技术特征：
1.一种目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rdna的方法，是将待转化的酿酒酵母先在含有羟基脲的培养基上进行预培养，然后再通过常规转化方法将两端带有rdna同源序列的dna片段转入酿酒酵母，最后在筛选培养基上筛选转化子实现；其特征在于：所述含有羟基脲的培养基是指在酵母常规培养基的基础上，添加终浓度为60mm
‑
250mm的羟基脲；所述在含有羟基脲的培养基上预培养的方法是：将待转化的酿酒酵母活化后，转接到含羟基脲的培养基中培养，按每两天转接一次，每次都是转接到新鲜的含有羟基脲的培养基中，总共培养6
‑
8天；所述两端带有rdna同源序列的dna片段含有筛选标记基因表达盒和目的基因表达盒，其组成及顺序为3
’‑
rdna同源序列1
‑
筛选标记基因表达框
‑
目的基因表达框
‑
rdna同源序列2
‑5’
；其中rdna同源序列1或rdna同源序列2是5srdna或35s rdna区域的同源序列，筛选标记基因表达框或目的基因表达框上下游顺序随意，目的基因表达框可以是一个或多个；其中筛选标记基因是抗生素抗性基因或是弥补营养缺陷型酵母的营养缺陷的基因；所述筛选培养基针对的是引入转化子并表达的筛选标记基因，是带有抗生素的培养基或是营养缺陷型培养基；或是在所述筛选培养基基础上再额外添60mm
‑
250mm浓度的羟基脲。2.根据权利要求1所述目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rdna的方法，其特征在于：所述含有羟基脲的培养基是指在酵母常规培养基的基础上，添加终浓度为150mm
‑
200mm的羟基脲。3.根据权利要求1所述目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rdna的方法，其特征在于：所述rdna同源序列1或rdna同源序列2是35srdna区域的同源序列；所述的抗生素抗性基因是g418抗性基因。4.根据权利要求1所述目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rdna的方法，其特征在于：所述两端带有rdna同源序列的dna片段是rdna
up
‑
gfp
‑
kanmx
‑
ru
‑
xyla
‑
rdna
down
，其是利用seq id no:2所示核苷酸序列的引物rdna
‑1‑
f和seq id no:5所示核苷酸序列的引物rdna
‑2‑
r，以seq id no:1所示核苷酸序列的质粒peasy
‑
blunt
‑
gfp
‑
kanmx
‑
ruxi扩增获得。5.根据权利要求1所述目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rdna的方法，其特征在于：所述筛选培养基是带有抗生素和60mm
‑
200mm羟基脲的培养基。6.根据权利要求1所述目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rdna的方法，其特征在于：所述筛选培养基是营养缺陷型培养基加入终浓度150mm
‑
200mm羟基脲。7.根据权利要求1所述目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rdna的方法，其特征在于：所述筛选培养基是带有200mg/l
‑
20000mg/l g418，同时含有60mm
‑
200mm羟基脲的培养基。8.根据权利要求7所述目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rdna的方法，其特征在于：所述筛选培养基是带有10000mg/l
‑
20000mg/l g418，同时含有60mm
‑
90mm羟基脲的培养基。9.根据权利要求8所述目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rdna的方法，其特征在于：所述筛选培养基是带有20000mg/l g418，同时含有60mm羟基脲的yepd培养基。
技术总结
本发明公开了一种目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法，是将待转化的酿酒酵母先在含有羟基脲的培养基上进行预培养，然后再通过常规转化方法将两端带有rDNA同源序列的DNA片段转入酿酒酵母，最后在筛选培养基上筛选转化子实现。本发明方法利用rDNA拷贝动态平衡的特点，建立了一次转化过程即在rDNA上整合了18个拷贝目的基因的方法。该方法以rDNA为整合靶点，操作便捷，无需额外引入除了重组DNA片段之外的其他DNA；并且，由于其所依赖的特殊机制，理论上可以和现有其他各种高拷贝重组方法联用，实现目的基因更高拷贝的整合，为基因编辑又提供了一种方法和有力的工具。基因编辑又提供了一种方法和有力的工具。基因编辑又提供了一种方法和有力的工具。
技术研发人员：沈煜 郑会会
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：2021.07.29
技术公布日：2021/10/29