一种固定化模板多核苷酸配对末端测序方法与流程

1.本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种固定化模板多核苷酸配对末端测序方法。


背景技术：

2.配对末端测序允许确定来自一条多核苷酸双链两个位置的序列的两个读取，由于配对末端序列并非是完全随机的，而是已知发生在单个双链上，在基因组中是相连或成对的，有助于将全基因组的序列组合成一致的序列，提高一次测序获得的序列信息的长度。
3.现有技术中公开的基于阵列多核苷酸模板的配对末端测序方法包括，wo2004/070005中公开的在固体支持物上实施的，将两个或多个引物同时与靶多核苷酸杂交，在杂交步骤之后，除一个引物之外，封闭其他所有与模板杂交的引物，未被封闭的引物进行延伸测序，完成测序之后，被封闭引物中的一个解除封闭以得到游离3’羟基进行另一个延伸测序反应。该方法实施过程中虽然阵列的多核苷酸模板始终连接在固体支持物上，保持多核苷酸模板链的稳定性，但是必须要确保只有一个引物可延伸，其他引物必须完全封闭，在实际操作过程中很难确保其他引物的完全封闭，导致高的测序错误率；
4.wo2007010252公开了在固体支持物上形成双链模板簇，将双链模板簇变性形成单链簇，去除部分双链模板簇的其中一条链，对剩余的一条链进行测序；完成一次测序后，对剩余部分双模板簇中的与一次测序中序列相同的单链模板去除，对剩余的与该去除的模板链互补的链进行测序，完成双链模板的双末端测序。该方法一次只能对一部分簇的一条链进行测序，不能完全利用所有的簇，导致测序信号强度达不到预期；
5.wo2008041002公开了首先对全部的双链模板簇的其中一条链去除，对剩余的链测序，然后再以剩余的链为模板扩增形成其互补链，对其互补链进行测序，最终实现双末端测序。该方法需要首先形成第一端测序的模板链簇，然后再以第一端测序的模板链为模板扩增形成其互补链的簇作为第二段测序的模板，由于成簇的过程存在一定的无序性，该方法第二端测序的二次成簇过程会增加簇形成的无序性，使第二端测序的簇范围变大，增加簇信号校正的复杂性。因此，需要对现有的配对末端测序方法进一步创新改进，在确保第二端测序稳定性的同时，避免第二端测序的簇范围变大，降低簇信号校正的复杂性。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一是提供一种固定化多核苷酸模板配对末端测序方法，提高第二端测序的稳定性，降低簇信号校正的复杂性，提高测序质量。
7.同时，本发明还在于提供一种实施本发明测序方法的试剂盒。
8.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
9.一种固定化多核苷酸模板配对末端测序方法，包括以下操作步骤：
10.s1、提供固定在固体支持物上的阵列的单链模板多核苷酸簇，作为第一端测序模板链，加入第一测序引物，对单链模板多核苷酸至少部分序列进行测序，获得第一测序引物
的延伸链和对应的第一末端序列信息；
11.s2：以第一端测序模板链为模板，形成与第一端测序模板链全长互补的多核苷酸链，称为互补链；
12.s3：第一端测序模板链的3’端与互补链的5’端连接，解除第一端测序模板链和互补链的双链杂交结构，并封闭第一端测序模板链，阻止复性环境下互补链与第一端测序模板链重新杂交；
13.s4：加入与互补链的3’端互补配对的第二测序引物，对互补链的至少部分序列进行测序，获得第二末端序列信息。
14.可选的，步骤s2中形成互补链的具体方法为将完成第一端测序的第一测序引物的延伸多核苷酸链继续以第一端测序模板链为模板延伸，形成与第一端测序模板链全长互补的多核苷酸链。
15.或者可选的，步骤s2中形成互补链的具体方法为，在变性条件下，将第一测序引物的延伸链与第一端测序模板链解除双链结构，去除第一测序引物的延伸链，加入至少部分与第一端测序模板链的3’端互补的扩增引物，以第一端测序模板链为模板，延伸扩增引物形成与第一端测序模板链全长互补的多核苷酸链。
16.可选的，步骤s3中解除第一端测序模板链和互补链的双链杂交结构，并封闭第一端测序模板链的方法为：在变性条件下，第一端测序模板链和互补链解除双链杂交结构，形成长单链，之后加入仅与长单链的第一端测序模板链的3’端互补配对的第一延伸引物，第一延伸引物以第一端测序模板链为模板延伸形成与第一端测序模板链互补杂交的第一延伸引物链，封闭第一端测序模板链。
17.进一步优选的，在形成长单链之后，加入单链结合蛋白，之后再加入仅与长单链的第一端测序模板链的3’端互补配对的第一延伸引物。
18.引物延伸环境下互补链存在与模板链杂交的可能性，为了避免互补链与模板链的复性杂交，通过控制簇密度与第一延伸引物的浓度关系或者第一延伸引物进行化学修饰。控制第一延伸引物的延伸速率大于互补链与模板链的复性杂交速率，利用动力学排除原理降低互补链与模板链复性杂交的可能性，提高利用互补链进行第二端测序的可行性和准确性。
19.可选的，步骤s3中解除第一端测序模板链和互补链的双链杂交结构，并封闭第一端测序模板链的方法为：加入与第一端测序模板链的3’端互补配对的第二延伸引物，在链置换反应的环境下，第二延伸引物以第一端测序模板链为模板延伸，同时置换出与第一端测序模板链杂交的互补链，第二延伸引物形成的与第一端测序模板链互补配对杂交的第二延伸引物链，封闭第一端测序模板链。进一步可选的，通过重组酶将第二延伸引物与第一端测序模板链的3’端互补杂交，在链置换环境下延伸第二延伸引物同时置换出与第一端测序模板链杂交的互补链；同时应当可以理解的是，在不使用重组酶的情况下，通过在第一端测序模板链的3’端预留单链区域，第二延伸引物与该单链区域互补杂交，在链置换环境下延伸第二延伸引物同样能够置换出与第一端测序模板链杂交的互补链。
20.可选的，步骤s3中第一端测序模板链的3’端与互补链的5’端连接的方法为：在第一端测序模板链的3’末端形成第一官能团，互补链的5’末端形成第二官能团，引发第一官能团和第二官能团发生点击化学反应，将第一测序模板链的3’端与互补链的5’端共价连
接。
21.可选的，在第一端测序模板链的3’末端形成第一官能团的方法包括采用末端转移酶将3’修饰有第一官能团的修饰核苷酸连接在第一测序模板链的3’末端；
22.互补链的5’末端形成第二官能团的方法包括采用5’末端修饰有第二官能团的引物，以第一端测序模板链为模板延伸形成互补链。
23.可以理解的是任何能够发生点击化学反应的第一官能团和第二官能团均可应用于本发明，作为举例说明，在本发明的一些实施例中，第一官能团选择采用叠氮、炔、环炔、环烯或杂环烯；对应的第二官能团选择采用环烯、杂环烯、炔、环炔或叠氮。
24.可选的，步骤s3中第一端测序模板链的3’端与互补链的5’端的连接除了可以采用上述化学共价连接的方法之外，也可以采用生物酶法连接。在本发明的一个实施例中，采用生物酶法连接的具体实现方式包括在步骤s2中设计茎环结构的扩增引物用于延伸形成互补链，扩增引物的3’茎部分具有凸出的单链区域，至少部分的凸出的单链区域与第一端测序模板链的3’端互补配对杂交；加入连接酶将扩增引物5’端与第一端测序模板链的3’端连接。
25.也可以采用其他茎环结构的扩增引物形成互补链，并实现第一端测序模板链的3’端与互补链的5’端的连接，具体的，在本发明的另一个实施例中，扩增引物的5’端存在不与第一端测序模板链互补配对的单链区域，再另外加入能够与扩增引物的单链区域互补配对杂交的茎环结构的辅助引物，加入连接酶，将辅助引物的5’端与第一端测序模板链的3’端对应连接，辅助引物的3’端与第一端测序模板链的5’端对应连接。
26.本发明测序方法，第一端测序模板链固定化在芯片上，通过将第一端测序模板链的互补链直接连接在其3’端的方式，将互补链间接固定在芯片上，解除第一端测序模板链与互补链之间的双链结构，通过封堵第一端测序模板链的方式，避免互补链在复性环境与第一端测序模板链再杂交结合，进而实现以互补链为模板进行第二端测序。整个测序方法的第二端测序的模板链直接连接在第一端测序模板链的位置，克服了传统双末端测序方法第二端测序重新成簇造成的簇有序性降低、簇范围变大等导致的测序信号稳定性差等技术缺陷。
附图说明
27.图1为本发明具体实施方式提供的测序方法原理示意图。
28.图2为实施例1中d-m02、d-m02-t、d-m02-l、l-m02-p、d-m02-c变性page胶分析结果示意图；
29.图3为本发明实施例2测序方法运行的绿色荧光信号图像；
30.图4为本发明实施例2测序方法运行的红色荧光信号图像。
具体实施方式
31.下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
32.1、单链模板多核苷酸
33.本发明单链模板多核苷酸是指任何单链形式存在的多核苷酸链，作为第一端测序的模板，优选为呈线性结构的单链形式；
34.其中线性结构的单链模板多核苷酸包括第一衔接子、第二衔接子和插入第一衔接子和第二衔接子的靶dna序列，第一衔接子提供第一测序引物结合位点、扩增引物结合位点、第一延伸引物结合位点和/或第二延伸引物结合位点，第二衔接子至少部分序列与第二测序引物序列相同；在一些实施例中第一衔接子和第二衔接子采用通用序列，实现不同靶dna序列的大规模并行测序，可以通过在第一衔接子和第二衔接子中插入标签序列的方式标记不同样本的靶dna和测序方向。
35.2、单链模板多核苷酸文库构建
36.2.1文库构建方法概述
37.在许多大规模并行测序技术中，生成测序模板文库的方法有很多种，在某些实施例中，按照“solexa”型测序中通常采用的建库方法，构建线性结构的单链模板多核苷酸文库，将基因组dna首先片段化，然后将dna片段两端连接至平台特异性寡核苷酸衔接子，一端衔接子用于将单个片段固定在固体支持物上，在固体支持物上扩增单个片段产生用于测序的单链模板多核苷酸簇；
38.应当可以理解的是，本发明可以采用任意本领域公知的文库构建方法，构建包括许多不同的靶dna序列但共享相同的衔接子序列的阵列结构，实现大规模平行测序。
39.2.2衔接子
40.上述单链模板多核苷酸文库构建中使用到的衔接子可以包含用于将模板dna多核苷酸固定在固相支持物上的元件(比如第二衔接子5’端带有能够与固体支持物上官能团反应的修饰基团)，还可以包括限制性内切酶识别位点、延伸引物杂交位点、条形码序列、独特的分子标识符序列和聚合酶识别序列等(比如上述模板多核苷酸结构中第一衔接子、第二衔接子上设置的延伸引物结合位点、测序引物结合位点、标签序列等)；
41.衔接子序列可以具有适用于特定测序平台和预期用途的长度、结构和其他特性。比如衔接子可以是单链、双链或部分双链，长度可以在10～200个核苷酸、20～100个核苷酸、40～100个核苷酸或50～80个核苷酸的范围内。在一些实施例中，库的不同成员通常将包含公共衔接子序列，尽管库中的不同种类或子类别可具有独特特征，如标签序列或者子属特异性条形码；
42.单独衔接子可以包括多个功能不同的子序列，比如在本发明实施例中，上述线性结构的单链模板多核苷酸的第一衔接子包括第一测序引物结合位点、第一延伸引物结合位点、第二延伸引物结合位点、扩增引物结合位点，不同的功能序列可以根据实际需要选择重叠或者不重叠，相邻或者间隔一定的距离设置。重叠区域可以是5％重叠、10％重叠、20％重叠、30％重叠、40％重叠或者50％重叠，不重叠可以是由1～10、10～20、30～40或40～50个核苷酸分开。
43.2.3形成固定在固体支持物上的阵列结构的单链模板多核苷酸簇
44.本发明限定单链模板多核苷酸呈阵列形式固定在固体支持物上，可以是以阵列形式固定在平整的固体支持物表面，阵列结构中的所有单链模板多核苷酸处于完全相同且均一的反应环境中；也可以是固体支持物上设置有阵列的凹陷结构，各个单链模板多核苷酸固定在相应的凹陷结构内，每个凹陷结构形成一个独立的反应室；
45.本发明可以采用任意的本领域已知可以实现的扩增成簇方法构建固定在固体支持物上的阵列结构的单链多核苷酸模板，例如：
46.在一些实施例中，采用桥式扩增的方式形成固定在固体支持物上的阵列结构的单链模板多核苷酸；
47.在另外一些实施例中，采用非桥式扩增的方式，固体支持物上预先固定连接一种能够与片段化dna的一端衔接子杂交结合的接头序列(通常作为形成的单链模板多核苷酸的第二衔接子)，采用类似zhaochun ma等在论文《isothermal amplification method for next-generation sequencing》中公开的扩增成簇方法形成固定在固体支持物上的阵列结构的单链模板多核苷酸；应当可以理解的是，本发明也可以采用其他能够通过预先在固体支持物上固定连接一种接头的方式扩增单链片段化dna形成阵列的单链模板多核苷酸簇，簇的形成方式不决定本发明测序方法的实施。
48.3、单链模板多核苷酸第一端测序
49.在一些实施例中，单链模板多核苷酸的第一端测序方法包括，按照上述方法提供固定在固体支持物上的阵列的单链模板多核苷酸簇，单链模板多核苷酸的3’端设置第一衔接子、5’端通过第二衔接子固定在固体支持物上，第一衔接子上设置有第一测序引物结合位点，加入第一测序引物，第一测序引物结合在第一衔接子的相应位置，可以通过合成测序方法、连接测序方法或焦磷酸测序方法实施单链模板多核苷酸的第一端测序，获得第一测序引物的延伸链和对应的第一末端序列信息；
50.4、单链模板多核苷酸互补链的生成
51.在本发明的一个实施例中，在完成第一端测序之后，以第一端测序模板链为模板，继续延伸第一测序引物的延伸链，获得与第一端测序模板链互补的互补链；
52.在本发明的另一个实施例中，在完成第一端测序之后，去除第一测序引物的延伸链，加入扩增引物，第一衔接子上设置扩增引物结合位点，延伸扩增引物形成与第一端测序模板链互补的互补链；
53.5、第二端测序模板链的固定
54.以上述形成的第一端测序模板链的互补链为模板进行第二端测序，需要将该互补链形成稳定的单链结构，并且固定在固体支持物上。首先需要实现第一端测序模板链的3’末端与互补链的5’末端的连接，可以采用化学共价连接或者生物酶法连接的方式实现。
55.其中化学共价连接的方法的实现方式包括，在本发明的一个实施例中，首先采用末端转移酶在第一端测序模板链的3’末端连接3’修饰有第一官能团的修饰核苷酸，第一官能团可以选自叠氮、炔、环炔、烯或环烯；采用5’末端具有第二官能团修饰的第一测序引物形成第一端测序模板链的互补链，在本发明的另一个实施例中，采用5’末端具有第二官能团修饰的扩增引物形成第一端测序模板链的互补链，第二官能团对应的选自炔、环炔、烯、环烯或叠氮；通过激发第一官能团和第二官能团发生点击化学反应，将第一端测序模板链的3’末端与互补链的5’末端共价连接为一体；
56.生物酶法连接的实现方式包括，在上述本发明通过加入扩增引物形成第一端测序模板链的互补链的实施例中，设计茎环结构的扩增引物用于延伸形成互补链，扩增引物的3’茎部分具有凸出的单链区域，第一端测序模板链的第一衔接子部分设置扩增引物凸出的单链区域的结合位点，使扩增引物与第一端测序模板链互补配对杂交，加入连接酶将扩增
引物5’端与第一端测序模板链的3’端连接；
57.在本发明的另一个实施例中，采用其他茎环结构的扩增引物，具体为，扩增引物的5’端存在不与第一端测序模板链互补配对的单链区域，再另外加入能够与扩增引物的单链区域互补配对杂交的茎环结构的辅助引物，加入连接酶，将辅助引物的5’端与第一端测序模板链的3’端对应连接，辅助引物的3’端与第一端测序模板链的5’端对应连接。
58.在完成第一端测序模板链的3’末端与互补链的5’末端的连接之后，需要实现互补链的稳定单链化，其实现方式包括：
59.在本发明的一个实施例中，在变性环境下，解除第一端测序模板链与互补链的双链杂交结构，互补链形成单链结构，由于第一端测序模板链固定在固体支持物上，互补链间接固定在固体支持物上；然后加入第一延伸引物，第一衔接子设置第一延伸引物结合位点，第一延伸引物延伸与第一端测序模板链形成双链结构，通过控制第一延伸引物的浓度和tm值等性能，并控制反应条件，使第一延伸引物的延伸速率大于互补链与第一端测序模板链复性杂交结合的速率，使互补链形成稳定的单链结构；
60.在本发明的另一个实施例中，加入第二延伸引物和重组酶，将第二延伸引物与第一衔接子上设置的第二延伸引物结合位点互补杂交，在链置换反应环境下，第二延伸引物延伸同时置换出扩增引物延伸形成的互补链，同时第二延伸引物的延伸链与第一端测序的模板链形成双链结构，最终互补链形成稳定的单链结构，并通过第一端测序的模板链间接固定在固体支持物上；在本发明的另一个实施例中，不加入重组酶，将第二延伸引物的结合位点设置在扩增引物结合位点的上游，例如在上述采用茎环结构的扩增引物形成互补链的实施例中，可以将扩增引物的结合位点设置在茎环结构的单链环区域，在链置换反应环境下，第二延伸引物延伸同时置换出扩增引物延伸形成的互补链。
61.链置换活性表示生物、化学或物理试剂引起成对核酸在5’到3’的方向才能够从其互补链中解离，结合并接近于模板依赖性核酸合成的现象，置换在合成过程中遇到的下游dna；链置换开始于配对核酸序列的5’末端，因此酶在置换位点的5’端立即进行核酸合成。新合成的核酸和置换的核酸通常具有相同的与模板核酸链互补的核苷酸序列。链置换活性可以位于与赋予核酸合成的活性的分子相同的分子上，或者可以是单独和独立的活性。例如dna聚合酶，如大肠杆菌dna聚合酶ⅰ，dna聚合酶ⅰ的klenow片段、t7或t5噬菌体的dna聚合酶和hiv病毒转录酶，是具有聚合酶活性和链置换活性两者的酶。例如解旋酶之类的试剂可以与不具有链置换活性的诱导剂结合使用以产生链置换效应。
62.在本发明的一些实施例中，通过采用具有链置换活性的dna聚合酶的方式提供链置换活性反应环境，例如phi29聚合酶、bst聚合酶、bsu dna聚合酶，vent dna聚合酶，bsm dna聚合酶大片段。
63.6、第二端测序
64.本发明实施例中，第一端测序的模板链3’端设置已知序列的第二衔接子，上述实施例中形成的与第一端测序的模板链互补的互补链的5’端具有与第二衔接子互补的序列，在形成稳定的单链结构的互补链之后，加入第二测序引物，第二测序引物与第二衔接子的至少部分序列相同，通过合成测序方法、连接测序方法或焦磷酸测序方法以互补链为模板进行测序，完成第二端测序。
65.实施例1
66.本实施例为了验证一端为发夹结构的双链模板，在加入与发夹结构的环结构单链区域互补的引物后可运行链置换反应获得对应的产物
67.实施例所用试验材料：
68.单链模板m02：
69.aatgatacggcgaccaccgtcgaggactatcggatcattcgacttacgttactcgatcaatcaagtcaatcgaact
70.扩增引物m02-p：ttcgattgacttgattg
71.引物l-m02-1:
72.cgggctcggaacgaaagttagctaagcgtgcttaccccgag
73.链置换引物l-m02-p：
74.gtaagcacgcttagctaactttc
75.taq mix(2
×
taq pcr预混试剂ⅱ，kt21，天根生化科技(北京)有限公司)、t4 pnk buffer(t4多聚核苷酸激酶反应缓冲液，m0201s,neb)、t4 dna连接酶及缓冲液(t4 dna连接酶及反应缓冲液，m0202s，neb)、bsu dna聚合酶及缓冲液(bsu dna聚合酶，大片段，m0330s，neb)
76.本实施例验证试验方法步骤包括：
77.1)单链模板扩增为双链结构：
78.取单链模板m02 1μl、扩增引物m02-p 1μl、2
×
taq mix 25μl、ddh2o 23μl，60℃温度下，反应30min，磁珠回收产物，获得3’具有一个碱基突出端的双链结构产物d-m02；
79.2)发夹结构退火：
80.取引物l-m02-1 5μl，t4 pnk buffer 5μl，ddh2o 40μl，运行退火温度程序：95℃5min，95℃缓慢将至37℃，每个循环降低1℃，4℃5min，获得发夹结构引物l-m02-t；
81.3)连接：
82.取步骤1)获得的d-m02 5μl、l-m02-t 3μl、t4 dna连接酶1μl、t4 dna连接酶缓冲液1μl，37℃反应2小时，获得产物d-m02-l；
83.4)链置换扩增：
84.取d-m02-l 7μl、l-m02-p 1μl、bsu聚合酶1μl、缓冲液1μl，60℃反应30min，获得产物d-m02-c。
85.对d-m02、d-m02-t、d-m02-l、l-m02-p、d-m02-c分别进行变性page胶进行分析，如图2所示，结果表明产物d-m02-c包括长片段结构，表明一端为发夹结构的双链模板，在加入与发夹结构的茎环位点互补的引物后可运行链置换反应获得对应的产物。
86.实施例2
87.本实施例提供采用本发明测序方法进行双末端测序的具体实施例
88.1、构建单链模板多核苷酸簇：
89.设计第一衔接子序列为：
[0090]5’‑
aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’；
[0091]
第二衔接子序列为：
[0092]
5'-gatcggaagagcggttcagcaggaatgccgagaccgatctcgtatgccgtcttctgcttg-3'；
[0093]
已知序列的phix174基因组序列作为待测序核苷酸链。
[0094]
将第一衔接子和第二衔接子连接在待测序核苷酸链的两端，采用zhaochun ma等在论文《isothermal amplification method for next-generation sequencing》中公开的扩增成簇方法形成固定在芯片上的阵列结构的单链模板多核苷酸簇；
[0095]
2、第一端测序：
[0096]
设计第一测序引物为5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’；将1um的第一测序引物加入形成单链模板多核苷酸簇的芯片反应室流道中，以不同荧光染料标记的可逆终止子核苷酸为修饰核苷酸原料，在60℃下进行边合成边测序，进行50个循环；加入变性试剂，使双链结构变性，洗去第一测序引物延伸链；
[0097]
3、第二端测序：
[0098]
设计茎环结构的扩增引物:
[0099]5’‑
p-gctcggcgaaagttagctaagcgtgcttaccccgagcaatgatacggcgac-3’[0100]
设计上游扩增引物为：5
’‑
acgcttagctaactttcg-3’，该上游扩增引物作为前述第二延伸引物；
[0101]
将2μm的茎环结构扩增引物加入完成第一端测序的芯片反应流道中，在50℃下，使茎环结构扩增引物在含有taq dna聚合酶和dntp混合物中延伸30min，形成第一端测序模板链的互补链；加入终浓度为2u的t4dna连接酶，37℃反应30min后，加入2μm的上游扩增引物，在含有bsu聚合酶和dntp混合物中延伸30min，形成如图1所示的多核苷酸簇结构，该结构中的单链区域为第一端测序模板链的互补链；
[0102]
设计第二测序引物为：5
’‑
cggtctcggcattcctgctgaaccgctcttccgatct-3’将1μm第二测序引物加入芯片反应室流道中，以不同荧光染料标记的可逆终止子核苷酸为修饰核苷酸原料，在60℃下进行边合成边测序，进行50个循环；
[0103]
4、序列的确定
[0104]
将第一端测序和第二端测序获得荧光信号图像信息进行处理和整合，如图3和图4所示，如表1所示结果显示，待测序核苷酸链被正确测序。
[0105]
表1
[0106][0107]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。