一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法

文档序号:25483164发布日期:2021-06-15 21:43阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法,其特征在于,包括以下步骤:

步骤1,构建表达s-ta的基因工程菌bl21(de3)/pgex-6p-1-s-ta

根据已报导的黑熊来源l-苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列进行密码子优化后,全基因合成优化后的序列,亚克隆到载体pgex-6p-1上,获得重组质粒pgex-6p-1-s-ta,将构建好的重组质粒pgex-6p-1-s-ta用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主bl21(de3),得到表达l-苏氨酸醛缩酶菌种bl21(de3)/pgex-6p-1-s-ta;

步骤2,构建表达tdc的基因工程菌bl21(de3)/pcdf-duet-tdc

根据已报导的短乳杆菌来源酪氨酸脱羧酶的氨基酸序列进行密码子优化后,全基因合成优化后的序列,亚克隆到载体pcdf-duet上,获得重组质粒pcdf-duet-tdc,将构建好的重组质粒pcdf-duet-tdc用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主bl21(de3),得到表达l-苏氨酸醛缩酶菌种bl21(de3)/pcdf-duet-tdc;

步骤3,培养s-ta的基因工程菌bl21(de3)/pgex-6p-1-s-ta

挑取表达s-ta的基因工程菌bl21(de3)/pgex-6p-1-s-ta的单菌落,接种于lb培养基,37℃培养至od值达到0.6-0.8,再加入0.25mm-1mm的iptg,15-30℃培养12-18小时,离心收集表达l-苏氨酸醛缩酶的基因工程菌bl21(de3)/pgex-6p-1-s-ta;

步骤4,培养tdc的基因工程菌bl21(de3)/pcdf-duet-tdc

挑取表达tdc的基因工程菌bl21(de3)/pcdf-duet-tdc的单菌落,接种于lb培养基,37℃培养至od值达到0.6以上,再加入0.25mm-1mm的iptg,15-30℃培养12-18小时,离心收集表达酪氨酸脱羧酶的基因工程菌bl21(de3)/pcdf-duet-tdc;

步骤5,收集表达l-苏氨酸醛缩酶的基因工程菌bl21(de3)/pgex-6p-1-s-ta,用ph6-11的pbs缓冲液重悬,使用匀浆破碎仪,破碎完成后,4000-8000rpm,4℃,离心8-10min获得l-苏氨酸醛缩酶粗酶液,并用酶标仪测定蛋白浓度;

步骤6,收集表达酪氨酸脱羧酶的基因工程菌bl21(de3)/pcdf-duet-tdc,用ph6-11的pbs缓冲液重悬,使用匀浆破碎仪,破碎完成后,4000-8000rpm,4℃,离心8-10min获得酪氨酸脱羧酶粗酶液,并用酶标仪测定蛋白浓度;

步骤7,选取3,4-二羟基苯甲醛作为底物,甘氨酸为辅底物,5-磷酸吡哆醛为辅因子,加入s-ta粗酶液、tdc粗酶液,再添加pbs缓冲溶液调节反应体系的ph至6-11,最后20-60℃反应0.5h-24h;

步骤8,完成催化反应,加入等体积比1n稀盐酸,12000rpm离心2min,采用1ml注射器吸取离心得到的上清液,并用0.22μm滤膜除去杂质,将去除杂质的反应液注入1.5ml液相小瓶中,检测产物生成情况。

2.根据权利要求1所述的一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法,其特征在于,步骤3中所述产酶条件为:加入iptg的量为0.5mm/l,诱导温度为18-30℃。

3.根据权利要求1所述的一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法,其特征在于,步骤4中所述产酶条件为:加入iptg的量为0.5mm/l,诱导温度为20-33℃。

4.根据权利要求1所述的一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法,其特征在于,步骤5和步骤6中pbs缓冲液pbs缓冲液主要成分为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。

5.根据权利要求1所述的一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法,其特征在于,步骤7中3,4-二羟基苯甲醛的终浓度为20-100mm/l、甘氨酸的终浓度为0.1-5m/l、5-磷酸吡哆醛的终浓度为1-100μm/l,s-ta粗酶液的蛋白浓度为0.1-10g/l,tdc粗酶液的蛋白浓度为0.1-10g/l。

6.根据权利要求5所述的一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法,其特征在于,步骤7中3,4-二羟基苯甲醛终浓度为60mm/l,甘氨酸终浓度为1m/l,5-磷酸吡哆醛终浓度为20μm/l。

7.根据权利要求5所述的一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法,其特征在于,步骤7中所加入s-ta粗酶液蛋白浓度为1g/l,加入tdc粗酶液蛋白浓度为6g/l。

8.根据权利要求5所述的一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法,其特征在于,步骤7中该反应体系的反应温度30℃,反应ph为7.5。


技术总结
本发明公开了一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法,该方法以BL21DE3为出发菌株,在出发菌株基础上分别过表达了来源于黑熊中编码L‑苏氨酸醛缩酶的S‑TA基因和短乳杆菌中编码酪氨酸脱羧酶的TDC基因,通过上述操作得到两株工程菌,通过细胞破碎得到的粗酶液,以3,4‑二羟基苯甲醛为底物,甘氨酸为辅底物,5‑磷酸吡哆醛为辅因子进行反应后得到去甲肾上腺素的产量为6.3g/L。与现有技术相比,本发明方法生物合成法有着绿色,高产,条件温和等优点,尤其是副产物少,对环境友好度高,且所需生产设备成本大大降低。

技术研发人员:王昕;乔荣梅;陈可泉;张琨;冯娇;麦丹丹;马琛;陆佳晨
受保护的技术使用者:南京工业大学
技术研发日:2021.02.25
技术公布日:2021.06.15
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