一种gSSR分子标记及其党参真伪鉴定的方法

一种gssr分子标记及其党参真伪鉴定的方法
技术领域
1.本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种gssr分子标记及其党参真伪鉴定的方法。


背景技术：

2.党参为桔梗科党参属植物党参(codonopsis pilosula(franch.)nannf.)、素花党参(codonopsis pilosula(franch.)nannf.var.modesta(nannf..)l.t.shen)、川党参(codonopsis tangshen oliv.)的干燥根。中医认为党参具有补中益气、生津和胃、健脾益肺等功效，随着2018年党参入选药食同源目录，其价格也呈现上升的趋势，市面上随之出现一些伪品冒充党参进行销售。
3.常见的党参伪品以石竹科植物银柴胡(stellaria dichotoma l.
4.var.lanceolata bge.)一年生的干燥根和伞形科植物防风(saposhnikovia divaricata(trucz.)schischk.)家种品种的干燥根为主。
5.常规党参真伪品鉴定包括性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别等方法，其中，性状鉴别和显微鉴定的准确性依赖于鉴定人的鉴别经验和技术，主观因素较大，鉴定结果有一定的局限性。理化鉴定方法鉴别中药材的真伪，虽然准确，但却费时费力。尤其在实际生产和流通过程中，党参、银柴胡、家种防风均已切成配方用的中药饮片，特别是混合饮片增加了鉴别的难度。因此，从分子水平对党参及其伪品进行准确、有效的鉴定是保证人民群众用药安全的关键。
6.ssr即简单重复序列，又称为微卫星dna，由1～6个核苷酸所组成，广泛存在于真核生物的基因组，具有操作简单、多态性高、重复性好等优点。利用全基因组信息设计开发gssr分子标记可用于各种动、植物的品种鉴定、遗传多样性分析、遗传图谱构建及相关性状调控基因的遗传定位等方面的分析。目前，党参标记开发方面涉及转录组序列、est序列和叶绿体基因组序列基础上开发的分子标记，有关gssr分子标记的开发及其应用仍属于空白状态。因此，分析轮叶党参全基因组序列、开发gssr标记并筛选用于党参真伪品鉴定的有效标记是提高临床用药有效性的前提。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于针对现有党参真伪品鉴定方法的缺点，提供一种gssr分子标记及其党参真伪鉴定的方法。
8.为解决上述技术中存在的问题，本发明采用的技术方案：
9.一种gssr分子标记，包括以下步骤：
10.(1)轮叶党参全基因组序列提取；
11.(2)ssr位点分析
12.利用misa软件分析轮叶党参全基因组8条染色体上的ssr位点，软件设置标准为：base pair，bp 1、2、3、4、5、6bp，重复次数依次不少于10、6、5、5、5、5、5次，复合ssr小于
100bp；
13.(3)gssr引物设计
14.利用primer 5.0分别进行8条染色体上gssr标记设计，并结合手动设计引物，引物的设计标准为：gc含量在30％～70％，产物的大小为100～250bp，tm值在55℃～65℃之间，上下游引物tm值差异为3～5℃，引物长度为18～25bp，引物gc含量30％～70％；
15.(4)步骤(3)gssr引物分子标记得到6对引物序列如下：
[0016][0017]
所述gssr分子标记在党参真伪鉴定中的应用。
[0018]
使用gssr分子标记对党参进行真伪鉴定的方法，包括以下步骤：
[0019]
(1)材料的收集和dna提取
[0020]
收集党参，使用ctab提取法，提取基因组dna，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna质量；并且ctab提取法中的提取缓液为85度水浴预热；
[0021]
(2)gssr
‑
pcr反应
[0022]
gssr
‑
pcr反应总体系为10μl，包括1
×
taq dna聚合酶buffer、25mm mgcl2、1.0u taq酶、15mm dntps、gssr标记上下游引物各0.15μm、dna100 ng，双蒸水补齐到10μl；反应程序为94℃预变性5min，94℃变性1min、55℃复性45s、72℃延伸1.5min，34个循环，最后72℃延伸10min；
[0023]
(3)党参gssr
‑
pcr反应电泳检测
[0024]
取pcr产物3μl与等量6
×
上样液混匀，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，180v恒压1h，银酸银染色；
[0025]
(4)分析
[0026]
从设计的引物中选取6对引物进行筛选，根据材料间扩增出特异条带的有无对党参及其伪品进行鉴定。
[0027]
所述gssr分子标记方法在党参真伪鉴定中的应用。
[0028]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0029]
第一、轮叶党参叶绿体全基因组序列为1273.26mb，分布于8条染色体上，本发明在此基础上开发出的分子标记数量庞大，这些海量的标记可以满足党参真伪、基原、正品与替代品、年限与产地等方面的鉴定。
[0030]
第二、党参真伪品鉴定采用的性状鉴别和显微鉴别要求鉴定人员必须有足够的鉴别经验，技术要求高，而理化鉴别又存在费时、费力的缺点。本发明中的gssr标记是基于党参全基因组序列设计开发出的分子标记，与传统鉴定技术相比具有准确性高，省时省力的
优点。这些标记的开发丰富了党参分子标记的类型。
附图说明
[0031]
图1为6对引物在3种材料中的扩增结果。
[0032]
图中，1m：marker；1：党参；2：银柴胡；3：防风
具体实施方式
[0033]
实施例1轮叶党参全基因组序列信息
[0034]
轮叶党参基因组大小为1273.26mb，gc的百分含量为37.2105％，其中，1号染色体大小为184.34mb，gc的百分含量为37.2％；2号染色体大小为179.64mb，gc的百分含量为37.1％；3号染色体大小为165.49mb，gc的百分含量为37.3％；4号染色体大小为154.4mb，gc的百分含量为37.2％；5号染色体大小为128.35mb，gc的百分含量为37.3％；6号染色体大小为121.46mb，gc的百分含量为37.3％；7号染色体大小为112.34mb，gc的百分含量为37.2％；8号染色体大小为101.35mb，gc的百分含量为37.1％。
[0035]
实施例2轮叶党参全基因组ssr位点分析
[0036]
对党参8条染色体序列的ssr位点分析发现单核苷酸的重复单元最多，占总重复单元的51.10％以上，二核苷酸的重复单元次之，占总重复单元的33.80％以上，六核苷酸的重复单元最少，占总重复单元的0.43％以下；三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸的重复单元居中，分别占总重复单元的10.50％、1.00％、1.80％左右。不同核苷酸重复单元类型中的不同重复单元比例差别比较大，例如，单核苷酸重复单元以a/t为主，二核苷酸重复单元中at/ta比较多等(表1—8)。
[0037]
表1党参中1号染色体不同ssr重复基序
[0038][0039]
表2党参中2号染色体不同ssr重复基序
[0040]
[0041][0042]
表3党参中3号染色体不同ssr重复基序
[0043][0044]
表4党参中4号染色体不同ssr重复基序
[0045][0046]
表5党参中5号染色体不同ssr重复基序
[0047]
[0048][0049]
表6党参中6号染色体不同ssr重复基序
[0050][0051]
表7党参中7号染色体不同ssr重复基序
[0052][0053]
表8党参中8号染色体不同ssr重复基序
[0054][0055]
实施例3党参gssr标记设计
[0056]
利用primer 5.0进行gssr标记设计，结合手动对引物进行适当调整。1号染色体设
计出206928对标记，2号染色体设计出303925对标记，3号染色体设计出185130对标记，4号染色体设计出168213对标记，5号染色体设计出141990对标记，6号染色体设计出133422对标记，7号染色体设计出124851对标记，8号染色体设计出114582对标记，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0057]
实施例4党参gssr标记筛选与验证
[0058]
选取设计出的引物对3个材料进行扩增，pcr扩增产物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶进行检测，结果发现6对标记在商品党参样品中均能扩增出特异性条带，而在伪品即银柴胡和防风样品中无扩增条带，说明此6对标记可准确鉴定党参及其伪品。
[0059]
表9 6对党参gssr标记
[0060]