一种Anti-NGF药物细胞增殖抑制活性检定方法与流程

一种anti-ngf药物细胞增殖抑制活性检定方法
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体的讲涉及一种anti-ngf药物细胞增殖抑制活性检定方法。


背景技术：

2.tf-1是人红白血病细胞系，可表达人trka并响应重组β-ngf而增殖，anti-ngf药物可与ngf特异性结合，使ngf无法与tf-1细胞上的trka结合，从而导致tf-1细胞的增殖抑制效应。
3.cck8试剂被细胞内脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色甲臜产物，其颜色深浅与细胞增殖成正比，根据其吸光度分别计算参比品和供试品的半数有效浓度，通过比较参比品和供试品的半数有效浓度从而计算anti-ngf药物的生物学活性。


技术实现要素：

4.为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种anti-ngf药物细胞增殖抑制活性检定方法。该方法确立anti-ngf药物细胞增殖抑制活性检验标准操作规程，规范anti-ngf药物细胞增殖抑制活性检验的操作步骤，保证anti-ngf药物细胞增殖抑制活性检验的准确性。
5.本发明的技术方案是这样实现的：
6.一种anti-ngf药物细胞增殖抑制活性检定方法，还包括以下子步骤：
7.a:完全培养基，取一瓶rpmi 1640培养基500ml，加入55ml fbs，混匀标记后置于2-8℃冰箱中保存备用；
8.b:gm-csf溶液准备,用完全培养基将gm-csf稀释至20ng/ml，得10x溶液待用；
9.c：ngf溶液准备，用完全培养基将ngf稀释至5μg/ml，待用；
10.s2：实验操作；
11.s3：结果报告，根据数据拟合结果，报告供试品对参比品的细胞增殖抑制活性百分比，结果保留整数，根据质量标准判断供试品是否合格。
12.进一步地，s2实验操作，具体包括以下子步骤：
13.d、检测用细胞准备，将tf-1细胞从培养箱中取出，用电动移液器将轻微吹打混匀，取适量细胞进行离心；离心后的细胞小心弃去上清，用pbs重悬洗涤3次，并用完全培养基重悬计数，调整细胞密度为1.5
×
104cells/well/60μl至96孔板；
14.e、anti-ngf药物稀释；
15.f、抗体加入；
16.g、ngf稀释及加入；
17.h、cck8加入及孵育；
18.i、数据采集，打开酶标仪待仪器自检结束后，设定测定波长为450nm，将细胞培养板放入酶标仪中进行读数。
19.进一步地，s2步骤的e子步骤的具体操作如下：用多道移液器将完全培养基加入96孔样品稀释板对应孔中，anti-ngf药物初始浓度5μg/ml加入1号ep管90μl得450ng/ml，混匀后从1号ep管开始依次每管取500μl梯度稀释至9号ep管,10号ep管不作稀释梯度，作为空白对照。
20.进一步地，s2步骤的f子步骤的具体操作如下：用12道移液器将样品稀释板中的样品加入细胞培养板中，终起始浓度90ng/ml，每个样品做6个复孔，每孔20μl，37℃，5％co2培养箱中孵育30min后可加ngf。
21.进一步地，s2步骤的g子步骤的具体操作如下：原始浓度5μg/ml，稀释至25ng/ml(5x稀释液)，每孔20μl加至已加入抗体的96孔板中，终起始浓度5ng/ml，37℃，5％co2培养箱中孵育72h。
22.进一步地，s2步骤的h子步骤的具体操作如下：
23.h1、从2-8℃冰箱取出cck8溶液，室温放置，与pbs按体积比1:1混合适量，将其温度恢复至室温；
24.h2、用多道移液器将cck8加入细胞培养板中，每孔20μl，振荡混匀，将细胞培养板置于37℃、5％co2培养箱中，孵育4h。
25.本方案的工作原理和效果如下：
26.本发明通过确立anti-ngf药物细胞增殖抑制活性检验标准操作规程，规范anti-ngf药物细胞增殖抑制活性检验的操作步骤，保证anti-ngf药物细胞增殖抑制活性检验的准确性。适用于检定anti-ngf药物的细胞增殖抑制活性。
附图说明
27.图1为本发明anti-ngf药物细胞增殖抑制活性检定方法实施例1的流程图。
28.图2是本实施1完全培养基布局示意图，图中bl为完全培养基，ds为anti-ngf药物；
29.图3是本实施例1抗体加入对应96孔板布局示意图；图中bl为完全培养基，ds为anti-ngf药物；
30.图4是本实施例1ngf加入对应96孔板布局示意图；图中bl为完全培养基；
31.图5是本实施例1cck8加入对应96孔板布局示意图。
具体实施方式
32.下面将结合本发明实施例中的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后
……
)仅用于解释某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
34.另外，在本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可
以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围内。
35.实施例1
36.如图1所示，一种anti-ngf药物细胞增殖抑制活性检定方法，包括以下步骤
37.s1：试剂配制，s1：试剂配制，还包括以下子步骤：
38.a:完全培养基，取一瓶rpmi 1640培养基500ml，加入55ml fbs，混匀标记后置于2-8℃冰箱中保存备用(10％fbs+rpmi 1640)；
39.b:gm-csf溶液准备,用完全培养基将gm-csf稀释至20ng/ml，得10x溶液待用，使用前稀释；
40.c：ngf溶液准备，用完全培养基将ngf稀释至5μg/ml，待用，使用前新鲜配置；
41.s2：实验操作；
42.s3：结果报告，根据数据拟合结果，报告供试品对参比品的细胞增殖抑制活性百分比，结果保留整数，根据质量标准判断供试品是否合格；
43.s2：实验操作；具体包括以下子步骤：
44.d、检测用细胞准备，将tf-1细胞从培养箱中取出，用电动移液器将轻微吹打混匀，取适量细胞进行离心；离心后的细胞小心弃去上清，用pbs重悬洗涤3次，并用完全培养基重悬计数，调整细胞密度为1.5
×
104cells/well/60μl至96孔板；
45.e、anti-ngf药物稀释，如图2所示，用多道移液器将完全培养基加入96孔样品稀释板对应孔中，anti-ngf药物初始浓度5μg/ml加入1号ep管90μl得450ng/ml，混匀后从1号ep管开始依次每管取500μl梯度稀释至9号ep管,10号ep管不作稀释梯度，作为空白对照。
46.f、抗体加入；如图3所示，用12道移液器将样品稀释板中的样品加入细胞培养板中，终起始浓度90ng/ml，每个样品做6个复孔，每孔20μl，37℃，5％co2培养箱中孵育30min后可加ngf。
47.g、ngf稀释及加入，如图4所示，原始浓度5μg/ml，稀释至25ng/ml(5x稀释液)，每孔20μl加至已加入抗体的96孔板中，终起始浓度5ng/ml，37℃，5％co2培养箱中孵育72h。
48.h、cck8加入及孵育；
49.该步骤具体操作如下：
50.h1、从2-8℃冰箱取出cck8溶液，室温放置，与pbs按体积比1:1混合适量，将其温度恢复至室温；
51.h2、如图5所示，用多道移液器将cck8加入细胞培养板中，每孔20μl，振荡混匀，将细胞培养板置于37℃，5％co2培养箱中，孵育4h。
52.i、数据采集，打开酶标仪待仪器自检结束后，设定测定波长为450nm，将细胞培养板放入酶标仪中进行读数。
53.s3：结果报告，根据数据拟合结果，报告供试品对参比品的细胞增殖抑制活性百分比，结果保留整数，根据质量标准判断供试品是否合格。
54.本发明适用于检定anti-ngf药物的细胞增殖抑制活性。通过确立anti-ngf药物细胞增殖抑制活性检验标准操作规程，规范anti-ngf药物细胞增殖抑制活性检验的操作步骤，保证anti-ngf药物细胞增殖抑制活性检验的准确性。
55.最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。