物通过用注射用水、然后用乙酸缓冲液（ph5.0）预平衡的填充有porosbenzylultra的hic柱。hic柱上的加载密度为约300g/l树脂。加载后，供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。监控280mm下的吸光度，获得含有mabf的级分，用作利用f/t模式的hic材料合并物。
改良方法3的杂质清除的结果示于表21中。单体通过疏水相互作用层析而增加。通过疏水相互作用层析将阳离子交换层析后残留的hcp和plbl2除去，特别地，plbl2被除去至小于定量限。
[表21]
3）改良方法3的杂质清除（mabg）
在本实施例中，将根据表19中所示的纯化流程图来说明被称作mabg的单克隆抗体的纯化流程中的杂质清除。
将含有由cho细胞产生的mabg的细胞培养液用深层过滤器过滤以除去细胞，并进行澄清化。将细胞培养上清液通过使用kancapa树脂的蛋白a层析进行纯化。在将柱用含有20mm氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）平衡后，加载细胞培养上清液。然后，将该柱用含有1m氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）清洗，然后用含有20mm氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）清洗。用乙酸缓冲液（ph3.6）从柱中洗脱出mabg。监控280mm下的吸光度，获得含有mabg的级分（亲和层析合并物）。向该亲和层析合并物添加盐酸以将ph调节为3.7。这样，进行1小时病毒灭活处理。该步骤在室温下进行。在病毒灭活处理1小时后，将所得溶液用tris水溶液中和至ph5.0（病毒灭活液）。将病毒灭活液以约800g/m2的量加载于用乙酸缓冲液（ph5.0）预清洗的深层过滤器（millistak+（r）poda1hc）上，然后供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。回收mabg（深层过滤合并物）。将深层过滤合并物以约700g/m2的量加载至用乙酸缓冲液（ph5.0）预清洗的活性炭过滤器（millistak+（r）podcr40）上，然后供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。用0.2μm过滤器进行过滤，保存滤液（活性炭材料合并物）。将活性炭材料合并物通过用含有1m氯化钠的乙酸缓冲液（ph5.0）、然后用乙酸缓冲液（ph5.0）预平衡且填充有porosxs的cex柱。cex柱上的加载密度设定为约1500g/l树脂。加载后，供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。监控280mm下的吸光度，得到含有mabg的级分，然后用0.2μm过滤器过滤而得到利用f/t模式的cex材料合并物。将cex材料合并物通过用注射用水、然后用乙酸缓冲液（ph5.0）预平衡的填充有porosbenzylultra的hic柱。hic柱上的加载密度为约300g/l树脂。加载后，供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。监控280mm下的吸光度，获得含有mabg的级分，用作利用f/t模式的hic材料合并物。
改良方法3的杂质清除的结果示于表22中。单体通过疏水相互作用层析而增加。通过疏水相互作用层析将阳离子交换层析后残留的hcp和plbl2除去，特别地，plbl2被除去至定量限附近。
[表22]
实施例7：改良方法4的纯化例（mabf、mabg）
在本实施例中，将根据在实施例4的表10中所示的纯化流程图中的离子交换层析之前添加了疏水相互作用层析的、以下表23中所示的纯化流程图来说明抗体的纯化流程中的杂质清除。
[表23]
1）改良方法4的杂质清除（mabf）
在本实施例中，将根据表23中所示的纯化流程图来说明被称作mabf的单克隆抗体的纯化流程中的杂质清除。
将含有由cho细胞产生的mabf的细胞培养液用深层过滤器过滤以除去细胞，并进行澄清化。将细胞培养上清液通过使用kancapa树脂的蛋白a层析进行纯化。在将柱用含有20mm氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）平衡后，加载细胞培养上清液。然后，将该柱用含有1m氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）清洗，然后用含有20mm氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）清洗。用乙酸缓冲液（ph3.6）从柱中洗脱出mabf。监控280mm下的吸光度，获得含有mabf的级分（亲和层析合并物）。向该亲和层析合并物添加盐酸以将ph调节为3.7。这样，进行1小时病毒灭活处理。该步骤在室温下进行。在病毒灭活处理1小时后，将所得溶液用tris水溶液中和至ph5.0（病毒灭活液）。将病毒灭活液以约900g/m2的量加载于用乙酸缓冲液（ph5.0）预清洗的深层过滤器（millistak+（r）poda1hc）上，然后供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。回收mabf（深层过滤合并物）。将深层过滤合并物以约800g/m2的量加载于用乙酸缓冲液（ph5.0）预清洗的活性炭过滤器（millistak+（r）podcr40）上，然后供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。用0.2μm过滤器进行过滤，保存滤液（活性炭材料合并物）。将活性炭材料合并物通过用注射用水、然后用乙酸缓冲液（ph5.0）预平衡的填充有porosbenzylultra的hic柱。hic柱上的加载密度为约300g/l树脂。加载后，供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。监控280mm下的吸光度，获得含有mabf的级分，用作利用f/t模式的hic材料合并物。将hic材料合并物通过用含有1m氯化钠的乙酸缓冲液（ph5.0）、然后用乙酸缓冲液（ph5.0）预平衡且填充有porosxs的cex柱。cex柱上的加载密度设定为约1300g/l树脂。加载后，供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。监控280mm下的吸光度，得到含有mabf的级分，然后用0.2μm过滤器过滤而得到利用f/t模式的cex材料合并物。
改良方法4的杂质清除的结果示于表24中。单体通过疏水相互作用层析而增加。通过疏水相互作用层析将活性炭材料合并物中的残留hcp和plbl2除去，特别地，plbl2被除去至定量限附近。
[表24]
2）改良方法4的杂质清除（mabg）
在本实施例中，将根据表23中所示的纯化流程图来说明被称作mabg的单克隆抗体的纯化流程中的杂质清除。
将含有由cho细胞产生的mabg的细胞培养液用深层过滤器过滤以除去细胞，并进行澄清化。将细胞培养上清液通过使用kancapa树脂的蛋白a层析进行纯化。在将柱用含有20mm氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）平衡后，加载细胞培养上清液。然后，将该柱用含有1m氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）清洗，然后用含有20mm氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）清洗。用乙酸缓冲液（ph3.6）从柱中洗脱出mabg。监控280mm下的吸光度，获得含有mabg的级分（亲和层析合并物）。向该亲和层析合并物添加盐酸以将ph调节为3.7。这样，进行1小时病毒灭活处理。该步骤在室温下进行。在病毒灭活处理1小时后，将所得溶液用tris水溶液中和至ph5.0（病毒灭活液）。将病毒灭活液以约800g/m2的量加载于用乙酸缓冲液（ph5.0）预清洗的深层过滤器（millistak+（r）poda1hc）上，然后供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。回收mabg（深层过滤合并物）。将深层过滤合并物以约700g/m2的量加载于用乙酸缓冲液（ph5.0）预清洗的活性炭过滤器（millistak+（r）podcr40）上，然后供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。用0.2μm过滤器进行过滤，保存滤液（活性炭材料合并物）。将活性炭材料合并物通过用注射用水、然后用乙酸缓冲液（ph5.0）预平衡的填充有porosbenzylultra的hic柱。hic柱上的加载密度为约300g/l树脂。加载后，供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。监控280mm下的吸光度，获得含有mabg的级分，用作利用f/t模式的hic材料合并物。将hic材料合并物通过用含有1m氯化钠的乙酸缓冲液（ph5.0）、然后用乙酸缓冲液（ph5.0）预平衡的填充有porosxs的cex柱。cex柱上的加载密度设定为约1300g/l树脂。加载后，供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。监控280mm下的吸光度，得到含有mabg的级分，然后用0.2μm过滤器过滤而得到利用f/t模式的cex材料合并物。
改良方法4的杂质清除的结果示于表25中。单体通过疏水相互作用层析而增加。通过疏水相互作用层析将活性炭材料合并物中的残留hcp和plbl2除去，特别地，plbl2被除去至定量限附近。
[表25]
实施例8：活性炭材料的杂质清除（maba）
在本实施例中，将根据以下表26中所示的纯化流程图来说明被称作maba的单克隆抗体的利用活性炭材料的纯化流程中的杂质清除。
[表26]
1）材料和方法
将含有由cho细胞产生的maba的细胞培养液用深层过滤器过滤以除去细胞，并进行澄清化。将细胞培养上清液通过使用kancapa树脂的蛋白a层析进行纯化。在将柱用含有20mm氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）平衡后，加载细胞培养上清液。然后，将该柱用含有1m氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）清洗，然后用含有20mm氯化钠的磷酸缓冲液（ph7.5）清洗。用乙酸缓冲液（ph3.6）从柱中洗脱出maba。监控280mm下的吸光度，获得含有maba的级分（亲和层析合并物）。向该亲和层析合并物添加盐酸以将ph调节为3.5。这样，进行1小时病毒灭活处理。该步骤在室温下进行。在病毒灭活处理1小时后，将所得溶液用tris水溶液中和至ph5.0（病毒灭活液）。将病毒灭活液以124l/m2的体积加载于用乙酸缓冲液（ph5.0）预清洗的深层过滤器（millistak+（r）poda1hc）上，然后供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。回收maba（深层过滤合并物）。将该深层过滤合并物通过盐酸或tris水溶液调节，以具有ph4.5、ph5.0、ph5.5、ph6.0、ph6.5、ph7.0或ph7.5，用0.2μm过滤器进行过滤。保存滤液（调节了ph的活性炭材料加载物）。将深层过滤合并物通过超滤/渗滤调节，以具有电导率2ms/cm、4ms/cm、5ms/cm、6ms/cm、8ms/cm或10ms/cm，用0.2μm过滤器进行过滤。保存滤液（调节了电导率的活性炭材料加载物）。
将调节了ph的活性炭材料加载物以60l/m2或100l/m2的体积加载于用具有与加载溶液相同ph的乙酸缓冲液（ph4.5、ph5.0、ph5.5、ph6.0、ph6.5、ph7.0、ph7.5）预清洗的活性炭过滤器（millistak+（r）podcr40）上，然后供给具有与加载溶液相同ph的乙酸缓冲液（ph4.5、ph5.0、ph5.5、ph6.0、ph6.5、ph7.0、ph7.5）进行追赶。回收maba作为调节了ph的活性炭材料合并物。将调节了电导率的活性炭材料加载物以60l/m2的体积加载于用乙酸缓冲液（ph5.0）清洗的活性炭过滤器（millistak+（r）podcr40）上，然后供给乙酸缓冲液（ph5.0）进行追赶。回收maba作为调节了电导率的活性炭材料合并物。
2）结果
将表26中所示的纯化流程图中的活性炭过滤的杂质清除的结果（加载体积:60l/m2）示于表27和表28。hcp除去率没有受到ph和电导率的显著影响。plbl2的除去率存在随着ph降低或电导率降低而升高的趋势。浸出蛋白a的除去率存在随着ph降低而升高的趋势。mlv和mmv的除去率存在随着ph降低或电导率降低而升高的趋势。证实了根据表26中所示的纯化流程图得到的活性炭材料加载物的ph和电导率的条件是提供活性炭过滤的高杂质除去率的条件。
[表27]
[表28]
工业适用性
由于本发明的抗体纯化方法，可以缩短纯化周期，有效率地除去杂质，将抗体纯化至足以用于人类治疗用途的程度，和降低生产成本。