一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法

本发明属于去甲肾上腺素的制备技术领域，具体涉及一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法。

背景技术：

去甲肾上腺素(norepinephrine，ne)是一种主要由交感节后神经元和脑内肾上腺素能神经末梢合成和分泌的神经递质，血液中的ne主要来自肾上腺髓质。人工合成ne是一种升压药物，可有效用于多种危重患者的循环功能支持，目前ne常作为感染性休克患者血压维持的一线治疗药物。临床上用药形式为左旋异构体，常用其重酒石酸盐，即重酒石酸去甲肾上腺素。主要用于治疗急性低血压和周围血管扩张所引起的休克等。

目前文献报道的合成路线中均采用催化氢化还原法得到ne，该反应在加压条件下进行，反应危险性较大，对生产设备要求高，需要专门的氢化车间。因此必须加强对ne作用机理、合成途径的研究，寻找相对安全、廉价、高效的合成途径。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法，该方法反应条件温和，易控制，成本低廉，避免了化学合成过程中副产物多、拆分成本高的问题，降低其制备成本。

一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法，包括以下步骤：

步骤1，构建表达s-ta的基因工程菌bl21(de3)/pgex-6p-1-s-ta

根据已报导的黑熊来源l-苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列进行密码子优化后，委托擎科生物科技有限公司(南京)全基因合成优化后的序列，亚克隆到载体pgex-6p-1上，获得重组质粒pgex-6p-1-s-ta，将构建好的重组质粒pgex-6p-1-s-ta用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主bl21(de3)，得到表达l-苏氨酸醛缩酶菌种bl21(de3)/pgex-6p-1-s-ta；

步骤2，构建表达tdc的基因工程菌bl21(de3)/pcdf-duet-tdc

根据已报导的短乳杆菌来源酪氨酸脱羧酶的氨基酸序列进行密码子优化后，委托擎科生物科技有限公司(南京)全基因合成优化后的序列，亚克隆到载体pcdf-duet上，获得重组质粒pcdf-duet-tdc，将构建好的重组质粒pcdf-duet-tdc用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主bl21(de3)，得到表达l-苏氨酸醛缩酶菌种bl21(de3)/pcdf-duet-tdc；

步骤3，培养s-ta的基因工程菌bl21(de3)/pgex-6p-1-s-ta

挑取表达s-ta的基因工程菌bl21(de3)/pgex-6p-1-s-ta的单菌落，接种于lb培养基，37℃培养至od值达到0.6-0.8，再加入0.25mm-1mm的iptg，15-30℃培养12-18小时，离心收集表达l-苏氨酸醛缩酶的基因工程菌bl21(de3)/pgex-6p-1-s-ta；

步骤4，培养tdc的基因工程菌bl21(de3)/pcdf-duet-tdc

挑取表达tdc的基因工程菌bl21(de3)/pcdf-duet-tdc的单菌落，接种于lb培养基，37℃培养至od值达到0.6以上，再加入0.25mm-1mm的iptg，15-30℃培养12-18小时，离心收集表达酪氨酸脱羧酶的基因工程菌bl21(de3)/pcdf-duet-tdc；

步骤5，收集表达l-苏氨酸醛缩酶的基因工程菌bl21(de3)/pgex-6p-1-s-ta，用ph6-11的pbs缓冲液重悬，使用匀浆破碎仪破碎重悬后的基因工程菌，破碎完成后，4000-8000rpm，4℃，离心8-10min获得l-苏氨酸醛缩酶粗酶液，并用酶标仪测定蛋白浓度；

步骤6，收集表达酪氨酸脱羧酶的基因工程菌bl21(de3)/pcdf-duet-tdc，用ph6-11的pbs缓冲液重悬，使用匀浆破碎仪破碎重悬后的基因工程菌，破碎完成后，4000-8000rpm，4℃，离心8-10min获得酪氨酸脱羧酶粗酶液，并用酶标仪测定蛋白浓度；

步骤7，选取3,4-二羟基苯甲醛作为底物，甘氨酸为辅底物，5-磷酸吡哆醛为辅因子，加入s-ta、tdc粗酶液，再添加pbs缓冲溶液调节反应体系的ph至6-11后，20-60℃反应0.5-24h；

步骤8，完成催化反应，加入等体积比1n稀盐酸，12000rpm离心2min，采用1ml注射器吸取离心得到的上清液，并用0.22μm滤膜除去杂质，将去除杂质的反应液注入1.5ml液相小瓶中，检测产物生成情况。

作为改进的是，步骤3中所述产酶条件为：加入iptg的量为0.5mm/l，诱导温度为18-30℃。

作为改进的是，步骤4中所述产酶条件为：加入iptg的量为0.5mm/l，诱导温度为20-33℃

作为改进的是，步骤5和步骤6中pbs缓冲液主要成分为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。

作为改进的是，步骤7中3,4-二羟基苯甲醛的终浓度为20-100mm/l、甘氨酸的终浓度为0.1-5m/l、5-磷酸吡哆醛的终浓度为1-100μm/l，s-ta粗酶液的蛋白浓度为0.1-10g/l，tdc粗酶液的蛋白浓度为0.1-10g/l。

进一步改进的是，步骤7中3,4-二羟基苯甲醛终浓度为60mm/l，甘氨酸终浓度为1m/l，5-磷酸吡哆醛终浓度为20μm/l。

进一步改进的是，步骤7中所加入s-ta粗酶液蛋白浓度为1g/l，加入tdc粗酶液蛋白浓度为6g/l。

进一步改进的是，步骤7中该反应体系的反应温度30℃，反应ph为7.5。

有益效果：

与现有技术相比，本发明一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法具有如下优势：该方法是首次系统的做出从3,4-二羟基苯甲醛到去甲肾上腺素的酶催化生产工艺，环境友好，原料易得，生产成本低，工艺简单，反应条件温和，具有很好的工业化生产前景。

附图说明

图1为本发明产物去甲肾上腺素标准品的高效液相色谱图；

图2为本发明产物去甲肾上腺素的定量标准曲线图；

图3为本发明底物3,4-二羟基苯甲醛标准品的高效液相色谱图；

图4为本发明反应液中产物以及底物的高效液相色谱图；

图5.反应液中产物去甲肾上腺素高分辨质谱图。

具体实施方案

以下实施例中，lb培养基的配方：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，5g/l氯化钠；实施例中所采用的试剂均为常规试剂。

实施例1

步骤1，构建表达s-ta的基因工程菌bl21(de3)/pgex-6p-1-s-ta

根据已报导的黑熊来源l-苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列进行密码子优化后，序列如seqno.1所示，委托擎科生物科技有限公司(南京)全基因合成优化后的序列，亚克隆到载体pgex-6p-1上，获得重组质粒pgex-6p-1-s-ta，将构建好的重组质粒pgex-6p-1-s-ta用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主bl21(de3)，得到表达l-苏氨酸醛缩酶菌种bl21(de3)/pgex-6p-1-s-ta；

步骤2，构建表达tdc的基因工程菌bl21(de3)/pcdf-duet-tdc

根据已报导的短乳杆菌来源酪氨酸脱羧酶的氨基酸序列进行密码子优化后，序列如seqno.2所示，委托擎科生物科技有限公司(南京)全基因合成优化后的序列，亚克隆到载体pcdf-duet上，获得重组质粒pcdf-duet-tdc，将构建好的重组质粒pcdf-duet-tdc用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主bl21(de3)，得到表达l-苏氨酸醛缩酶菌种bl21(de3)/pcdf-duet-tdc；

步骤3，培养s-ta的基因工程菌bl21(de3)/pgex-6p-1-s-ta

挑取表达s-ta的基因工程菌bl21(de3)/pgex-6p-1-s-ta的单菌落，接种于lb培养基，37℃培养至od值达到0.6-0.8，再加入0.25mm-1mm的iptg，15-30℃培养12-18小时，离心收集表达l-苏氨酸醛缩酶的基因工程菌bl21(de3)/pgex-6p-1-s-ta；

步骤4，培养tdc的基因工程菌bl21(de3)/pcdf-duet-tdc

挑取表达tdc的基因工程菌bl21(de3)/pcdf-duet-tdc的单菌落，接种于lb培养基，37℃培养至od值达到0.6以上，再加入0.25mm-1mm的iptg，15-30℃培养12-18小时，离心收集表达酪氨酸脱羧酶的基因工程菌bl21(de3)/pcdf-duet-tdc；

步骤5，收集表达l-苏氨酸醛缩酶的基因工程菌bl21(de3)/pgex-6p-1-s-ta，用ph6-11的pbs缓冲液重悬，使用匀浆破碎仪破碎重悬后的基因工程菌，破碎完成后，4000-8000rpm，4℃，离心8-10min获得l-苏氨酸醛缩酶粗酶液，并用酶标仪测定蛋白浓度；

步骤6，收集表达酪氨酸脱羧酶的基因工程菌bl21(de3)/pcdf-duet-tdc，用ph6-11的pbs缓冲液重悬，使用匀浆破碎仪破碎重悬后的基因工程菌，破碎完成后，4000-8000rpm，4℃，离心8-10min获得酪氨酸脱羧酶粗酶液，并用酶标仪测定蛋白浓度；

步骤7，选取3,4-二羟基苯甲醛作为底物，甘氨酸为辅底物，5-磷酸吡哆醛为辅因子，加入s-ta、tdc粗酶液，再添加pbs缓冲溶液调节反应体系至1ml，ph为6-11，20-60℃反应0.5h-24h；

步骤8，完成催化反应，加入等体积比1n稀盐酸，12000rpm离心2min，取上清液检测产物生成情况。

实施例2

催化产去甲肾上腺素，具体操作步骤为反应体系为1ml，取3,4-二羟基苯甲醛终浓度为60mm/l、甘氨酸终浓度为1m/l，5-磷酸吡哆醛终浓度为20μm/l，再加入1g/ls-ta、6g/ltdc，用pbs缓冲液调节体系至1ml，ph7.5，30℃反应2-12h。

反应结束后，利用高效液相色谱法，xselecthsst3型色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相为23.3g氯化钠(上海迈瑞尔化学技术有限公司)、1ml冰乙酸，用水稀释到1l，混2％的纯乙腈(分析纯)溶液，柱温30℃，紫外检测波长280nm，流速5ml/min。

采取梯度洗脱法：

经高效液相色谱方法检测后，得到如图4所示结果图，其中7.353min处出峰为产物去甲肾上腺素的检测峰，经计算得到产物量为6.3g/l。

综上所述，本发明一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法为首次系统的做出从3,4-二羟基苯甲醛到去甲肾上腺素的酶催化生产工艺，环境友好，原料易得，生产成本低，工艺简单，反应条件温和，具有很好的工业化生产前景。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110>南京工业大学

<120>一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法

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<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1032

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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