技术特征：
1.一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白，其特征在于，该重组融合蛋白由人粒细胞集落刺激因子突变体与蓖麻毒素b链截短肽经柔性linker连接而形成。2.根据权利要求1所述的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白，其特征在于，所述人粒细胞集落刺激因子突变体的制备过程如下：设计定点突变引物，以重组质粒puc57
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hg
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csf为模板，将人粒细胞集落刺激因子序列中第19位亮氨酸突变为色氨酸，第28位天冬氨酸突变为精氨酸，将突变后的序列命名为hg
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csf
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mut；所述定点突变引物的序列如下：siteⅰforward：5'
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gagttttctgctgaaatgctgggaacaggttcgtaaaattc
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3'；reverse：5'
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gaattttacgaacctgttcccagcatttcagcagaaaactc
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3'；siteⅱforward：5'
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gtaaaattcagggtaggggcgcagccctgcag
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3'；reverse：5'
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ctgcagggctgcgcccctaccctgaattttac
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3'。3.根据权利要求2所述的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白，其特征在于，将突变后的hg
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csf
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mut序列与蓖麻毒素b链截短肽序列通过柔性linker连接起来形成hg
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csf
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mut/rtbd1序列，其核苷酸序列如seq id no:1所示，其氨基酸序列如seq id no:2所示。4.根据权利要求1所述的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白，其特征在于，所述柔性linker为(gly4ser)3连接肽。5.如权利要求1
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4中任意一项所述的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、人粒细胞集落刺激因子突变表达载体构建；步骤二、大肠杆菌重组表达载体构建；步骤三、重组hg
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csf
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mut/rtbd1融合蛋白表达；步骤四、重组hg
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csf
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mut/rtbd1融合蛋白纯化与复性。6.根据权利要求5所述的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤一具体包括以下步骤：(1)通过swiss
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model在线平台对人粒细胞集落刺激因子分子和人粒细胞集落刺激因子受体分子进行同源建模；通过z
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dock方法对人粒细胞集落刺激因子分子和人粒细胞集落刺激因子受体分子进行对接，得到复合物结构模型；通过丙氨酸扫描对上述复合物结构模型全长序列进行突变，获得潜在的突变位点；通过虚拟饱和突变对单个突变位点计算突变前后的分子间结合力变化；(2)重组质粒puc57
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hg
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csf的制备：通过ncbi genbank数据库查询人粒细胞集落刺激因子基因序列，将获取的序列进行全基因合成，合成过程中以大肠杆菌密码子偏好进行密码子优化后，克隆至大肠杆菌克隆载体puc57中，获得大肠杆菌重组克隆载体puc57
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hg
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csf；(3)设计定点突变引物，其序列如下：siteⅰforward：5'
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gagttttctgctgaaatgctgggaacaggttcgtaaaattc
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3'；
reverse：5'
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gaattttacgaacctgttcccagcatttcagcagaaaactc
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3'；siteⅱforward：5'
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gtaaaattcagggtaggggcgcagccctgcag
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3'；reverse：5'
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ctgcagggctgcgcccctaccctgaattttac
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3'；(4)以重组质粒puc57
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hg
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csf为模板，将人粒细胞集落刺激因子序列中第19位亮氨酸突变为色氨酸，第28位天冬氨酸突变为精氨酸，并将突变后的序列命名为hg
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csf
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mut；将突变后的hg
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csf
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mut序列与蓖麻毒素b链截短肽序列通过柔性linker连接起来形成hg
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csf
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mut/rtbd1序列，其核苷酸序列如seq id no:1所示，其氨基酸序列如seq id no:2所示，并插入至pmd18t载体，将测序正确的产物命名为pmd18t
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hg
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csf
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mut/rtbd1质粒，作为hg
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csf突变表达载体。7.根据权利要求6所述的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤二具体包括以下步骤：分别对测序正确的pmd18t
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hg
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csf
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mut/rtbd1质粒和pet30a载体进行双酶切，反应体系及条件如表1所示，将双酶切产物进行胶回收；利用t4连接酶将胶回收后的两个产物进行连接，连接体系及条件如表1所示；表1试剂名称用量t4dnaligase1μl10
×
t4dnaligasebμffer4μl回收的hg
‑
csf目的片段4μl回收的pet30a载体片段1μl反应条件16℃过夜将上述连接产物转化至trans10感受态细胞；转化后涂布至终浓度为100μg/mlkan
+
抗性的lb固体平板，培养过夜后，挑取长势良好的多个白色单菌落，扩大培养并进行pcr；将pcr鉴定正确的阳性质粒进行测序分析。8.根据权利要求7所述的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤三具体包括以下步骤：将测序正确的阳性菌bl21(de3)/pet30a
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hg
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csf
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mut/rtbd1按1:100v/v的比例接种于5ml含浓度为100μg/mlkan的lb培养基中，37℃下、180rpm恒温振荡培养至od600＝0.6时，再按1:100v/v的比例转接至500ml同样的lb培养基中，并补加kan至终浓度为100μg/ml，37℃下、180rpm恒温振荡培养至od600＝0.6；诱导组添加iptg至终浓度为1mmol/l，37℃下、180rpm恒温振荡诱导16h；经诱导16h后，4℃下、8000rpm离心获得菌体沉淀rhg
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csf
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mut/rtbd1。9.根据权利要求8所述的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤四具体包括以下步骤：(1)离子交换层析：用蛋白纯化a液平衡q柱，将rhg
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csf/rtbd1包涵体以蛋白纯化a液变性溶解并将溶解液上柱，收集流穿液，目的蛋白存在于流穿液中；将流穿液的盐离子浓度调整至0.5mol/l以进行下一步金属鳌合层析；(2)金属鳌合层析：用蛋白纯化b液对装载ni
2+
chelating sepharose进行平衡；将离子
交换层析纯化的rhg
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csf
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mut/rtbd1溶液上柱，通过蛋白纯化系统中梯度混合模块将蛋白纯化c液和蛋白纯化d液进行混合，分别用终浓度为50mmol/l与250mmol/l的咪唑对chelating sepharose进行洗脱，分别收集蛋白流穿液、杂蛋白溶液与目的蛋白溶液；将每步收集到的蛋白溶液进行胶浓度为12％sds
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page分析；(3)rhg
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csf
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mut/rtbd1蛋白复性：将经两步纯化的rhg
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csf
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mut/rtbd1蛋白溶液使用蛋白复性a液进行稀释，稀释至rhg
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csf
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mut/rtbd1浓度为0.1mg/ml，并装入至截留分子量为3000的蛋白超滤系统中进行透析复性，向蛋白超滤系统中加入蛋白复性b液；调节蛋白超滤系统中蠕动泵的转速和出液阀松紧程度，使蛋白浓缩速度与b液进液速度保持一致；蛋白复性过程于4℃进行，整个流程进行48～72h，以满足对尿素的彻底去除以及rhg
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csf
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mut/rtbd1蛋白的缓慢而充分的折叠；蛋白复性b液流尽后，通入蛋白复性c液去除复性过程中残留的蔗糖及甘油成分，并将rhg
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csf
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mut/rtbd1蛋白进行浓缩，浓缩至其浓度为1～1.5mg/ml，得到重组hg
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csf
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mut/rtbd1融合蛋白；蛋白纯化a液的组成为：50mmol/l pb，8mol/lurea，ph 6.0；蛋白纯化b液的组成为：50mmol/lpb，8mol/lurea，0.5mol/lnaclph 6.0；蛋白纯化c液的组成为：50mmol/ltris，8mol/lurea，0.5mol/lnacl，ph8.0；蛋白纯化d液的组成为：50mmol/ltris，8mol/lurea，0.5mol/lnacl，500mmol/l imidazole，ph 8.0；蛋白复性a液的组成为：50mmol/l tris，8mol/lurea，10％m/v蔗糖，10％v/v丙三醇，5mmol/l dtt，ph 8.0；蛋白复性b液的组成为：50mmol/l tris，10％m/v蔗糖，10％v/v丙三醇，ph 8.0；蛋白复性c液的组成为：50mmol/ltris，ph 8.0。10.如权利要求1
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4中任意一项所述的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白在制备治疗白细胞减少症药物中的应用。
技术总结
一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用，涉及生物基因工程领域，该重组融合蛋白由人粒细胞集落刺激因子突变体与蓖麻毒素B链截短肽经柔性linker连接而形成，柔性linker为(Gly4Ser)3连接肽。本发明的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白的制备方法包括：人粒细胞集落刺激因子突变表达载体构建；大肠杆菌重组表达载体构建；重组hG
技术研发人员：许娜 孙成彪 石晶 王燕
受保护的技术使用者：长春萤火虫生物科技有限公司
技术研发日：2021.08.17
技术公布日：2021/10/8