本发明涉及一种多肽提取制备技术领域，尤其涉及一种骨髓肽的提取制备方法。
背景技术：
小分子肽能够加强消化道内有益菌群的繁殖，提高菌体蛋白质的合成,增强机体的抗病能力;干扰素、白细胞介素等内源性肽可以刺激和调节免疫应答中心，具有免疫活性,另外，某些小分子肽(如exorphines)能使小动物的小肠提前发育成熟，并刺激消化酶的分泌,提高机体免疫力。
肽除了作为氨基酸的供体，以其吸收机制方面的特性促进生产性能外,也作为生理调节物，它们可以直接作为神经递质或间接刺激肠道受体、激素或酶的分泌而发挥调节作用。在蛋白质消化过程中释放的一些肽类影响着养分的消化与吸收(kitts和yuan,1992).也影响着动物体内的细胞免疫和体液免疫(otani,1995)。而传统的可利用氨基酸测定方法恰恰忽略了小分子肽对动物体的重要生理作用。
不仅如此，当人或动物由于损伤、长期疾病和败血病而引起谷氨酸/谷氨酰氨大量流失时,肌肉蛋白质降解加快，当以肽的形式肠外供给手术病人谷氨酸时,能部分降低负氮平衡，防止肌肉氨基酸的损失，而游离形式的谷氨酸则无这种作用；对于肽的提取大多从动物的骨髓中提取，目前，骨髓肽的提取率较低，且材料单一，致使骨髓肽的生产成本较高。
技术实现要素：
本发明的目的是针对以上问题提供一种骨髓肽的提取制备方法，以提高骨髓肽的提取率及质量。
为达到上述目的，本发明公开了一种骨髓肽的提取制备方法，其特征在于：包括如下步骤:
步骤1：取新鲜干净的哺乳动物骨头并去其肉及结缔组织，放置在装有75%酒精的培养皿中浸泡3-5小时，萃取分离骨头上的油脂方便对骨取骨髓；
步骤2：通过装有已配好rpmi-1640细胞培养基溶液的注射器插入骨髓腔内，将骨髓腔内的骨髓冲入到离心器皿中，rpmi-1640细胞培养基溶液可以有效保证骨髓的细胞活性；
步骤3：将步骤2处理得到的溶液在36℃-38℃的恒温中水浴通过超声波处理以破碎细胞。
步骤4：将步骤3处理得到的溶液4000-4500rpm离心5min，去上清液。
步骤5：将步骤4处理得到的溶液加入红细胞裂解液，静置8-10小时，加入无菌的pbs缓冲液，该红细胞裂解液与pbs缓冲液的比例为1：9。
步骤6：将步骤5的混合液通过不同规格超滤膜的超滤器从大往小下进行连续分级梯度超滤，然后采用纳滤浓缩技术制得浓缩原料液。
步骤7：根据不同浓度的需要，制出骨髓肽的不同制剂。
所述，步骤1中还包括对取出的骨通过有机溶剂萃取分离油脂。
所述，步骤2至步骤7的过程与装置都在无菌的环境下操作。
所述，将骨髓分散到3-5倍骨髓重量的水中在36℃-38℃的恒温水浴中通过超声处理使骨髓细胞破裂，超声频率为100khz-200khz。
所述，红细胞裂解液为取3.735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷（tris）1.3g加水溶解并稀释至500ml，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存制得。
所述，pbs缓冲液为含0.05%吐温-20的ph7.4的磷酸盐缓冲液。
所述，通过不同规格超滤膜的超滤器留得分子量6000或10000左右的物质。
所述，将制得的浓缩原料液通过真空喷雾干燥得到骨肽，喷雾干燥时，进风温度控制在140-150℃，出风温度控制在70-75℃。
综上所述，本发明的有益效果在于：在本发明方法中，通过该骨髓肽的提取制备方法可有效对多种材料进行骨髓肽的提取，同时大大提高骨髓肽的提取率，而通过在rpmi-1640细胞培养基溶液中进行超声破碎可保留其活性，有效避免了蛋白质的变性趋势，同时缩短生产时间；红细胞裂解液与pbs缓冲液的相配合，能进一步提高肽的生成率，提高骨髓肽的提取率，而通过在超滤膜的超滤器过滤下可以得到品质最高的骨髓肽，通过喷雾干燥过程与控制进出风的温度，可极大限度的降低最终形成的多肽的分子量分布的影响。
以下通过实施例说明本发明技术方案的可实施性，而不是将本发明的保护范围限制在以下的具体实施例上。
实施例1
步骤1：取新鲜干净的哺乳动物骨头并去其肉及结缔组织，放置在装有75%酒精的培养皿中浸泡3小时，萃取分离骨头上的油脂方便对骨取骨髓；
步骤2：通过装有已配好rpmi-1640细胞培养基溶液的注射器插入骨髓腔内，将骨髓腔内的骨髓冲入到离心器皿中，rpmi-1640细胞培养基溶液可以有效保证骨髓的细胞活性；
步骤3：将步骤2处理得到的溶液在36℃的恒温中水浴通过超声波处理以破碎细胞，超声频率为100khz，通过在恒温水浴中破碎细胞既能保证细胞活性还可以缩短生产时间，提高骨髓肽的提取率。
步骤4：将步骤3处理得到的溶液4000rpm离心5min，去上清液。
步骤5：将步骤4处理得到的溶液加入红细胞裂解液，静置8小时，加入无菌的pbs缓冲液，该红细胞裂解液与pbs缓冲液的比例为1：9，该红细胞裂解液为取3.735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷（tris）1.3g加水溶解并稀释至500ml，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存制得；pbs缓冲液为含0.05%吐温-20的ph7.4的磷酸盐缓冲液，通过去除红细胞进一步提高骨髓肽的提取率。
步骤6：将步骤5的混合液通过不同规格超滤膜的超滤器从大往小下进行连续分级梯度超滤，通过不同规格超滤膜的超滤器留得分子量6000的物质，然后采用纳滤浓缩技术制得浓缩原料液。
步骤7：根据不同浓度的需要，制出骨髓肽的不同制剂，通过将制得的浓缩原料液通过真空喷雾干燥得到骨髓，喷雾干燥时，进风温度控制在140℃，出风温度控制在70℃。
实施例2
步骤1：取新鲜干净的哺乳动物骨头并去其肉及结缔组织，放置在装有75%酒精的培养皿中浸泡5小时，萃取分离骨头上的油脂方便对骨取骨髓；
步骤2：通过装有已配好rpmi-1640细胞培养基溶液的注射器插入骨髓腔内，将骨髓腔内的骨髓冲入到离心器皿中，rpmi-1640细胞培养基溶液可以有效保证骨髓的细胞活性；
步骤3：将步骤2处理得到的溶液在38℃的恒温中水浴通过超声波处理以破碎细胞，超声频率为200khz，通过在恒温水浴中破碎细胞既能保证细胞活性还可以缩短生产时间，提高骨髓肽的提取率。
步骤4：将步骤3处理得到的溶液4000rpm离心5min，去上清液。
步骤5：将步骤4处理得到的溶液加入红细胞裂解液，静置10小时，加入无菌的pbs缓冲液，该红细胞裂解液与pbs缓冲液的比例为1：9，该红细胞裂解液为取3.735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷（tris）1.3g加水溶解并稀释至500ml，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存制得；pbs缓冲液为含0.05%吐温-20的ph7.4的磷酸盐缓冲液，通过去除红细胞进一步提高骨髓肽的提取率。
步骤6：将步骤5的混合液通过不同规格超滤膜的超滤器从大往小下进行连续分级梯度超滤，通过不同规格超滤膜的超滤器留得分子量10000的物质，然后采用纳滤浓缩技术制得浓缩原料液。
步骤7：根据不同浓度的需要，制出骨髓肽的不同制剂，通过将制得的浓缩原料液通过真空喷雾干燥得到骨髓，喷雾干燥时，进风温度控制在150℃，出风温度控制在75℃。
实施例3
步骤1：取新鲜干净的哺乳动物骨头并去其肉及结缔组织，放置在装有75%酒精的培养皿中浸泡4小时，萃取分离骨头上的油脂方便对骨取骨髓；
步骤2：通过装有已配好rpmi-1640细胞培养基溶液的注射器插入骨髓腔内，将骨髓腔内的骨髓冲入到离心器皿中，rpmi-1640细胞培养基溶液可以有效保证骨髓的细胞活性；
步骤3：将步骤2处理得到的溶液在38℃的恒温中水浴通过超声波处理以破碎细胞，超声频率为150khz，通过在恒温水浴中破碎细胞既能保证细胞活性还可以缩短生产时间，提高骨髓肽的提取率。
步骤4：将步骤3处理得到的溶液4000rpm离心5min，去上清液。
步骤5：将步骤4处理得到的溶液加入红细胞裂解液，静置9小时，加入无菌的pbs缓冲液，该红细胞裂解液与pbs缓冲液的比例为1：9，该红细胞裂解液为取3.735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷（tris）1.3g加水溶解并稀释至500ml，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存制得；pbs缓冲液为含0.05%吐温-20的ph7.4的磷酸盐缓冲液，通过去除红细胞进一步提高骨髓肽的提取率。
步骤6：将步骤5的混合液通过不同规格超滤膜的超滤器从大往小下进行连续分级梯度超滤，通过不同规格超滤膜的超滤器留得分子量8000的物质，然后采用纳滤浓缩技术制得浓缩原料液。
步骤7：根据不同浓度的需要，制出骨髓肽的不同制剂，通过将制得的浓缩原料液通过真空喷雾干燥得到骨髓，喷雾干燥时，进风温度控制在145℃，出风温度控制在72.5℃。
通过该骨髓肽的提取制备方法可有效对多种材料进行骨髓肽的提取，同时大大提高骨髓肽的提取率，而通过在rpmi-1640细胞培养基溶液中进行超声破碎可保留其活性，有效避免了蛋白质的变性趋势，同时缩短生产时间；红细胞裂解液与pbs缓冲液的相配合，能进一步提高肽的生成率，提高骨髓肽的提取率，而通过在超滤膜的超滤器过滤下可以得到品质最高的骨髓肽，通过喷雾干燥过程与控制进出风的温度，可极大限度的降低最终形成的多肽的分子量分布的影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本发明的保护范围。