一种海葵多肽毒素Ap-GT及其制备方法和应用

一种海葵多肽毒素ap
‑
gt及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及海葵技术领域，特别涉及一种海葵多肽毒素ap
‑
gt及其制备方法和应用。


背景技术：

2.海葵(sea anemone)又名海菊花，隶属于刺胞动物门、珊瑚虫纲、六放珊瑚亚纲。海葵是最原始的后生动物类群之一，也是现存最古老的有毒海洋动物之一，有分子证据和化石资料表明海葵最早起源于7.5亿年前。海葵种类繁多，在全球已记录海葵目1100余种，分属于50科约400属，而中国海葵物种约占世界的1/10，广泛分布在温热带和热带海域。海葵触手上具有刺细胞能够分泌毒液捕食鱼、贝类、桡足类、甲壳类动物以及蠕虫，其毒液中富含各种多肽毒素成分，是重要的海洋药物资源。《中华本草》和《中国药用动物志》记载海葵具有收敛固涩、燥湿杀虫等功效，中医用来治疗脱肛、痔疮、绕虫病等。salgado vl等研究发现shi、cpi和cgii三种海葵毒素对甲壳类动物特别致命，对昆虫(蟑螂)有中等毒性，对哺乳动物(小鼠)基本上无毒。atx
‑
i和atx
‑
ii对昆虫钠通道非常有效，与蟑螂神经膜结合亲和力高，而对大鼠脑突触体的结合亲和力低，所以atx
‑
i和atx
‑
ii优先瞄准昆虫而不是老鼠。某些海葵毒素能够特异作用于昆虫而具有较强的杀虫能力，而对哺乳动物的毒性很小或无毒副作用。海葵多肽毒素作为新型杀虫剂安全又有效。cn111876457a公开套膜海葵酶解多肽的制备及其杀虫应用，为套膜海葵的提取物，为多种序列多肽的混合物，不好以控制成分组成，均不利于提高药剂药效以及安全性。


技术实现要素：

3.鉴于此，本发明提出一种海葵多肽毒素ap
‑
gt及其制备方法和应用，解决上述技术问题。
4.本发明的技术方案是这样实现的：一种海葵多肽毒素ap
‑
gt，
5.其序列为gidctcnghngeywfgvqscngnakhdcssilgrccvy，具有6个半胱氨酸，形成3个二硫键。
6.2、根据权利要求1所述的海葵多肽毒素ap
‑
gt的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.(1)取2
‑
cl树脂，用dcm浸泡、洗涤；加入fmoc
‑
tyr(tbu)
‑
oh，加入dcm和diea反应，再加入甲醇和dcm封闭反应；
8.(2)用dmf洗涤步骤(1)处理后的树脂，加入哌啶脱除fmoc，反应后再洗涤树脂；
9.(3)取下一个氨基酸fmoc
‑
val
‑
oh和hobt，加入dmf和dic反应，反应后再洗涤树脂；
10.(4)用dmf洗涤步骤(3)处理后的树脂，加入哌啶脱除fmoc，反应后再洗涤树脂；
11.(5)重复(3)，(4)步骤直到肽链结束；
12.(6)取步骤(5)得到的树脂，加入切割液，摇晃切割，过滤除去树脂，得到切割后的滤液，最后将滤液加入冰乙醚，离心，收集底部多肽，得到粗品多肽；
13.(7)将粗品多肽用hplc分离纯化多肽，干燥，得到线性肽ap
‑
gt；
14.(8)取步骤(7)得到的线性肽ap
‑
gt进行氧化折叠，得到氧化肽ap
‑
gt，采用制备型hplc对氧化肽ap
‑
gt进行分离纯化，得到纯品。
15.进一步的，步骤(1)，所述2
‑
cl树脂的取代度sd＝0.2mmol/g。
16.进一步的，步骤(1)，加入dcm、diea反应的时间为80
‑
100min，再加入甲醇、dcm封闭反应的时间20
‑
40min。
17.进一步的，步骤(2)、步骤(4)，所述反应的时间均为15
‑
25min。
18.进一步的，步骤(3)，加入dic反应的时间为0.8
‑
1.2h。
19.进一步的，步骤(6)，按质量百分比计，所述切割液由三氟乙酸95％、水1％、3,4
‑
乙烯二氧噻吩2％和三异丙基硅烷2％制得。
20.进一步的，步骤(6)，所述切割的时间为1.8
‑
2.2h。
21.进一步的，步骤(6)，所述离心条件：3000转/min离心2min。
22.本发明任一项所述的海葵多肽毒素ap
‑
gt在制备杀虫剂中的应用。
23.本发明中使用原料中文名称见下表1：
24.表1化合物中文名称
[0025][0026]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0027]
(1)本发明合成的海葵多肽毒素ap
‑
gt，其序列为gidctcnghngeywfgvqscngnakhdcssilgrccvy，对黄粉虫具有更加显著杀虫作用，半数致死剂量为14.8nm。
[0028]
(2)本发明合成特定序列的海葵多肽毒素ap
‑
gt，在应用中不但能够有效控制其添加量，而且最大发挥其功效，减少药剂用量，最大化提高安全性。
[0029]
(3)本发明获得高效杀虫效果而对哺乳动物毒性小的海洋多肽，可为研发新型、高效、安全生物杀虫剂奠定基础。
附图说明
[0030]
图1
‑
a、图1
‑
b为线性肽ap
‑
gt的高效液相分析和质谱鉴定图谱；
[0031]
图2为线性肽ap
‑
gt的动态氧化折叠过程；
[0032]
图3为hplc分析氧化肽ap
‑
gt图谱；
[0033]
图4多肽ap
‑
gt对黄粉虫的杀虫作用，注：实验组对比于阴性对照组，*表示具有显著性差异(**p<0.01；***p<0.001)。
具体实施方式
[0034]
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
[0035]
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036]
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037]
实施例
[0038]
1.材料与方法
[0039]
1.1实验材料
[0040]
色谱级三氟乙酸(trifluoroacetic acid，tfa)和色谱级乙腈(acetonitrile，acn)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；water分析型c18柱(5μm，4.6mm
×
250mm)购自美国waters公司；依利特制备型c18柱(10μm，10mm
×
250mm)购自大连依利特分析仪器有限公司；质粒抽提试剂盒等常规分子生物学试剂购自天根生化科技(北京)有限公司。
[0041]
1.2实验仪器
[0042]
cem全自动微波多肽合成仪(libertyblue，美国)；反相高效液相色谱(thermo fisher，德国)；三重四极杆液相色谱质谱联用仪(岛津，日本)；台式冻干机(赛飞，中国)；酶标仪(mr
‑
96a，深圳迈瑞)；膜片钳系统(axon900a，美国)。
[0043]
1.3实验方法
[0044]
1.3.1海葵多肽毒素ap
‑
gt的合成和氧化折叠
[0045]
(1)称取2
‑
cl树脂3g，取代度sd＝0.2mmol/g，加入反应器中用dcm(20ml)浸泡5min，用dmf(20)洗涤2次，第三次用dcm洗涤一次，加入0.8mmol的fmoc
‑
tyr(tbu)
‑
oh，加入12ml dcm,2ml diea。反应90min，90min后补加4ml分析甲醇，10ml dcm，封闭反应30min。
[0046]
(2)用dmf洗涤4次，加入哌啶(20％哌啶+80％dmf)，脱除fmoc，20min。用dmf洗涤树脂5次，取少量树脂(10
‑
20粒)加入检测管中，加入茚三酮(5g/100ml分析乙醇)2滴，吡啶2滴，100摄氏度加热2min，显色即可。
[0047]
(3)称取下一个氨基酸fmoc
‑
val
‑
oh(1.8mmol)+hobt(1.8mmol)，加入反应器中，倒入10ml dmf，在加入2ml dic反应1h之后用dmf洗涤4次，取少量树脂检测，无色即可。
[0048]
(4)用dmf洗涤4次，加入哌啶(20％哌啶+80％dmf)，脱除fmoc，20min。用dmf洗涤树脂5次，取少量树脂(10
‑
20粒)加入检测管中，加入茚三酮(5g/100ml分析乙醇)2滴，吡啶2滴，100摄氏度加热2min，显色即可。
[0049]
(5)重复(3)，(4)步骤直到肽链结束。
[0050]
(6)把树脂用甲醇抽干放在50ml离心管，加切割液(95％tfa+1％h2o+2％edt+2％tis)40ml,摇晃切割2h，最后把切割液(过滤走树脂)平分在4个新的50ml离心管中，加入40ml冰乙醚，摇晃均匀，3000转/min离心2min，多肽留在底部，倒走上层的乙醚。得到粗品多
肽。
[0051]
(7)用hplc分离纯化多肽，得到纯品多肽，然后由真空冷冻干燥机冻干成粉末状。
[0052]
(8)称取步骤(7)得到的线性肽样品，用少量水助溶后按比例1:2加入0.1mnh4hco3搅拌，于24、48、72h取样用hplc观察动态氧化折叠过程并对其纯化得到纯品，随后用质谱进行鉴定确认。
[0053]
1.3.2昆虫注射法
[0054]
选用体重约180mg的黄粉虫进行昆虫注射法，具体步骤参照文献“芋螺毒素imi的化学合成及其杀虫活性研究”。简单描述如下：用0.7wt％nacl溶液将多肽ap
‑
gt溶解至5nm、10nm、15nm、20nm和25nm，注射5μl多肽ap
‑
gt至黄粉虫腹部。以未做任何处理黄粉虫作为空白对照，5μl 0.7wt％nacl溶液注射黄粉虫作为阴性对照组。
[0055]
1.3.3数据处理
[0056]
数据均采用软件graphpad prism6进行统计和处理，对照组和实验组间的数据采用t检验分析，*表示差异显著(p<0.05)，**表示差异极显著(p<0.01)。
[0057]
2结果
[0058]
2.1多肽的合成和氧化折叠
[0059]
采用多肽固相合成法(spps)合成了线性肽ap
‑
gt，对线性肽进行hplc纯化，经质谱鉴定分子量为4112.57da(见图1
‑
b)。利用空气氧化法对合成的线性肽ap
‑
gt进行一步法氧化折叠，于24、48、72h取样用hplc观察动态氧化折叠过程(见图2)。线性肽ap
‑
gt的理论分子量为4112.57da，氧化肽ap
‑
gt的分子量为4106.62，两者相差约为6da，证明其正确形成3个二硫键。
[0060]
2.2氧化肽的分离纯化
[0061]
采用制备型hplc对氧化肽ap
‑
gt进行分离纯化，纯化后再利用分析型hplc进行分析，结果如图3所示，氧化肽ap
‑
gt的洗脱时间为17.477min，根据峰面积计算其纯度超过95％。
[0062]
2.3昆虫注射法
[0063]
实验结果如图4所示，空白对照和阴性对照组的黄粉虫死亡率均为0，表明采用注射法来评价多肽ap
‑
gt的杀虫效果是可行的。黄粉虫的死亡率均随着多肽ap
‑
gt的剂量增加而增加，与对照组相比均具有显著性差异。高剂量25nm多肽ap
‑
gt对昆虫的死亡率达到90.0％，经软件计算半数致死剂量为14.8nm。同一死亡率下多肽ap
‑
gt用量仅为套膜海葵小分子多肽混合物0.3％以下，可以显著减少杀虫药剂用量。
[0064][0065]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。