技术特征：
1.一种固定化多核苷酸模板配对末端测序方法，其特征在于，包括以下操作步骤：s1、提供固定在固体支持物上的阵列的单链模板多核苷酸，作为第一端测序模板链，加入第一测序引物，对单链模板多核苷酸至少部分序列进行测序，获得第一测序引物的延伸链和对应的第一末端序列信息；s2：以第一端测序模板链为模板，形成与第一端测序模板链全长互补的多核苷酸链，称为互补链；s3：将第一端测序模板链的3’端与互补链的5’端连接，解除第一端测序模板链和互补链的双链杂交结构，并封闭第一端测序模板链，阻止复性环境下互补链与第一端测序模板链重新杂交；s4：加入与互补链的3’端互补配对的第二测序引物，对互补链的至少部分序列进行测序，获得第二末端序列信息。2.如权利要求1所述的固定化多核苷酸模板配对末端测序方法，其特征在于，步骤s2中形成互补链的具体方法为将完成第一端测序的第一测序引物的延伸多核苷酸链继续以第一端测序模板链为模板延伸，形成与第一端测序模板链全长互补的多核苷酸链作为互补链。3.如权利要求1所述的固定化多核苷酸模板配对末端测序方法，其特征在于，步骤s2中形成互补链的具体方法为，第一测序引物的延伸链与第一端测序模板链解除双链结构，去除第一测序引物的延伸链，加入至少部分与第一端测序模板链的3’端互补的扩增引物，以第一端测序模板链为模板，延伸扩增引物形成与第一端测序模板链全长互补的多核苷酸链作为互补链。4.如权利要求1～3任一项所述的固定化多核苷酸模板配对末端测序方法，其特征在于，步骤s3中解除第一端测序模板链和互补链的双链杂交结构，并封闭第一端测序模板链的方法为：在变性条件下，第一端测序模板链和互补链解除双链杂交结构，形成长单链，之后加入仅与长单链的第一端测序模板链的3’端互补配对的第一延伸引物，第一延伸引物以第一端测序模板链为模板延伸形成与第一端测序模板链互补杂交的第一延伸引物链，封闭第一端测序模板链。5.如权利要求4所述的固定化多核苷酸模板配对末端测序方法，其特征在于，步骤s3中还包括在形成长单链之后，加入单链结合蛋白，之后再加入仅与长单链的第一端测序模板链的3’端互补配对的第一延伸引物。6.如权利要求1～3任一项所述的固定化多核苷酸模板配对末端测序方法，其特征在于，步骤s3中解除第一端测序模板链和互补链的双链杂交结构，并封闭第一端测序模板链的方法为：加入与第一端测序模板链的3’端互补配对的第二延伸引物，在链置换反应的环境下，第二延伸引物以第一端测序模板链为模板延伸，同时置换出与第一端测序模板链杂交结合的互补链，第二延伸引物形成的与第一端测序模板链互补配对杂交的第二延伸引物链，封闭第一端测序模板链。7.如权利要求6所述的固定化多核苷酸模板配对末端测序方法，其特征在于，通过重组酶将第二延伸引物与第一端测序模板链的3’端互补配对杂交。8.如权利要求1～3任一项所述的固定化多核苷酸模板配对末端测序方法，其特征在于，步骤s3中第一端测序模板链的3’端与互补链的5’端连接的方法为：在第一端测序模板
链的3’末端形成第一官能团，互补链的5’末端形成第二官能团，引发第一官能团和第二官能团发生点击化学反应，将第一测序模板链的3’端与互补链的5’端共价连接。9.如权利要求10所述的固定化多核苷酸模板配对末端测序方法，其特征在于，在第一端测序模板链的3’末端形成第一官能团的方法包括采用末端转移酶将3’修饰有第一官能团的修饰核苷酸连接在第一测序模板链的3’末端；互补链的5’末端形成第二官能团的方法包括采用5’末端修饰有第二官能团的引物，以第一端测序模板链为模板延伸形成互补链。优选的，第一官能团为叠氮、炔、环炔、环烯或杂环烯；对应的第二官能团为环烯、杂环烯、炔、环炔或叠氮。10.如权利要求3所述的固定化多核苷酸模板配对末端测序方法，其特征在于，扩增引物为茎环结构，扩增引物的3’茎部分具有凸出的单链区域，至少部分的凸出的单链区域与第一端测序模板链的3’端互补配对；步骤s3中第一端测序模板链的3’端与互补链的5’端连接的方法为：加入连接酶将扩增引物5’端与第一端测序模板链的3’端连接。优选的，扩增引物的5’端存在不与第一端测序模板链互补配对的单链区域；步骤s3中第一端测序模板链的3’端与互补链的5’端连接的方法为：加入能够与扩增引物的单链区域互补配对杂交的茎环结构辅助引物，然后加入连接酶，将辅助引物的5’端与第一端测序模板链的3’端对应连接，辅助引物的3’端与第一端测序模板链的5’端对应连接。
技术总结
本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种固定化模板多核苷酸配对末端测序方法。本发明方法中第一端测序模板链固定化在芯片上，通过将第一端测序模板链的互补链直接连接在其3’端的方式，将互补链间接固定在芯片上，解除第一端测序模板链与互补链之间的双链结构，通过封堵第一端测序模板链的方式，避免互补链在复性环境与第一端测序模板链再杂交结合，进而实现以互补链为模板进行第二端测序。整个测序方法的第二端测序的模板链直接连接在第一端测序模板链的位置，克服了传统双末端测序方法第二端测序重新成簇造成的簇有序性降低、簇范围变大等导致的测序信号稳定性差等技术缺陷。围变大等导致的测序信号稳定性差等技术缺陷。围变大等导致的测序信号稳定性差等技术缺陷。
技术研发人员：王亚文 王玲玲 孙洁
受保护的技术使用者：郑州思昆生物工程有限公司
技术研发日：2021.03.03
技术公布日：2022/9/8