一种抑制黑色素生成的酪氨酸酶抑制剂的制备方法与用途

1.本发明属于生物医学技术领域，具体而言，涉及一种抑制黑色素生成的酪氨酸酶抑制剂的制备方法与用途，所得到的抑制剂可实现在溶液体系中或动物体内抑制酪氨酸酶活性，从而抑制黑色素的生成。


背景技术：

2.黑色素是主要负责人类皮肤，头发和眼睛色素沉着的主要色素，是由黑色素细胞通过黑色素生成产生的。这些色素的黑色素合成和积累增加，发生在许多类型的皮肤疾病中，包括黑棘皮病，子宫颈癌，黄褐斑，与帕金森氏病相关的神经退行性变和皮肤癌的风险。尽管黑色素生成是一个复杂的过程，以许多酶和化学反应为代表，但是诸如酪氨酸酶和其他酪氨酸酶相关蛋白(tyrp1和tyrp2)之类的酶在黑色素合成中起着至关重要的作用。酪氨酸酶是具有双核铜离子的多功能含铜金属酶，在黑色素的合成中起限速酶的作用。由于酪氨酸酶是通过黑色素生成合成黑色素的关键酶，因此它成为直接抑制酪氨酸酶催化活性的黑色素生成抑制剂最重要和最成功的靶标。市售的大多数化妆品或亮肤剂是酪氨酸酶抑制剂。现阶段对酪氨酸酶抑制剂的研究也逐渐深入，但是目前很多酪氨酸酶抑制剂存在一些缺点，如理化性质不稳定、副作用明显、溶解度差等，其抑制黑色素生成的效果并不尽如人意。


技术实现要素：

3.针对上述问题，本发明提供了一种抑制黑色素生成的酪氨酸酶抑制剂的制备方法与用途。
4.本发明所述的抑制黑色素生成的酪氨酸酶抑制剂的制备方法为：在96孔板中对酪氨酸酶抑制剂合成配方进行高通量筛选，通过调整n-异丙基丙烯酰胺、功能单体、交联剂、表面活性剂组成和配比配制反应溶液，充氮气后加入引发剂进行沉淀聚合或反相乳液聚合，筛选出酪氨酸酶抑制剂配方。
5.所述的沉淀聚合或反相乳液聚合是在40-80℃下反应3-24小时。
6.所述的沉淀聚合或反相乳液聚合的反应结束后，通过透析纯化、冷冻干燥得到水凝胶纳米颗粒。
7.所述的酪氨酸酶抑制剂配方中功能单体选自：4-乙烯基苯硼酸、丙烯酰胺、丙烯酸、n-叔丁基丙烯酰胺、n-苯基丙烯酰胺、4-乙烯基咪唑、4-乙烯基苯酚和(3-丙烯酰胺基丙基)三甲基氯化铵中的一种或几种。
8.所述的酪氨酸酶抑制剂配方中交联剂选自：n,n'-亚甲基双丙烯酰胺、1,4-双(丙烯酰)哌嗪和乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一种或两种。
9.所述的引发剂为过硫酸铵，加入量为5-80mg/ml。
10.所述的酪氨酸酶抑制剂配方中n-异丙基丙烯酰胺、功能单体、交联剂的摩尔比范围为5-98:5-40:0.5-15。
11.本发明具有如下有益效果：
12.本发明是在96孔板内合成水凝胶聚合物，然后对酪氨酸酶的抑制作用进行高通量筛选，通过改变功能单体的种类和配比来调控水凝胶聚合物对酪氨酸酶的抑制效果。筛选出的水凝胶聚合物能够通过与酶活性中心结合或与酶表面关键性糖基化位点结合来抑制酪氨酸酶的活性。在制备合成过程中所使用的功能单体价格低廉，筛选制备过程简易，制得的水凝胶纳米颗粒粒径均一，大小形状可控，物理和化学稳定性好。筛选后的酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的半抑制浓度ic50为1.92μm，优于多数天然酪氨酸酶抑制剂，对酪氨酸酶有很好的抑制作用。并且该酪氨酸酶抑制剂在溶液体系或细胞和动物体内都呈现出了对酪氨酸酶良好的抑制效果，减少了黑色素的生成。酪氨酸酶抑制剂为水凝胶纳米颗粒，同时具备非常低的生物毒性，在医药美白领域具有重要的应用价值和广阔的应用前景。
附图说明
13.图1实施例1中96孔板中聚合物对酪氨酸酶抑制效果。
14.图2为实施例2-5制备的酪氨酸酶抑制剂的扫描电子显微镜表征图。
15.图3为实施例2-5制备的酪氨酸酶抑制剂在溶液中对酪氨酸酶抑制效果。
16.图4为酪氨酸酶抑制剂np4对酪氨酸酶的ic50。
17.图5为酪氨酸酶抑制剂np4的抑制作用lineweaver-burk图。
18.图6为酪氨酸酶抑制剂np4对b16f10细胞的细胞毒性实验。
19.图7为酪氨酸酶抑制剂np1-4抑制b16f10细胞中酪氨酸酶活性。
20.图8为酪氨酸酶抑制剂np1-4抑制b16f10细胞中黑色素生成。
21.图9为酪氨酸酶抑制剂np4抑制小鼠皮肤中黑色素生成。
22.图10为masson-fontana氨银法检测小鼠皮肤中黑色素含量。
23.图11为苏木精-伊红染色进行小鼠内脏组织切片。
具体实施方式
24.为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明提供的一种抑制黑色素生成的酪氨酸酶抑制剂的制备方法与用途进行详细描述。
25.实施例1：96孔板内高通量筛选酪氨酸酶抑制剂合成配方
26.配制250μl各组分总浓度为80mm的预反应液。其中n,n'-亚甲基双丙烯酰胺的摩尔百分含量为10％，丙烯酰胺的摩尔百分含量分别为5％、10％、20％、40％，剩余含量使用n-异丙基丙烯酰胺补齐。预反应液配制完成后，使用n2鼓气15分钟。将不同功能单体含量的预反应液加入96孔板内，每孔加入过硫酸铵3mg作为引发剂，在65℃下密封反应8h。反应结束后使用纯水冲洗除去未反应的单体，获得沉积在96孔板内的聚合物。每孔加入100μl蘑菇酪氨酸酶(300u/ml)，在室温下预孵育10分钟后，加入100μl l-dopa(3,4-二羟基苯丙氨酸)(2.5mm)，并将测定板在25℃下进一步孵育20分钟。孵育结束后，测量475nm处吸光度，并计算相对于空白对照的抑制百分数。96孔板内聚合物对酪氨酸酶活性抑制效果如图1所示。
27.实施例2：制备酪氨酸酶抑制剂1(np1)
28.配制50ml各组分总摩尔浓度为100mm的反应液，其中n-异丙基丙烯酰胺的摩尔百分含量为85mol％，4-乙烯基苯硼酸的摩尔百分含量为5mol％，4-乙烯基咪唑的摩尔百分含
量为5mol％，交联剂n,n'-亚甲基双丙烯酰胺的摩尔百分含量为5mol％；继续加入10mg十二烷基磺酸钠，在氮气氛围下加入引发剂过硫酸铵30mg，用磁力搅拌器在65℃下进行聚合反应4小时。通过用过量的纯水透析纯化聚合的溶液，冷冻干燥后得到聚合物纳米粒子。扫描电子显微镜表征如图2a所示。
29.实施例3：制备酪氨酸酶抑制剂2(np2)
30.配制50ml各组分总摩尔浓度为80mm的反应液，其中n-异丙基丙烯酰胺的摩尔百分含量为73mol％，4-乙烯基苯硼酸的摩尔百分含量为10mol％，n-叔丁基丙烯酰胺的摩尔百分含量为15mol％，交联剂n,n'-亚甲基双丙烯酰胺的摩尔百分含量为2mol％；继续加入10mg十二烷基磺酸钠，在氮气氛围下加入引发剂过硫酸铵30mg，用磁力搅拌器在80℃下进行聚合反应3小时。通过用过量的纯水透析纯化聚合的溶液，冷冻干燥后得到聚合物纳米粒子。扫描电子显微镜表征如图2b所示。
31.实施例4：制备酪氨酸酶抑制剂3(np3)
32.配制50ml各组分总摩尔浓度为20mm的反应液，其中n-异丙基丙烯酰胺的摩尔百分含量为55mol％，4-乙烯基苯硼酸的摩尔百分含量为30mol％，丙烯酸的摩尔百分含量为5mol％，交联剂n,n'-亚甲基双丙烯酰胺的摩尔百分含量为10mol％；继续加入10mg十二烷基磺酸钠，在氮气氛围下加入引发剂过硫酸铵10mg，用磁力搅拌器在65℃下进行聚合反应6小时。通过用过量的纯水透析纯化聚合的溶液，冷冻干燥后得到聚合物纳米粒子。扫描电子显微镜表征如图2c所示。
33.实施例5：制备酪氨酸酶抑制剂4(np4)
34.配制50ml各组分总摩尔浓度为20mm的反应液，其中n-异丙基丙烯酰胺的摩尔百分含量为40mol％，4-乙烯基苯硼酸的摩尔百分含量为40mol％，4-乙烯基苯酚的摩尔百分含量为5mol％，交联剂n,n'-亚甲基双丙烯酰胺的摩尔百分含量为15mol％；继续加入10mg十二烷基磺酸钠，在氮气氛围下加入引发剂过硫酸铵30mg，用磁力搅拌器在40℃下进行聚合反应24小时。通过用过量的纯水透析纯化聚合的溶液，冷冻干燥后得到聚合物纳米粒子。扫描电子显微镜表征如图2d所示。
35.应用例1：酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶活性抑制效果测定
36.50μl蘑菇酪氨酸酶(300u/ml)分别和50μl浓度为1mg/ml酪氨酸酶抑制剂np1-4溶液混合。在室温下预孵育10分钟后，加入100μl l-dopa(3,4-二羟基苯丙氨酸)(2.5mm)，并将测定板在25℃下进一步孵育20分钟。孵育结束后，在475nm处测量吸光度，并计算相对于对照的抑制百分数。酪氨酸酶抑制剂np1-4对酪氨酸酶活性抑制效果如图3所示。
37.应用例2：酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶活性抑制机理分析
38.选取对酪氨酸酶抑制效果最优的np4来进行抑制机理分析。50μl蘑菇酪氨酸酶(300u/ml)和50μl不同浓度的np4溶液混合。在室温下预孵育10分钟后，加入100μl l-dopa(3,4-二羟基苯丙氨酸)(2.5mm)，并将测定板在25℃下进一步孵育20分钟。孵育结束后，测定475nm处吸光度，并计算相对于对照的抑制百分数。计算半数抑制量ic50，如图4所示。
39.50μl不同浓度的蘑菇酪氨酸酶和50μl不同浓度的np4溶液混合。在室温下预孵育10分钟后，加入100μl l-dopa(3,4-二羟基苯丙氨酸)(2.5mm)，每隔1分钟在475nm处测量吸光度，持续测试20分钟。计算相对于对照的抑制百分数。通过双倒数曲线计算km，vm如图5和表1所示，当np4浓度升高时km上升，而vm下降，说明np4对酪氨酸酶的抑制机理为混合型抑
制。
40.表1
[0041] km(mm)vm(μm/s)tyr0.160.37np4 0.05mg/ml0.340.19np4 0.125mg/ml0.490.12np4 0.25mg/ml0.670.10
[0042]
应用例3：酪氨酸酶抑制剂抑制细胞内酪氨酸酶活性
[0043]
将不同浓度的经过高温灭菌后的np4溶液与b16f10小鼠黑色素瘤细胞共同孵育24小时后，吸去上清，每孔加入20μl mtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，继续培养4小时。4小时后终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入100μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10分钟，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪od 490nm处测量各孔的吸光值。计算np4对b16f10细胞的细胞毒性，实验结果如图6所示。
[0044]
将酪氨酸酶抑制剂np1-4分别与b16f10细胞共同孵育24小时，测定b16f10细胞内酪氨酸酶活性和黑色素含量。为了测量细胞内酪氨酸酶活性，将b16f10细胞接种在96孔板中(1
×
104细胞/孔)，放置2小时。分别用酪氨酸酶抑制剂np1-4溶液(100μg/ml)的dmem代替培养基，并将细胞孵育24小时。然后除去培养基，并用pbs洗涤细胞。然后将100μl含1％triton x-100的pbs加入每个孔中，置摇床上低速振荡10min。接下来，添加100μl的2.5mmol/l l-dopa，并将细胞在37℃下孵育60分钟。酪氨酸酶活性通过用elisa读数器测量在475nm处的吸光度来评估。测试结果如图7所示。
[0045]
将np1-4与b16f10细胞共同孵育24小时，测定b16f10细胞内酪氨酸酶活性和黑色素含量。为了测量细胞内酪氨酸酶活性，将b16f10细胞接种在96孔板中(1
×
104细胞/孔)，放置2小时。用酪氨酸酶抑制剂np1-4溶液(100μg/ml)的dmem代替培养基，并将细胞孵育24小时。然后除去培养基，并用pbs洗涤细胞。然后将100μl含1％triton x-100的1m naoh加入每个孔中，并在80℃下溶解细胞沉淀1小时，黑色素的量通过使用elisa读数器测量在405nm处的吸光度来确定。测试结果如图8所示。
[0046]
应用例4：酪氨酸酶抑制剂抑制小鼠体内黑色素生成
[0047]
选取八周龄的雌性c57小鼠，使用np4(0.2mg)在小鼠背部进行皮下注射，并使用紫外灯对小鼠进行隔天照射(uv强度为每次200mw/cm2)，拍照记录小鼠背部肤色变化(图9)。经过8天后，处死小鼠，对小鼠背部皮肤和内脏进行取材，通过masson-fontana氨银法检测小鼠皮肤中黑色素含量(图10)，并通过苏木精-伊红染色法对小鼠内脏进行测试(图11)，发现没有明显内脏损伤，说明np4具有较低的生物毒性。