一种与黄瓜果皮颜色基因连锁的分子标记及应用的制作方法

1.本发明属于黄瓜育种分子生物学领域，涉及黄瓜（cucumissativusl）果皮颜色调控基因连锁的分子标记及该分子标记在黄瓜果皮颜色鉴定和育种中的应用。


背景技术：

2.果皮颜色是黄瓜的重要商品性状，是基础研究和育种研究的热点。通常情况下黄瓜果皮颜色分为深绿色、绿色、浅绿、黄绿、白等类型。果皮中胡萝卜素、叶绿素、黄酮类、花青素等色素组成和含量的变化导致果实呈现不同颜色。黄瓜果皮中色素以叶绿素为主，叶绿素含量多少使黄瓜果皮产生从白色到浅绿、深绿等变化颜色的主要原因，叶绿素含量越多黄瓜果皮绿色颜色越深。关于黄瓜嫩果皮颜色遗传规律研究早有报道，白色果皮与绿色果皮为一对相对性状，受单基因控制，白色果皮相对于绿色果皮为隐性性状；另外一些研究采用主基因 + 多基因的遗传分析方法研究黄瓜果皮颜色遗传规律，认为果皮颜色性状是有主效基因的数量性状。王建科等（黄瓜嫩果皮颜色的遗传研究，园艺学报， 2013，40（3）：479
–
486）研究表明黄瓜嫩果皮颜色性状符合两对加性—显性—上位性主基因 + 加性—显性—上位性多基因模型（e
‑
0 模型）。黄瓜果皮叶绿素含量的遗传受2对加性一显性主基因+加性一显性多基因(e
‑
2模型)控制。
3.随着黄瓜基因组测序的完成（huang 等，the genome of the cucumber, cucumissativus l. nat genetics, 2009, 41:1275
–
1281），近年来已有403个黄瓜农艺性状qtl定位或基因克隆报道，为黄瓜基础和育种研究提供重要支撑。黄瓜果皮颜色相关研究取得较大进展，先后有多个黄瓜果皮颜色基因报道。先后有3个研究团队，利用自然材料和突变体材料鉴定到黄瓜白色果皮基因aprr2，该基因在叶绿体发育和叶绿素合成阶段起重要作用，其功能异常影响叶绿素合成和叶绿体发育，使黄瓜产生白色果皮。zhou 等（an accumulation and replication chloroplasts 5 gene mutation confers light green peel in cucumber, journal of integrative plant biology, 2015, 57(11): 936
‑
942）在以深绿果皮材料构建的ems突变体库中，发现浅绿果皮突变体，克隆黄瓜浅绿色果皮基因csarc5，该基因影响叶绿体数目和叶绿体大小，其功能异常导致浅绿果皮。lun等（a csycf54 variant conferring light green coloration in cucumber,euphytica, 2016, 208(3): 509
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517）已用上述突变体库，发现同时表现浅绿果皮和浅绿叶片的突变体，鉴定候选基因csycf54，该基因亚细胞定位于叶绿体，为叶绿素合成过程重要基因，基因功能异常导致叶绿素合成受阻，使果皮和叶片呈现浅绿色。hao等（csmyb36 is involved in the formation of yellow green peel in cucumber (cucumissativus l.),theoretical and applied genetics, 2018, 131(8): 1659
‑
1669）从以深绿色果皮材料为野生型材料构建的ems突变体库中，发现单核基因遗传的黄绿色果皮材料。黄绿突变体果皮叶绿素和类胡萝卜素含量都低于其野生型，而叶片色素含量无差异。通过群体构建、混池测序及mutmap和kasp 基因分型技术确定csmyb36为黄瓜黄绿色果皮候选基因。
4.研究者在成熟果皮颜色、果肉颜色和叶片颜色等颜色相关基因定位及克隆中同样
取的较多成果。csmyb60编码一个 r2r3转录因子，其功能异常导致黑色果刺和红色成熟果皮。csbch编码β
‑
胡萝卜素羟化酶功能异常，是半野生黄瓜种质西双版纳黄瓜嫩果橘色果肉和成熟果高β胡萝卜素的关键。lu 等（molecular mapping and candidate gene analysis for yellow fruit flesh in cucumber, molbreeding , 2015, 35:64）以黄色果肉pi 200815为材料，将黄色果肉基因定位到7号染色体150kb区域内。bo等（qtl mapping and genome
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wide association study reveal two novel loci associated with green flesh color in cucumber,bmc plant biology, 2019, 19:243）结合qtl遗传作图和gwas分析，鉴定到两个新的黄瓜商品果绿色果肉位点，为绿色果肉黄瓜品种选育提供重要支撑。另外，前人进行了黄瓜果皮一致性状的相关研究，yang 等（fine mapping of the uniform immature fruit color gene u in cucumber (cucumissativus l. ), euphytica, 2014,196（3）：341
‑
348）在前人研究的基础上，进一步将目的果皮一致基因定位在ssr10 和ssr27 标记之间的313.2 kb 区间内。此外，人们还以黄瓜叶色突变体为试材开展相关研究，分析和鉴定候选基因。对黄瓜果皮颜色基因及其他组织器官颜色相关基因鉴定，为本研究的开展提供重要参考。
5.消费者对黄瓜果皮颜色喜好不同，以华北型黄瓜为例，消费者更愿意购买具有深绿果皮的黄瓜，深绿果皮的黄瓜往往价格更高，选育深绿果皮黄瓜品种是黄瓜育种的重要方向。通过开发与黄瓜深绿果皮调控基因连锁的分子标记，采用杂交和回交等技术快速的将深绿调控基因与其他优良性状基因导入到植株中，为选育高质量的新品种提供支撑，且为克隆黄瓜果皮颜色调控基因，研究果皮调控的分子机制奠定了基础。


技术实现要素：

6.本发明的首要目的在于针对黄瓜果皮深绿/浅绿色的表型，提供一种与黄瓜果皮颜色调控基因连锁的分子标记cu_39541731。为深绿果皮黄瓜材料的预判、鉴定和辅助筛选，以及深绿果皮黄瓜的育种等提供新的途径。
7.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种与黄瓜果皮颜色基因连锁的分子标记，具体在黄瓜全基因组3号染色体的39541731bp处t向g的变异。
8.优选地，所述的分子标记对应的基因型：t:t为具有果皮颜色的深绿基因型、t:g为具有果皮颜色的绿基因型、g:g为果皮颜色的浅绿基因型。
9.优选地，针对黄瓜果皮颜色调控基因设计的引物如下：优选地，cu_39541731f、cu_39541731r两条引物5’端分别连接不同的荧光接头序列。
10.优选地，所述荧光接头序列为lgc公司的fam或hex接头序列。
11.fam信号：gaaggtgaccaagttcatgct（seq id no.4）；hex信号：gaaggtcggagtcaacggatt（seq id no.5）。
12.本发明的第二个目的是提供上述分子标记的应用，有利于黄瓜果皮深绿的选育，且为克隆颜色调控基因，研究黄瓜果皮颜色调控的分子机制奠定基础，具体如下：1.分子标记用于鉴定和辅助筛选深绿果皮黄瓜材料；2.分子标记用于深绿果皮黄瓜育种；3.分子标记应用时，采用pcr 反应进行检测。
13.优选地，分子标记应用时，具体包括以下步骤：（1）以待测样品基因组dna为模板，利用分子标记的扩增引物进行pcr扩增，获得扩增产物；（2）对扩增产物进行检测与分析。
14.优选地，对扩增产物进行荧光检测时，如果样品pcr产物只检测到引物cu_39541731f对应的荧光信号，则检测位点为t:t基因型，判定为深绿果皮的表型单株；如果样品pcr产物只检测到引物cu_39541731r对应的荧光信号，则检测位点为g:g基因型，判定为浅绿果皮表型的单株；若同时检测到两种荧光信号，则检测位点为t:g基因型，判定为绿色果皮的单株。
15.优选地，分子标记应用时，采用touchdown pcr，扩增程序为：94℃15min；95℃20s；65℃
‑
56℃60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；94℃20s；57℃60s，26个循环。
16.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明利用gwas结合bsa定位的方法，定位到一个控制黄瓜果皮颜色调控的区间，并依据该区间的变异，开发了snp标记将区间缩小至94kb,利用荧光定量技术检测深绿和浅绿果皮近等基因系材料发现csa3g912920基因有显著差异，在该基因位置开发了与该黄瓜果皮颜色调控基因相关联的kasp分子标记。可以直接用于黄瓜果皮颜色和相对应的基因型的鉴定，进而依赖该分子标记进行辅助育种，能够有效的解决常规育种周期长，易受到环境影响的问题。通过早期利用该分子标记可以快速筛选到满意的植株，有效的减小了种植规模，减少了后期鉴定的工作量。提高了选择的效率和准确性。因此，本发明在黄瓜果皮颜色形成机制研究及适度黄瓜果皮颜色材料筛选、品种选育上具有重大应用价值。
附图说明
17.构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为深绿/浅绿黄瓜材料的表型图,a图为黄瓜材料g35、q51及其f1的表型图；b图是双亲g35和q51及f1商品瓜果皮叶绿素a和b含量的差异图；图2a为bsa定位图；图2b为gwas关联图；chr01
‑
chr07代表染色体号，深绿/浅绿果皮颜色调控基因位于黄瓜第3号染色体上36.62 mb
‑ꢀ
39.77 mb区间；图3a为利用f2群体分析获得的qtl csfs1的lod峰值图；图3b为图2b灰色柱条部分利用标记精细定位的示意图；图3c为利用荧光定量检测近等基因系的表达图；图4为本发明的cu_39541731分子标记在g35与q51构建的f2群体中进行基因分型的部分结果,a处表示：pcr产物为引物cu_39541731对应的荧光信号，为深绿果皮的纯合单株；b处表示：pcr产物为引物cu_39541731对应的荧光信号，为浅绿果皮的纯合单株；c处表示：pcr产物具有引物cu_39541731两种荧光信号，为绿果皮的杂合单株。
具体实施方式
18.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
19.以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。本发明中所涉及的黄瓜种质均由天津科润农业科技股份有限公司黄瓜研究所提供，也可保证对外出售至少20年。
20.实施例1 黄瓜果皮颜色调控基因连锁的分子标记的获得一、gwas分析方法1．全基因组关联分析（genome
‑
wide association study，gwas）是一种对全基因组范围内的常见遗传变异（单核苷酸多态性和拷贝数）基因总体关联分析的方法，该方法以自然群体为研究对象，以长期重组后保留下来的基因（位点）间连锁不平衡（linkage disequilibrium, ld）为基础，将目标性状表型的多样性与基因（或标记位点）的多态性结合起来分析，可直接鉴定出与表型变异密切相关且具有特定功能的基因位点或标记位点。对289份黄瓜种质进行深度重测序，检测共获得2,352,638个snp位点，经过条件为dp7（个体深度7）、miss0.2（个体缺失率）、maf0.05（最小等位基因频率0.05）过滤后，最后共获得399,352个高质量的snp，构建一套全面的高密度黄瓜变异组图谱，为黄瓜遗传育种研究提供了丰富的遗传标记。对289个自然群体果皮颜色度进行分级分析，比较所有snp位点的等位基因在不同果皮颜色之间的差异；使用a unified mixed model将果皮颜色性状关联到2、3、5号染色体区间，如图2b, 曼哈顿图为遗传标记效应值即经f检验的全基因组p值按染色体上物理位置，p值越小关联性越强，分析发现最小p值在3号染色体39282970位置，即最关联的snp区域为3号染色体39142710
‑
39333893。
21.二、bsa定位方法1.群体的构建利用经过多代自交选育出的黄瓜浅绿果皮亲本g35（图1a右所示），及稳定遗传的
高代自交系深绿果皮材料
‘
q51’为亲本（图1a左所示），将浅绿果皮亲本与深绿果皮亲本进行杂交得到f1代，f1代自交后获得f2群体。近等基因系的构建：浅绿果皮g35亲本与深绿果皮q51亲本进行杂交得到f1代，f1与q51进行回交，选择深绿果皮颜色的单株继续与g35回交，连续回交4代自交1代。
22.2.颜色调控基因初定位在g35
×
q51的f2群体中选取20个有浅绿果皮植株的叶片和20个深绿果皮的植株叶片，分别构建两个dna池并进行混池测序，共产生12.9gb的序列数据。通过bwa软件将reads比对到黄瓜参考基因组上，使用bcftools软件寻找全基因组的snp位点。过滤掉qual值（碱基质量值）小于30，mq质最值小于30，dp值小于2的位点，因为这些snps可能是由基因组的重复序列或者测序造成的失误或比对失误造成的假snp，这些snps都是不可信的。然后筛选出子代与双亲纯合且差异的snp位点，并计算出显性池与隐性池的snp
‑
index值。将隐性池与显性池的snp
‑
index值相减，得到
△
snp
‑
index值。以物理距离1m为窗口，10kb为步长进行滑窗分析，得到每一窗口内的
△
snp
‑
index均值。经过计算机模拟实验，我们得到了每一测序深度对应的预值，将预值与每一snp位点逐一匹配以后，也进行同样的滑窗分析，将
△
snp
‑
index均值与预值分别作图（如图2a)，观察
△
snpindex值分布，我们发现在三号染色体上有个明显高于预值线的峰，90%置信的区间是36.62 mb to 39.77 mb。
23.整合gwas和bsa结果，果皮颜色的候选区间在chr3末端39142710
‑
39333893区域有重叠。这表明控制黄瓜深绿/浅绿果皮的主效qtl位于3号染色体的远端，即csfs1。如图2所示。
24.3.精细定位与定量分析通过步骤gwas和bsa的分析获得控制黄瓜深绿/浅绿果皮染色体交集的区域，区域为3号染色体39142710
‑
39333893：根据区间的变异信息，开发了35个标记，对35对标记对应的标记带型及表型统计，利用joinmap4.0作图发现lod峰从64.85 cm到69.05 cm之间与候选区间一致见图3a,解释 35.6%的表型变异。对重组单株进行统计作图，发现最后区间定位在39,531,980和39,626,163之间的94kb见图3b。候选区间内的共有15个基因，其中12个有功能注释。以g35为轮回亲本回交4代自交一代获得果皮颜色近等基因系材料，以近等基因系材料nil
‑
1325（深绿果皮）、nil
‑
1334（浅绿果皮）为试材检测其开花当天果皮基因表达情况，我们检测的3个基因中发现只有csa3g912920有显著差异见图3c，以上结果表明csa3g912920为黄瓜深绿果皮候选基因。
25.4.调控基因标记开发对候选基因分析发现3号染色体39541731位置的kasp标记基因分型最吻合。利用cu_39541731标记对g35与q51构建的f2群体237个单株进行基因分型。出现了3种荧光信号，其中t:t的荧光信号有85个单株，t:g的荧光信号有101个单株，g:g的荧光信号有51个单株（表1）。结合表型调查数据发现基因型与果皮颜色度表型高度一致。以上结果充分说明，cu_39541731标记具有通用性和准确性，可以应用于黄瓜果皮深绿或浅绿果皮的预测、鉴定和筛选。
26.分子标记应用时，具体包括以下步骤：（1）以待测样品基因组dna为模板，利用分子标记的扩增引物进行touchdownpcr扩增，获得扩增产物；（2）对扩增产物进行检测与分析。引物名称引物序列5
’‑3’
cu
‑
39541731fgaaggtgaccaagttcatgctccatgatttatcataactttattaggattagtcu
‑
39541731rgaaggtcggagtcaacggattccatgatttatcataactttattaggattaggcu
‑
39541731cagcaacaaaatcgattaggaaactt
27.对扩增产物进行荧光检测时，如果样品pcr产物只检测到引物cu_39541731f对应的荧光信号，则检测位点为t:t基因型，判定为黄瓜果皮深绿表型单株；如果样品pcr产物只检测到引物cu_39541731r对应的荧光信号，则检测位点为g:g基因型，判定为黄瓜果皮浅绿表型的单株；若同时检测到两种荧光信号，则检测位点为t:g基因型，判定为黄瓜果皮具有绿表型的单株。
28.分子标记应用时，采用touchdown pcr，扩增程序为：94℃15min；95℃20s；65℃
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56℃60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；94℃20s；57℃60s，26个循环。
29.鉴定结果如图4表明，在育种中通过分子标记鉴定筛选，保留检测到引物cu_39541731对应的g:g荧光信号的材料，就能够选育出黄瓜浅绿果皮的材料。保留检测到引物cu_39541731对应的t:t荧光信号的材料，就能够选育出深绿果皮的纯合材料。保留检测到t:g荧光信号的材料，就能够选育出深绿果皮的杂合材料，通过前期分子标记的筛选可以减少后期筛选鉴定的工作量，加速育种进程。
30.表1 cu_39541731标记在亲本材料g35与q51及构建的f1、f2群体中部分单株果皮颜色类型及基因型编号基因型表型q51t:t深绿f1g:t绿色g35g:g浅绿207t:t深绿208t:t深绿209g:t绿色210t:t深绿212g:t绿色213g:t绿色214g:t绿色215g:g浅绿216g:t绿色219t:t深绿221g:t绿色222g:g浅绿223g:t绿色224g:t绿色225g:g浅绿226g:t绿色227t:t深绿228g:g浅绿
229g:t绿色230t:t深绿231g:t绿色232g:t绿色233t:t深绿235t:t深绿240t:t深绿241t:t深绿242g:t绿色244g:t绿色246t:t深绿247t:t深绿252g:g浅绿253t:t深绿254g:g浅绿256g:t绿色259t:t深绿261g:t绿色264g:t绿色263g:g浅绿265g:t绿色266t:t深绿267t:t深绿268g:t绿色270t:t深绿271g:t绿色274t:t深绿275g:g浅绿276t:t深绿277g:t绿色278g:t绿色279g:g浅绿280g:t绿色281g:t绿色284t:t深绿285t:t深绿286t:t深绿287g:t绿色289t:t深绿
290g:g浅绿292g:g浅绿293g:t绿色294g:g浅绿295t:t深绿297t:t深绿298g:t绿色299t:t深绿302t:t深绿303t:t深绿304g:g浅绿305g:t绿色306t:t深绿308g:t绿色310g:t绿色311
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1g:g浅绿311g:t绿色312g:t绿色313g:t绿色314g:g浅绿315g:t绿色217g:t绿色245t:t深绿272t:t深绿273g:g浅绿282g:t绿色283t:t深绿291g:t绿色301t:t深绿307g:t绿色316g:t绿色317t:t深绿318g:t绿色319g:t绿色320g:g浅绿321g:g浅绿322g:g浅绿323g:t绿色324g:g浅绿
325t:t深绿326g:g浅绿327g:g浅绿328g:t绿色329g:g浅绿332g:t绿色333t:t深绿334t:t深绿335t:t深绿337g:t绿色339g:t绿色341t:t深绿342g:t绿色344g:t绿色346g:g浅绿348g:t绿色349t:t深绿350t:t深绿353g:t绿色354g:t绿色355g:t绿色356t:t深绿357g:t绿色358g:g浅绿359t:t深绿360t:t深绿362g:t绿色363t:t深绿364g:g浅绿365t:t深绿366g:t绿色367t:t深绿368t:t深绿369g:t绿色370g:t绿色372t:t深绿373g:t绿色374t:t深绿375t:t深绿
376t:t深绿377g:g浅绿378t:t深绿379t:t深绿381t:t深绿382g:t绿色386t:t深绿387t:t深绿388g:g浅绿389t:t深绿389
‑
1t:t深绿390g:t绿色391g:g浅绿392g:t绿色393t:t深绿394g:t绿色395t:t深绿396t:t深绿397g:t绿色398g:t绿色400g:t绿色402g:t绿色404g:g浅绿405g:t绿色406t:t深绿409g:g浅绿410g:t绿色412g:t绿色413g:t绿色415t:t深绿416g:t绿色417g:t绿色419g:t绿色421g:t绿色426g:g浅绿427g:t绿色428g:t绿色429g:t绿色429
‑
1g:t绿色
430g:t绿色431g:t绿色432g:g浅绿433t:t深绿434g:g浅绿435t:t深绿g35t:t深绿436t:t深绿437t:t深绿438t:t深绿440t:t深绿441g:g浅绿442g:t绿色444t:t深绿445g:g浅绿446g:t绿色447g:g浅绿449t:t深绿439g:t绿色450g:t绿色451g:g浅绿452g:t绿色453g:g浅绿455g:g浅绿456g:g浅绿457g:g浅绿458g:g浅绿459g:g浅绿460g:t绿色461g:t绿色462t:t深绿463g:t绿色464g:t绿色465t:t深绿466t:t深绿467g:t绿色468t:t深绿469g:g浅绿470g:t绿色
471g:t绿色472t:t深绿474g:g浅绿475g:g浅绿476g:t绿色477g:t绿色478g:t绿色479g:t绿色480g:g浅绿481g:g浅绿482g:g浅绿483g:t绿色484t:t深绿486g:t绿色487g:t绿色488t:t深绿490t:t深绿491t:t深绿492g:t绿色493t:t深绿496g:g浅绿497t:t深绿499g:t绿色500t:t深绿以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。