技术特征：
1.具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，从嗜热脂肪地芽孢杆菌提取mrna，利用反转录手段合成cdna，设计特异性引物大量扩增其编码区，并连接到e.coli表达载体中，然后转化至工程菌bl21（de3）中。2.如权利要求1所述的具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法，包括以下的步骤：（1）设计特异性引物序列从天然的嗜热脂肪地芽孢杆菌提取其编码超氧化物歧化酶的序列；（2）将（1）中克隆的超氧化物歧化酶的序列成功连接至原核表达载体中，并设计用于鉴定阳性克隆的引物；（3）获得表达菌株；从嗜热脂肪地芽孢杆菌中克隆的超氧化物歧化酶的蛋白质氨基酸序列为：mpfelpalpypydalephidketmnihhtkhhntyvtnlnaaleghpdlqnksleellsnlealpesirtavrnnggghanhslfwtilspngggeptgeladainkkfgsftafkdefskaaagrfgsgwawlvvnngeleitstpnqdspimegktpilgldvwehayylkyqnrrpeyiaafwnvvnwdevakryseakak；（4）将第20位天冬氨酸突变为甘氨酸，并将141位的亮氨酸突变为天冬酰胺；（5）将hiv
‑
1肽段上具有越膜能力的cpp序列ygrkkrrqrrr与超氧化物歧化酶偶联表达，赋予其越膜能力；所述的cpp序列为trans
‑
activating transcriptional activator序列。3.如权利要求1所述的具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，（1）设计特异性引物序列步骤中，利用rna提取试剂盒提取嗜热脂肪地芽孢杆菌的mrna，然后利用反转录试剂盒合成该微生物的cdna，再根据限制性内切酶位点优化特异性引物，钓取其编码超氧化物歧化酶的序列，优化特异性引物序列如下：超氧化物歧化酶钓取上游引物序列：5
’‑
catatgccctttgaactaccagcat
‑3’
超氧化物歧化酶钓取下游引物序列：5
’‑ꢀ
aagcttcttcgctttcgcctcgctg
ꢀ‑3’
。4.如权利要求1所述的具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，（1）中，钓取的序列，即下一步要表达的超氧化物歧化酶的编码序列如下：atgccctttgaactaccagcattaccctatccctatgatgctctagaaccgcacattgacaaggagaccatgaacatccaccacaccaagcaccacaacacctacgtgaccaacctgaacgcggcgctggagggtcacccggacctgcagaacaaaagcctggaggaactgctgagcaacctggaggcgctgccggaaagcatccgtaccgcggttcgtaacaacggtggcggtcacgcgaaccacagcctgttttggaccatcctgagcccgaacggcggtggcgagccgaccggtgaactggcggacgcgattaacaagaaattcggcagctttaccgcgttcaaggatgagtttagcaaagcggcggcgggtcgtttcggtagcggttgggcgtggctggttgtgaacaacggcgagctggaaatcaccagcaccccgaaccaggacagcccgatcatggagggcaagaccccgattctgggcctggatgtgtgggaacacgcgtactatctgaaataccaaaaccgtcgtccggaatatattgcggcgttctggaatgtggtgaactgggacgaggtggcgaagcgttacagcgaggcgaaagcgaagtgaaagctt。5.如权利要求1所述的具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，（2）中，选取pet30a载体为表达载体，扩增的序列与载体经过hindiii与ndei双酶切
后，用dna凝胶回收试剂盒回收酶切产物，回收后的双酶切产物，按照dna片段：质粒=2:1的比例用dna连接酶16℃连接12h，连接后的连接子采用42℃热击法转化至感受态大肠杆菌工程菌e.coli bl21(de3)，将转化之后的工程菌涂布于含有50ug/ml卡那霉素的lb抗性平板，37℃培养18
‑
26h，形成单克隆，并对克隆进行验证；菌落pcr引物序列如下：菌落pcr上游引物序列：5
’‑
ttaccctatccctatgatgctc
‑3’
菌落pcr下游引物序列：5
’‑
cccaaccgctaccgaaac
‑3’
。6.如权利要求1所述的具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，（3）获得表达菌株：选择验证正确的单克隆，进行表达验证，表达条件为：接种单克隆菌落至5ml lb液体培养基，所述的培养基中含卡那霉素50ug/ml，待od600值达到0.7时，加入iptg至终浓度0.5mm，在不同温度下进行诱导，诱导后收集菌体，进行超声裂解，各组分利用sds
‑
page法进行电泳检测。7.如权利要求5所述的具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，超声裂解时，超声体积为1ml，超声条件为：超声2s停止3s，总超声时间为10min。8.如权利要求1所述的具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法，（5）采用柔性多肽连接子
‑
gggsgggs或者是ggggs，ggsggs，ggggg超氧化物歧化酶偶联表达；进行点突变d20g与l141n点突变并且利用柔性多肽连接子gggsgggs将ygrkkrrqrrr序列与超氧化物歧化酶进行融合表达后，其氨基酸序列为：mpfelpalpypydalephigketmnihhtkhhntyvtnlnaaleghpdlqnksleellsnlealpesirtavrnnggghanhslfwtilspngggeptgeladainkkfgsftafkdefskaaagrfgsgwawlvvnngeneitstpnqdspimegktpilgldvwehayylkyqnrrpeyiaafwnvvnwdevakryseakakgggsgggsygrkkrrqrrr。9.如权利要求1所述的具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，（3）中，对裂解上清进行超氧化物歧化酶活性测定的步骤如下：采用wst
‑
8法确定活性后，再分别采用甘油辅助加热法、盐析法、有机溶剂沉淀法、透析法进行纯化，浓缩后用wst
‑
8试剂盒法检测活力；热稳定性检测时，将纯化的超氧化物歧化酶分别置于4℃，75℃，80℃，85℃，90℃，95℃水浴中3小时后，检测酶活力。10.如权利要求1所述的具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，甘油辅助加热法的步骤如下：在15%甘油中加热至75℃，灭活杂蛋白。
技术总结
本发明属于酶制剂的基因改造技术领域，具体涉及一种具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法。本发明的方法，其特征在于，从嗜热脂肪地芽孢杆菌提取mRNA，利用反转录手段合成cDNA，设计特异性引物大量扩增其编码区，并连接到E.coli表达载体中，然后转化至工程菌BL21（DE3）中。利用点突变技术，增强超氧化物歧化酶的稳定性，并设计柔性多肽连接子GGGSGGGS，成功实现了越膜肽YGRKKRRQRRR与超氧化物歧化酶的可溶性融合表达。本发明的有益效果在于，通过本发明的方法所获得的超氧化物歧化酶，能最大程度的提高该酶的热稳定性；将HIV
技术研发人员：夏勇
受保护的技术使用者：济宁医学院
技术研发日：2021.06.28
技术公布日：2021/9/24