一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物基因工程技术领域，具体涉及一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用。


背景技术：

2.粒细胞集落刺激因子(g
‑
csf)是一种糖蛋白，主要作用于中性粒细胞系(lineage)造血细胞的增殖、分化和活化。重组人粒细胞集落刺激因子(rhg
‑
csf
‑
mut/rtbd1)作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能。g
‑
csf临床主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞减少症、治疗骨髓造血机能障碍及骨髓增生异常综合征、预防白细胞减少可能潜在的感染并发症、以及使感染引起的中性粒细胞减少的恢复加快。但是，粒细胞集落刺激因子在临床中存在半衰期短、体内易降解等难题，限制了粒细胞集落刺激因子的临床应用。
3.蓖麻毒素(ricin toxin，rt)由rta和rtb两个肽链以二硫键共价连接。其中rtb由262个氨基酸组成。rtb单独存在时没有毒性。目前认为rtb主要有两个功能：1、帮助rta转运至细胞质内，抑制蛋白质合成；2、rtb增强机体免疫反应。
4.目前，将人g
‑
csf突变体与蓖麻毒素b链截短肽组成重组融合蛋白来提高重组融合蛋白治疗白细胞减少症的活性及延长重组融合蛋白半衰期的研究还未见报道。


技术实现要素：

5.本发明提供一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用，以提高重组融合蛋白治疗白细胞减少症的活性，延长重组融合蛋白半衰期，提高白细胞减少症的治疗效果。
6.本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
7.本发明的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白，该重组融合蛋白由人粒细胞集落刺激因子突变体与蓖麻毒素b链截短肽经柔性linker连接而形成。
8.作为优选的实施方式，所述人粒细胞集落刺激因子突变体的制备过程如下：设计定点突变引物，以重组质粒puc57
‑
hg
‑
csf为模板，将人粒细胞集落刺激因子序列中第19位亮氨酸突变为色氨酸，第28位天冬氨酸突变为精氨酸，将突变后的序列命名为hg
‑
csf
‑
mut；
9.所述定点突变引物的序列如下：
10.siteⅰ11.forward：5'
‑
gagttttctgctgaaatgctgggaacaggttcgtaaaatt c
‑
3'；
12.reverse：5'
‑
gaattttacgaacctgttcccagcatttcagcagaaaactc
‑
3'；
13.siteⅱ14.forward：5'
‑
gtaaaattcagggtaggggcgcagccctgcag
‑
3'；
15.reverse：5'
‑
ctgcagggctgcgcccctaccctgaattttac
‑
3'。
16.作为优选的实施方式，将突变后的hg
‑
csf
‑
mut序列与蓖麻毒素b链截短肽序列通过柔性linker连接起来形成hg
‑
csf
‑
mut/rtbd1序列，其核苷酸序列如seq id no:1所示，其氨基酸序列如seq id no:2所示。
17.作为优选的实施方式，所述柔性linker为(gly4ser)3连接肽。
18.本发明的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
19.步骤一、人粒细胞集落刺激因子突变表达载体构建；
20.步骤二、大肠杆菌重组表达载体构建；
21.步骤三、重组hg
‑
csf
‑
mut/rtbd1融合蛋白表达；
22.步骤四、重组hg
‑
csf
‑
mut/rtbd1融合蛋白纯化与复性。
23.作为优选的实施方式，步骤一具体包括以下步骤：
24.(1)通过swiss
‑
model在线平台对人粒细胞集落刺激因子分子和人粒细胞集落刺激因子受体分子进行同源建模；通过z
‑
dock方法对人粒细胞集落刺激因子分子和人粒细胞集落刺激因子受体分子进行对接，得到复合物结构模型；通过丙氨酸扫描对上述复合物结构模型全长序列进行突变，获得潜在的突变位点；通过虚拟饱和突变对单个突变位点计算突变前后的分子间结合力变化；
25.(2)重组质粒puc57
‑
hg
‑
csf的制备：
26.通过ncbi genbank数据库查询人粒细胞集落刺激因子基因序列，将获取的序列进行全基因合成，合成过程中以大肠杆菌密码子偏好进行密码子优化后，克隆至大肠杆菌克隆载体puc57中，获得大肠杆菌重组克隆载体puc57
‑
hg
‑
csf；
27.(3)设计定点突变引物，其序列如下：
28.siteⅰ29.forward：5'
‑
gagttttctgctgaaatgctgggaacaggttcgtaaaatt c
‑
3'；
30.reverse：5'
‑
gaattttacgaacctgttcccagcatttcagcagaaaactc
‑
3'；
31.siteⅱ32.forward：5'
‑
gtaaaattcagggtaggggcgcagccctgcag
‑
3'；
33.reverse：5'
‑
ctgcagggctgcgcccctaccctgaattttac
‑
3'；
34.(4)以重组质粒puc57
‑
hg
‑
csf为模板，将人粒细胞集落刺激因子序列中第19位亮氨酸突变为色氨酸，第28位天冬氨酸突变为精氨酸，并将突变后的序列命名为hg
‑
csf
‑
mut；将突变后的hg
‑
csf
‑
mut序列与蓖麻毒素b链截短肽序列通过柔性linker连接起来形成hg
‑
csf
‑
mut/rtbd1序列，其核苷酸序列如seq id no:1所示，其氨基酸序列如seq id no:2所示，并插入至pmd18t载体，将测序正确的产物命名为pmd18t
‑
hg
‑
csf
‑
mut/rtbd1质粒，作为hg
‑
csf突变表达载体。
35.作为优选的实施方式，步骤二具体包括以下步骤：
36.分别对测序正确的pmd18t
‑
hg
‑
csf
‑
mut/rtbd1质粒和pet30a载体进行双酶切，反应体系及条件如表1所示，将双酶切产物进行胶回收；利用t4连接酶将胶回收后的两个产物进行连接，连接体系及条件如表1所示；
37.表1
38.试剂名称用量t4 dna ligase1μl10
×
t4 dna ligase bμffer4μl回收的hg
‑
csf目的片段4μl回收的pet30a载体片段1μl反应条件16℃过夜
39.将上述连接产物转化至trans10感受态细胞；转化后涂布至终浓度为100μg/ml kan
+
抗性的lb固体平板，培养过夜后，挑取长势良好的多个白色单菌落，扩大培养并进行pcr；将pcr鉴定正确的阳性质粒进行测序分析。
40.作为优选的实施方式，步骤三具体包括以下步骤：
41.将测序正确的阳性菌bl21(de3)/pet30a
‑
hg
‑
csf
‑
mut/rtbd1按1:100v/v的比例接种于5ml含浓度为100μg/ml kan的lb培养基中，37℃下、180rpm恒温振荡培养至od600＝0.6时，再按1:100v/v的比例转接至500ml同样的lb培养基中，并补加kan至终浓度为100μg/ml，37℃下、180rpm恒温振荡培养至od600＝0.6；诱导组添加iptg至终浓度为1mmol/l，37℃下、180rpm恒温振荡诱导16h；经诱导16h后，4℃下、8000rpm离心获得菌体沉淀rhg
‑
csf
‑
mut/rtbd1。
42.作为优选的实施方式，步骤四具体包括以下步骤：
43.(1)离子交换层析：用蛋白纯化a液平衡q柱，将rhg
‑
csf/rtbd1包涵体以蛋白纯化a液变性溶解并将溶解液上柱，收集流穿液，目的蛋白存在于流穿液中；将流穿液的盐离子浓度调整至0.5mol/l以进行下一步金属鳌合层析；
44.(2)金属鳌合层析：用蛋白纯化b液对装载ni
2+
chelating sepharose进行平衡；将离子交换层析纯化的rhg
‑
csf
‑
mut/rtbd1溶液上柱，通过蛋白纯化系统中梯度混合模块将蛋白纯化c液和蛋白纯化d液进行混合，分别用终浓度为50mmol/l与250mmol/l的咪唑对chelating sepharose进行洗脱，分别收集蛋白流穿液、杂蛋白溶液与目的蛋白溶液；将每步收集到的蛋白溶液进行胶浓度为12％sds
‑
page分析；
45.(3)rhg
‑
csf
‑
mut/rtbd1蛋白复性：将经两步纯化的rhg
‑
csf
‑
mut/rtbd1蛋白溶液使用蛋白复性a液进行稀释，稀释至rhg
‑
csf
‑
mut/rtbd1浓度为0.1mg/ml，并装入至截留分子量为3000的蛋白超滤系统中进行透析复性，向蛋白超滤系统中加入蛋白复性b液；调节蛋白超滤系统中蠕动泵的转速和出液阀松紧程度，使蛋白浓缩速度与b液进液速度保持一致；蛋白复性过程于4℃进行，整个流程进行48～72h，以满足对尿素的彻底去除以及rhg
‑
csf
‑
mut/rtbd1蛋白的缓慢而充分的折叠；蛋白复性b液流尽后，通入蛋白复性c液去除复性过程中残留的蔗糖及甘油成分，并将rhg
‑
csf
‑
mut/rtbd1蛋白进行浓缩，浓缩至其浓度为1～1.5mg/ml，得到重组hg
‑
csf
‑
mut/rtbd1融合蛋白；
46.蛋白纯化a液的组成为：50mmol/l pb，8mol/l urea，ph 6.0；
47.蛋白纯化b液的组成为：50mmol/l pb，8mol/l urea，0.5mol/l nacl ph 6.0；
48.蛋白纯化c液的组成为：50mmol/l tris，8mol/l urea，0.5mol/l nacl，ph 8.0；
49.蛋白纯化d液的组成为：50mmol/l tris，8mol/l urea，0.5mol/l nacl，500mmol/l imidazole，ph 8.0；
50.蛋白复性a液的组成为：50mmol/l tris，8mol/l urea，10％m/v蔗糖，10％v/v丙三
醇，5mmol/l dtt，ph 8.0；
51.蛋白复性b液的组成为：50mmol/l tris，10％m/v蔗糖，10％v/v丙三醇，ph 8.0；
52.蛋白复性c液的组成为：50mmol/l tris，ph 8.0。
53.本发明的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白在制备治疗白细胞减少症药物中的应用。
54.本发明的有益效果是：
55.本发明的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白，由人粒细胞集落刺激因子突变体与蓖麻毒素b链截短肽经柔性linker连接而形成。其中，柔性linker选用(gly4ser)3连接肽。本发明的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白相比普通人粒细胞集落刺激因子，具有半衰期长、生物学活性高等优点，通过本发明的制备方法制备的人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白延长了重组融合蛋白的半衰期，提高了重组融合蛋白的生物活性，降低了人粒细胞集落刺激因子制剂的制备成本。
56.本发明的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白可以应用于制备治疗白细胞减少症药物，具有开发成治疗白细胞减少症的药物和兽医临床应用的巨大潜力和价值。
附图说明
57.图1为人粒细胞集落刺激因子(hg
‑
csf)突变前后的示意图。
具体实施方式
58.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
59.实施例1重组hg
‑
csf
‑
mut/rtbd1融合蛋白的制备
60.1、人粒细胞集落刺激因子(hg
‑
csf)突变表达载体构建
61.(1)通过swiss
‑
model在线平台对人粒细胞集落刺激因子分子和人粒细胞集落刺激因子受体分子进行同源建模；通过z
‑
dock方法对人粒细胞集落刺激因子分子和人粒细胞集落刺激因子受体分子进行对接，得到复合物结构模型；通过丙氨酸扫描对上述复合物结构模型全长序列进行突变，获得潜在的突变位点；通过虚拟饱和突变对单个突变位点计算突变前后的分子间结合力变化。
62.(2)重组质粒puc57
‑
hg
‑
csf的制备：
63.通过ncbi genbank数据库查询人粒细胞集落刺激因子基因序列，将获取的序列进行全基因合成，合成过程中以大肠杆菌密码子偏好进行密码子优化后，克隆至大肠杆菌克隆载体puc57中，获得大肠杆菌重组克隆载体puc57
‑
hg
‑
csf。
64.(3)设计定点突变引物，其序列如下：
65.siteⅰ66.forward：5'
‑
gagttttctgctgaaatgctgggaacaggttcgtaaaatt c
‑
3'；
67.reverse：5'
‑
gaattttacgaacctgttcccagcatttcagcagaaaactc
‑
3'；
68.site
ꢀⅱ
69.forward：5'
‑
gtaaaattcagggtaggggcgcagccctgcag
‑
3'；
70.reverse：5'
‑
ctgcagggctgcgcccctaccctgaattttac
‑
3'。
71.(4)如图1所示，以重组质粒puc57
‑
hg
‑
csf为模板，将人粒细胞集落刺激因子序列中第19位亮氨酸突变为色氨酸，第28位天冬氨酸突变为精氨酸，以增强人粒细胞集落刺激因子/rtbd1融合蛋白的稳定性与抗病毒活性，并将突变后的序列命名为hg
‑
csf
‑
mut。将突变后的hg
‑
csf
‑
mut序列与蓖麻毒素b链截短肽序列(rtbd1序列，其核苷酸序列如序列表中的seq id no:3所示，氨基酸序列如序列表中的seq id no:4所示)通过柔性linker连接起来形成hg
‑
csf
‑
mut/rtbd1序列，其核苷酸序列如seq id no:1所示，其氨基酸序列如seq id no:2所示，并插入至pmd18t载体，经测序后，将测序正确的产物命名为：pmd18t
‑
hg
‑
csf
‑
mut/rtbd1质粒，作为hg
‑
csf突变表达载体，以便下游基因工程操作。其中，所采用的柔性linker为(gly4ser)3连接肽。
72.2、大肠杆菌重组表达载体构建
73.分别对上述测序正确的pmd18t
‑
hg
‑
csf
‑
mut/rtbd1质粒和pet30a载体进行双酶切，反应体系及条件如表1所示，将双酶切产物进行胶回收。利用t4连接酶将胶回收后的两个产物进行连接，连接体系及条件如表1所示。
74.表1
75.试剂名称用量t4 dna ligase1μl10
×
t4 dna ligase bμffer4μl回收的hg
‑
csf目的片段4μl回收的pet30a载体片段1μl反应条件16℃过夜
76.将上述连接产物转化至trans10感受态细胞。转化后涂布至终浓度为100μg/ml kan
+
抗性的lb固体平板，培养过夜后，挑取长势良好的多个白色单菌落，扩大培养并进行pcr。将pcr鉴定正确的阳性质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序分析。
77.3、重组hg
‑
csf
‑
mut/rtbd1融合蛋白表达
78.将上述测序正确的阳性菌bl21(de3)/pet30a
‑
hg
‑
csf
‑
mut/rtbd1按1:100v/v的比例接种于5ml含浓度为100μg/ml kan的lb培养基中，37℃下、180rpm恒温振荡培养至od600＝0.6时，再按1:100v/v的比例转接至500ml同样的lb培养基中，并补加kan至终浓度为100μg/ml，37℃下、180rpm恒温振荡培养至od600＝0.6；诱导组添加iptg至终浓度为1mmol/l，37℃下、180rpm恒温振荡诱导16h；经诱导16h后，4℃下、8000rpm离心获得菌体沉淀rhg
‑
csf
‑
mut/rtbd1。
79.4、重组hg
‑
csf
‑
mut/rtbd1融合蛋白纯化与复性
80.使用两步纯化法将菌体沉淀rhg
‑
csf
‑
mut/rtbd1进行纯化。其纯化方法以先进行离子交换层析、后进行金属鳌合层析的顺序进行，具体操作步骤如下：
81.(1)离子交换层析：使用蛋白纯化a液(50mmol/l pb，8mol/l urea，ph 6.0)平衡q柱，将rhg
‑
csf/rtbd1包涵体以蛋白纯化a液变性溶解并将溶解液上柱，收集流穿液，目的蛋白主要存在于流穿液中。将流穿液的盐离子浓度调整至0.5mol/l以进行下一步金属鳌合层
析。
82.(2)金属鳌合层析：使用蛋白纯化b液(50mmol/l pb，8mol/l urea，0.5mol/l nacl ph 6.0)对装载ni
2+
chelating sepharose进行平衡。将离子交换层析纯化的rhg
‑
csf
‑
mut/rtbd1溶液上柱，通过蛋白纯化系统中梯度混合模块将蛋白纯化c液(50mmol/l tris，8mol/l urea，0.5mol/l nacl，ph 8.0)和蛋白纯化d液(50mmol/l tris，8mol/l urea，0.5mol/l nacl，500mmol/l imidazole，ph 8.0)进行混合，分别使用终浓度为50mmol/l与250mmol/l的咪唑对chelating sepharose进行洗脱，分别收集蛋白流穿液、杂蛋白溶液与目的蛋白溶液。将每步收集到的蛋白溶液进行胶浓度为12％sds
‑
page分析。
83.(3)rhg
‑
csf
‑
mut/rtbd1蛋白复性：将经两步纯化的rhg
‑
csf
‑
mut/rtbd1蛋白溶液使用蛋白复性a液(50mmol/l tris，8mol/l urea，10％m/v蔗糖，10％v/v丙三醇，5mmol/l dtt，ph 8.0)进行稀释，稀释至rhg
‑
csf
‑
mut/rtbd1浓度为0.1mg/ml，并装入至截留分子量为3000的蛋白超滤系统中进行透析复性，向蛋白超滤系统中加入蛋白复性b液(50mmol/l tris，10％m/v蔗糖，10％v/v丙三醇，ph 8.0)。调节蛋白超滤系统中蠕动泵的转速和出液阀松紧程度，使蛋白浓缩速度与b液进液速度保持一致。蛋白复性过程于4℃进行，整个流程进行48～72h，以满足对尿素的彻底去除以及rhg
‑
csf
‑
mut/rtbd1蛋白的缓慢而充分的折叠。蛋白复性b液流尽后，通入蛋白复性c液(50mmol/l tris，ph 8.0)去除复性过程中残留的蔗糖及甘油等成分，并将rhg
‑
csf
‑
mut/rtbd1蛋白进行浓缩，浓缩至其浓度为1～1.5mg/ml，得到rhg
‑
csf
‑
mut/rtbd1融合蛋白。
84.实施例2重组hg
‑
csf
‑
mut/rtbd1融合蛋白的药效学试验
85.1、构建白细胞减少症小鼠模型
86.选取18只小鼠，腹腔注射环磷酰胺2mg/只
·
天，连续注射三日。第四日取小鼠全血作血常规检测，检测白细胞数目(wbc)。本次试验中采用的模型成功标准为：白细胞数目低于参考范围最低值0.8
×
109/l。符合以上条件的小鼠，认定白细胞减少症小鼠模型制备成功。正常组与模型对照组于造模后次日皮下给予生理盐水，给药组于造模后次日将0.2μg rhg
‑
csf
‑
mut/rtbd1融合蛋白皮下给予小鼠颈背部。
87.表2重组hg
‑
csf
‑
mut/rtbd1融合蛋白治疗白细胞减少症动物分组情况
88.动物分组动物数组别给药方式给药16正常组皮下注射生理盐水26模型对照组皮下注射生理盐水36给药组皮下注射rhg
‑
csf
‑
mut/rtbd1
89.2、血常规检测
90.使用血常规分析仪，检测小鼠血液内白细胞数目，结果如表3所示。
91.表3各组白细胞数目(n＝6)
[0092][0093]
[0094]
结果可知，与模型对照组相比较白细胞数量显著增加，并恢复至正常小鼠参考范围内(0.8
×
109～6.8
×
109/l)，证明本发明的rhg
‑
csf
‑
mut/rtbd1融合蛋白成功治疗白细胞减少症。
[0095]
本发明公开了一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。