融合基因、融合蛋白及制备方法和牛支原体亚单位疫苗与流程

1.本技术涉及亚单位疫苗技术领域，具体涉及一种融合基因、融合蛋白及制备方法和牛支原体亚单位疫苗。


背景技术：

2.牛支原体(mycoplasma bovis，m.bovis)是一种针对牛的致病性病原体，其属于原核生物界、厚壁菌门、柔膜体纲、支原体目、支原体科、支原体属，大小介于细菌和病毒之间，菌体结构简单，不存在细胞壁。当牛支原体感染牛之后，受感染牛在发病初期会出现体温升高、精神沉郁、气喘、流清亮或脓性鼻汁等症状，随后会出现腹泻、体型消瘦、被毛粗乱等症状，并且能够引发牛肺炎、乳房炎、关节炎、中耳炎等牛支原体相关疾病(mycoplasma bovis
‑
associated disease，mbad)。
3.牛支原体的传播途径较广，可以通过呼吸道传播、体液传播(如乳汁、生殖道分泌物等)或垂直传播(vertical transmission)等途径传播，因此，健康牛群容易受到牛支原体的感染，尤其是奶牛和肉牛对其高度易感，需要及时治疗病牛，以防止传染范围扩大。
4.目前牛支原体的治疗主要采用抗生素和全细胞疫苗治疗。然而，因为牛支原体没有细胞壁，对针对细胞壁起作用的抗生素不敏感，并且容易对其产生耐药性。全细胞疫苗包括灭活疫苗和部分致弱的活疫苗。全细胞疫苗需要对牛支原体进行菌体培养，培养的成本高，而且牛支原体菌体的抗原容易随着培养条件改变而变化，导致抗原产生差异，使得全细胞疫苗的生产不稳定，故全细胞疫苗的保护力有局限性，保护时间短、副作用大，以及存在毒力返祖的可能性。


技术实现要素：

5.本技术提供一种融合基因、融合蛋白及制备方法和牛支原体亚单位疫苗，其并非抗生素疫苗和全细胞疫苗，能够改善抗生素疫苗和全细胞疫苗的缺点，对牛支原体的治疗具有高度特异性和敏感性。
6.为了克服上述缺点，本技术采用了以下技术方案：
7.本技术提供了一种融合基因，该融合基因的核苷酸序列选自以下序列中的任意一种：
8.(1)、第一序列，其核苷酸序列如seq id no：1所示；
9.(2)、第二序列，其核苷酸序列与如seq id no：1所示的第一序列至少具有95％的相似度。
10.在一些实施例中，第二序列相对于第一序列而言存在一个或多个核苷酸的替换、删除或插入。
11.本技术提供了一种质粒载体(puc
‑
m.bovis
‑
fu质粒载体)，该质粒载体包括：puc质粒；以及插入该puc质粒中的融合基因。
12.其中，上述的puc质粒选自puc17质粒、puc18质粒和puc19质粒中的任意一种。
13.本技术提供了一种转移载体(pf
‑
m.bovis
‑
fu转移载体)，该转移载体包括：杆状病毒转移质粒；以及插入该杆状病毒转移质粒中的融合基因。
14.其中，杆状病毒转移质粒选自pfastbac 1、pvl1393、pfastbac dual中的任意一种。
15.本技术提供了一种重组质粒(bacmid
‑
m.bovis
‑
fu重组质粒)，该重组质粒包括：杆状病毒载体bacmid；以及插入该杆状病毒载体bacmid中的融合基因。
16.本技术提供了一种受转染细胞，该受转染细胞由重组质粒在转染体系的作用下转染宿主细胞而形成。宿主细胞可以选自sf9细胞、high five细胞或sf21细胞中的任意一种。
17.本技术提供了一种融合蛋白，其由受转染细胞表达融合基因而形成；融合基因的核苷酸序列选自以下序列中的任意一种：
18.(1)、第一序列，其核苷酸序列如seq id no：1所示；
19.(2)、第二序列，其核苷酸序列与如seq id no：1所示的第一序列至少具有95％的相似度。
20.本技术提供了一种融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列选自以下序列中的任意一种：
21.(1)、第三序列，其氨基酸序列如seq id no：2所示；
22.(2)、第四序列，其氨基酸序列与如seq id no：2所示的第三序列至少具有95％的相似度。
23.本技术提供了一种融合蛋白的制备方法，其包括如下步骤：
24.(1)、制备融合基因；融合基因的核苷酸序列选自第一序列或第二序列，第一序列的核苷酸序列如seq id no：1所示，第二序列的核苷酸序列与如seq id no：1所示的第一序列至少具有95％的相似度；
25.(2)、将融合基因克隆入杆状病毒转移质粒中，得到转移载体(pf
‑
m.bovis
‑
fu转移载体)；
26.(3)、采用转移载体转化dh10bac菌株，筛选出重组菌株，抽提出含有融合基因的重组质粒(bacmid
‑
m.bovis
‑
fu重组质粒)，并转染宿主细胞，获得含有重组杆状病毒基因(rbac
‑
m.bovis
‑
fu)的受转染细胞；该重组杆状病毒基因中含有上述的融合基因；
27.(4)、收集受转染细胞的细胞培养物，提纯后得到融合蛋白。
28.本技术提供了上述的融合蛋白在制备牛支原体的抗体中的应用。
29.本技术提供了一种亚单位疫苗，其含有上述的融合蛋白和医药学上可接受的佐剂。
30.其中，融合蛋白在亚单位疫苗中的浓度可以为100
±
10μg/ml。
31.佐剂可以选自montanide isa 206 vg、montanide isa 201 vg、montanide isa 51 vg、液体石蜡、角鲨烷、皂苷、植物油、细胞因子中的任意一种或者两种以上的组合。
32.由于采用了上述技术方案，本技术取得了如下的技术效果：
33.首先，本技术采用截短的gk和截短的gpdh的直接串联来得到融合基因，并且对该融合基因进行表达以得到融合蛋白。经过试验检测可知，本技术的融合蛋白的抗原性、免疫原性比天然蛋白质高，表达水平也比天然蛋白质高，免疫原性更强，对动物安全性高。
34.另外，本发明的融合蛋白能够使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，能够
实现大规模批量生产，批次间稳定，质控容易，也能大大降低疫苗的生产成本，不会出现毒力返祖的现象。
附图说明
35.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
36.图1为puc
‑
m.bovis
‑
fu质粒载体的pcr扩增产物的凝胶电泳图。
37.图2为经lb液体培养基培养后的菌落pcr的凝胶电泳图。
38.图3为pf
‑
m.bovis
‑
fu转移载体的序列组成的示意图。
39.图4为各个细胞培养物的sds
‑
page蛋白条带图。
40.图5为图4的sds
‑
page产物的western blot检测结果图。
具体实施方式
41.下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
42.以下分别对本技术进行详细说明。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。
43.下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
44.除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本技术中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本技术的内容。
45.除非另有说明，文中涉及的试剂与材料均可商购获得，或本领域技术人员可依据公知常识自行制备。
46.[融合基因]
[0047]
本技术提供了一种融合基因，简称为m.bovis
‑
fu基因。fu的含义为融合(fusion)。该融合基因能够表达为用于制备牛支原体亚单位疫苗的融合蛋白。该融合基因的核苷酸序列可以选自以下序列中的任意一种：
[0048]
(1)、第一序列，其核苷酸序列如seq id no：1所示；
[0049]
(2)、第二序列，其核苷酸序列与如seq id no：1所示的第一序列至少具有95％的相似度。
[0050]
其中，第一序列共有1293个核苷酸，其除了由牛支原体的细胞膜表面的甘油激酶(glycerol kinase，gk)基因和甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶(glycerol
‑3‑
phosphate dehydrogenase，gpdh)基因的截短序列串联拼接而成之外，还含有终止密码子。上述两种基
因的截短序列直接相连，而并非通过核苷酸连接片段(如起到连接作用的核苷酸序列)相连，这样在保证表达后的融合蛋白具有双重酶学活性和稳定性，既具有甘油激酶和甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶的双重活性，又不会因为被未知酶酶切成两个单体酶而影响到抗原活性。
[0051]
牛支原体的甘油激酶(gk)基因的全长序列有1506个核苷酸，其全长序列如seq id no：3所示，截短序列为全长序列的第619个核苷酸到第1371个核苷酸。该截短序列为甘油激酶的保守序列。
[0052]
牛支原体的甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶(gpdh)基因的全长序列有996个核苷酸，其全长序列如seq id no：4所示，截短序列为全长序列的第208个核苷酸到第744个核苷酸。该截短序列为甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶的保守序列。
[0053]
上述两种基因的保守序列在不同的牛支原体菌株中具有序列稳定性，通过串联拼接形成融合基因后，该融合基因表达形成的融合蛋白能够实现稳定的免疫活性，故可以用于制备牛支原体亚单位疫苗。如果采用两种基因的全长序列来生产亚单位疫苗，则表达而成的融合蛋白容易形成多聚体，会部分或全部掩盖酶的活性中心，故其免疫活性比由保守序列形成的融合蛋白低，难以发挥出牛支原体亚单位疫苗的全部活性。
[0054]
另外，采用上述两种基因的保守序列形成的融合基因的蛋白表达量比由两种基因的全长序列形成的融合基因的蛋白表达量要高，在制备成亚单位疫苗后具有更好的免疫活性。
[0055]
除了采用两种基因的截短后的原始核苷酸序列制成具有第一序列的融合基因之外，还可以采用与第一序列至少具有95％的相似度的第二序列来制备融合基因。第二序列与第一序列也可以至少具有96％的相似度，还可以至少具有97％的相似度，也可以至少具有98％的相似度，或者至少具有99％的相似度。相似度被定义为第二序列中与第一序列相同的核苷酸数目与第一序列的总的核苷酸数目之比。第二序列相对于第一序列而言存在一个或多个核苷酸的替换、删除或插入，替换、删除或插入的核苷酸的数目应保证第二序列与第一序列至少具有95％的相似度。如果相似度太低，则第二序列所形成的融合蛋白的免疫活性不佳。替换可以采用鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)、腺嘌呤(a)两两相互替换的方式。例如，将某一位点的胸腺嘧啶(t)替换成鸟嘌呤(g)，其余同理。
[0056]
[含有融合基因的载体]
[0057]
本技术提供了一系列含有上述的融合基因的载体，这些载体各自具有各自的功能，详述如下：
[0058]
1、puc
‑
m.bovis
‑
fu质粒载体：
[0059]
puc
‑
m.bovis
‑
fu质粒载体包括上述的融合基因(m.bovis
‑
fu基因)和puc17载体。该puc
‑
m.bovis
‑
fu质粒载体用于对融合基因进行pcr扩增。扩增采用的上游引物m.bovis
‑
fu
‑
f的核苷酸序列如seq id no：5所示，具体为5
’‑
ataggatccatgccgcgcagcattctgccggaaattaaa
‑3’
；下游引物m.bovis
‑
fu
‑
r的核苷酸序列如seq id no：6所示，具体为5
’‑
ataaagcttttagccaatcgcgctcagttccagcgg
‑3’
。
[0060]
puc
‑
m.bovis
‑
fu质粒载体的构建方法包括：将m.bovis
‑
fu基因按照分子克隆的方法克隆入puc17载体中。
[0061]
2、pf
‑
m.bovis
‑
fu转移载体
[0062]
pf
‑
m.bovis
‑
fu转移载体包括融合基因(m.bovis
‑
fu基因)和pfastbac 1质粒。该
pf
‑
m.bovis
‑
fu转移载体用于将融合基因转移到dh10bac感受态细胞中。
[0063]
pf
‑
m.bovis
‑
fu转移载体的构建方法包括：将pfastbac 1质粒和m.bovis
‑
fu基因分别使用bamhⅰ酶、hindⅲ酶于37℃进行双酶切，然后将pfastbac 1质粒的酶切产物和m.bovis
‑
fu基因的酶切产物使用t4 dna连接酶连接，采用dh5α感受态细胞进行转化和扩增，筛选后得到正确的pf
‑
m.bovis
‑
fu转移载体。
[0064]
3、bacmid
‑
m.bovis
‑
fu重组质粒
[0065]
bacmid
‑
m.bovis
‑
fu重组质粒包括融合基因(m.bovis
‑
fu基因)和杆状病毒质粒(baculovirus plasmid，简称bacmid)。杆状病毒质粒是一种带有杆状病毒基因组的质粒，可在细菌和昆虫细胞之间穿梭，因此，bacmid
‑
m.bovis
‑
fu重组质粒又可称之为bacmid
‑
m.bovis
‑
fu穿梭质粒。
[0066]
bacmid
‑
m.bovis
‑
fu重组质粒的构建方法包括：将pf
‑
m.bovis
‑
fu转移载体加入到dh10bac感受态细胞中进行转化，从转化物中筛选得到bacmid
‑
m.bovis
‑
fu重组质粒。
[0067]
在上述方法中，dh10bac感受态细胞中含有杆状病毒质粒(bacmid)和辅助质粒(the helper plasmid)。当pf
‑
m.bovis
‑
fu转移载体(含有融合基因)进入dh10bac感受态细胞中后，在辅助质粒的作用下，杆状病毒质粒(bacmid)与pf
‑
m.bovis
‑
fu转移载体发生重组，产生bacmid
‑
m.bovis
‑
fu重组质粒，即上述的转化过程。
[0068]
在上述方法中，筛选可以通过挑选单克隆的方法进行，具体包括：
[0069]
(1)、将含有bacmid
‑
m.bovis
‑
fu重组质粒的dh10bac菌液涂布到含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、5
‑
溴
‑4‑
氯
‑3‑
吲哚
‑
β
‑
d
‑
半乳糖苷(又称x
‑
gal)以及异丙基
‑
β
‑
d
‑
硫代半乳糖苷(又称iptg)的lb固体培养基上培养；
[0070]
(2)、再挑选阳性的白色菌落，继续于含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、5
‑
溴
‑4‑
氯
‑3‑
吲哚
‑
β
‑
d
‑
半乳糖苷(又称x
‑
gal)以及异丙基
‑
β
‑
d
‑
硫代半乳糖苷(又称iptg)的lb固体培养基上划线培养；
[0071]
(3)、然后挑选阳性的单菌落，接种于含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、5
‑
溴
‑4‑
氯
‑3‑
吲哚
‑
β
‑
d
‑
半乳糖苷(又称x
‑
gal)以及异丙基
‑
β
‑
d
‑
硫代半乳糖苷(又称iptg)的lb液体培养基上培养；
[0072]
(4)、最后抽提出培养液中的bacmid
‑
m.bovis
‑
fu重组质粒。
[0073]
[含有融合基因的细胞、重组杆状病毒基因及融合蛋白]
[0074]
本技术提供了一种含有融合基因的细胞、含有该融合基因的重组杆状病毒基因以及由该细胞表达融合基因而形成的融合蛋白。
[0075]
其中，上述的含有融合基因的细胞由bacmid
‑
m.bovis
‑
fu重组质粒在转染体系的作用下转染宿主细胞而得到。
[0076]
转染体系包括cellfectin转染试剂等。宿主细胞包括sf9细胞、high five细胞或sf21细胞。sf9细胞又称草地贪夜蛾细胞(spodoptera frugiperda cell)，属于昆虫细胞，能够用来产生重组杆状病毒基因rbac
‑
m.bovis
‑
fu。r表示重组(recombinant)，bac是bacmid的简称，m.bovis
‑
fu代表本技术的融合基因。
[0077]
bacmid
‑
m.bovis
‑
fu重组质粒能够在细菌和昆虫细胞之间穿梭，当进入昆虫细胞sf9中后，能够进行重组以产生重组杆状病毒基因rbac
‑
m.bovis
‑
fu。该重组杆状病毒基因rbac
‑
m.bovis
‑
fu含有杆状病毒重组体基因和融合基因(m.bovis
‑
fu)。
[0078]
上述含有融合基因的细胞能够对融合基因进行表达，以形成融合蛋白。当融合蛋白对应的融合基因的核苷酸序列为第一序列时，重组杆状病毒基因rbac
‑
m.bovis
‑
fu表达而成的融合蛋白的理论分子量为47kda。如果融合蛋白对应的融合基因的核苷酸序列为第二序列，则重组杆状病毒基因rbac
‑
m.bovis
‑
fu表达而成的融合蛋白的理论分子量根据第二序列的不同而进行换算。
[0079]
融合蛋白能够用于制备牛支原体亚单位疫苗。该融合蛋白的氨基酸序列可以选自以下序列中的任意一种：
[0080]
(1)、第三序列，其氨基酸序列如seq id no：2所示；
[0081]
(2)、第四序列，其氨基酸序列与如seq id no：2所示的第三序列至少具有95％的相似度。
[0082]
其中，第三序列由牛支原体的细胞膜表面的甘油激酶的截短的氨基酸序列和甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶的截短的氨基酸序列串联而成。两段氨基酸序列直接相连，而并非通过氨基酸连接片段(如起到连接作用的氨基酸序列)相连。因为该融合蛋白由具有甘油激酶活性的第一段氨基酸序列和具有甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶活性的第二段氨基酸序列直接串联而成，而甘油激酶和甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶为牛支原体利用甘油作为碳源以产生能量的关键酶，故两种酶活性的氨基酸序列的直接相连使得两种酶的活性中心位置较近，与全细胞疫苗相比具有更强的免疫活性和更佳的稳定性。
[0083]
该融合蛋白可以由第一序列表达而成，也可以由第二序列表达而成，还可以先表达第一序列或第二序列，然后采用蛋白质工程对表达出来的序列进行氨基酸的替换、插入、截短或延长等加工。但应该保证加工后的氨基酸序列与初始表达而成的氨基酸序列具有至少具有95％的相似度。
[0084]
另外，除了采用两种酶的原始氨基酸序列制成具有第三序列的融合蛋白之外，还可以采用与第三序列至少具有95％的相似度的第四序列来制备融合蛋白。第四序列与第三序列也可以至少具有96％的相似度，还可以至少具有97％的相似度，也可以至少具有98％的相似度，或者至少具有99％的相似度。相似度被定义为第四序列中与第三序列相同的氨基酸数目与第三序列的总的氨基酸数目之比。第四序列相对于第三序列而言存在一个或多个氨基酸的替换、删除或插入，替换、删除或插入的核苷酸的数目应保证第四序列与第三序列至少具有95％的相似度。如果相似度太低，则第四序列所表征的融合蛋白的免疫活性不佳，难以制成具有所需免疫活性的亚单位疫苗。替换或插入需要确保同性氨基酸的替换或插入，而不能采用异性氨基酸的替换或插入，否则会影响酶的活性中心，进而会影响免疫活性。
[0085]
示例性地，酸性氨基酸之间可以相互替换，碱性氨基酸之间也可以相互替换，中性氨基酸之间可以相互替换，但是不能将酸性氨基酸与碱性氨基酸相互替代，以免影响酶的催化功能。再例如，插入位点附近的氨基酸为酸性氨基酸，那么插入位点的氨基酸也应该为与之同性的氨基酸，即酸性氨基酸。碱性氨基酸或中性氨基酸的插入同理。
[0086]
牛支原体亚单位疫苗是提取牛支原体的致病免疫原的关键蛋白质组分而制成的疫苗，与致病免疫原的全蛋白相比，关键蛋白质组分具有更稳定的氨基酸序列，具有更强和特异性更好的免疫活性。牛支原体亚单位疫苗不含核酸，当注入宿主体内后，能够诱发宿主产生体液免疫，使宿主体内产生的抗体的数量比全细胞疫苗更多，抗体的特异性也比全细
胞疫苗更强。关键蛋白质组分包括牛支原体的甘油激酶和甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶。牛支原体的甘油激酶的全长氨基酸序列如seq id no：7所示，甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶的全长氨基酸序列如seq id no：8所示。与上述两段序列相比，本技术的第三序列由牛支原体的细胞膜表面的甘油激酶的截短的氨基酸序列和甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶的截短的氨基酸序列串联而成。
[0087]
发明人在研究中发现，牛支原体感染健康牛的机理与牛支原体利用碳源进行碳代谢的途径密切相关。动物体内脂质代谢会产生甘油，甘油是牛支原体的主要碳源。不同种类的牛支原体的细胞膜表面均存在特异性的甘油激酶和甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶。甘油激酶能够催化甘油产生3
‑
磷酸甘油(又称甘油
‑3‑
磷酸)，甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶在辅酶i(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的参与下能够催化3
‑
磷酸甘油，并产生二羟丙酮磷酸(dihydroxacetone phosphate，dhap)和还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，nadh)。还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在糖酵解途径中能够还原二羟基丙酮磷酸，并释放能量以供atp合成，从而为牛支原体的代谢提供能量和代谢所需物质。由于甘油激酶和甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶特异性地存在于牛支原体的细胞膜上，释放的能量能够促进牛支原体细胞膜表面的其它功能蛋白与宿主细胞(如牛的呼吸道粘膜细胞、生殖道粘膜细胞等)相结合，因此，甘油激酶和甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶与牛支原体和宿主细胞的黏附作用有关，并且具有一定特异性和灵敏度的免疫原性，能够被用作制备牛支原体亚单位疫苗。
[0088]
本技术的牛支原体亚单位疫苗接种入牛等动物体内之后，能使牛等动物产生体液免疫，即在体液中产生抗甘油激酶和甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶的抗体。当牛支原体活体进入牛体内后，牛体液中的抗体会与牛支原体表面的甘油激酶和甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶相结合，使牛支原体无法利用甘油作为碳源来产生能量，也就无法对牛的细胞起到很好的黏附作用，导致牛支原体在动物体内无法存活，使得动物不会受到牛支原体的感染，从而起到疫苗作用。
[0089]
[亚单位疫苗]
[0090]
本技术提供了一种亚单位疫苗，其含有上述的融合蛋白和佐剂。
[0091]
其中，融合蛋白在亚单位疫苗中的浓度为100
±
10μg/ml。
[0092]
佐剂的种类包括montanide isa 206 vg、montanide isa 201 vg、montanide isa 51 vg、液体石蜡、角鲨烷、皂苷、植物油、细胞因子等一种或者两种以上的组合，优选为montanide isa 206 vg。亚单位疫苗(subunit vaccine)与本技术的上述佐剂配合使用后，免疫原性得到很大的提高。
[0093]
本技术采用杆状病毒昆虫细胞表达系统表达牛支原体m.bovis
‑
fu融合蛋白，并且通过该融合蛋白制备基因工程亚单位疫苗(subunit vaccine)。本技术的亚单位疫苗通过同时抑制牛支原体细胞膜表面的gpdh和gk的酶活性来阻断牛支原体的甘油代谢途径，从而影响牛支原体在动物体内的致病性。经各种试验检测可知，本技术的亚单位疫苗能够在动物体内产生较强的体液免疫，免疫后的动物能够抵御强毒攻毒，并且能够用生物反应器进行放大生产，大大降低疫苗的生产成本。
[0094]
以下结合实施例对本技术作进一步的说明。
[0095]
实施例一构建pf
‑
m.bovis
‑
fu转移载体
[0096]
本实施例提供了一种pf
‑
m.bovis
‑
fu转移载体的构建方法，其包括如下步骤：
[0097]
1、构建puc
‑
m.bovis
‑
fu质粒载体，利用该puc
‑
m.bovis
‑
fu质粒载体对m.bovis
‑
fu融合基因进行扩增与纯化，得到纯化后的m.bovis
‑
fu融合基因；具体包括：
[0098]
(1
‑
1)、在南京金斯瑞生物科技有限公司合成了m.bovis
‑
fu融合基因(序列如seq id no:1所示)并克隆到puc17载体上，得到puc
‑
m.bovis
‑
fu质粒载体。
[0099]
(1
‑
2)、以puc
‑
m.bovis
‑
fu质粒作为模板，利用m.bovis
‑
fu
‑
f作为上游引物，利用m.bovis
‑
fu
‑
r作为下游引物，进行pcr扩增。m.bovis
‑
fu
‑
f基因序列如seq id no:5所示，m.bovis
‑
fu
‑
r的基因序列如seq id no:6所示。pcr的扩增体系见表1。
[0100]
表1 m.bovis
‑
fu基因的pcr扩增体系
[0101][0102]
扩增条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。
[0103]
为了验证扩增后得到的目的基因是否为m.bovis
‑
fu融合基因，对扩增所得的pcr产物进行凝胶电泳。如图1所示，凝胶电泳图谱共有3个泳道，第1泳道为目的基因所在泳道，第2泳道为空白对照泳道，第3泳道(m泳道)为标准物(marker)的泳道。第1泳道在1.3kbp的位置出现目的条带，该分子量对应m.bovis
‑
fu融合基因的理论分子量，说明目的基因扩增成功。
[0104]
(1
‑
3)、用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化，得到纯化后的m.bovis
‑
fu融合基因。
[0105]
2.将pfastbac 1质粒和m.bovis
‑
fu基因分别使用bamhⅰ酶、hindⅲ酶进行双酶切，然后将pfastbac 1质粒的酶切产物和m.bovis
‑
fu基因的酶切产物使用t4 dna连接酶连接，采用dh5α感受态细胞进行转化和扩增，筛选出具有正确序列的pf
‑
m.bovis
‑
fu转移载体。具体包括：
[0106]
(2
‑
1)、将pfastbac 1质粒采用表2的酶切反应体系进行酶切，将m.bovis
‑
fu基因的pcr扩增产物(即步骤1所得的纯化后的m.bovis
‑
fu融合基因)采用表2的酶切反应体系进行酶切。每种酶切反应体系均使用bamhⅰ、hindⅲ37℃双酶切3小时。
[0107]
表2 pfastbac 1质粒酶切反应体系
[0108][0109]
表3m.bovis
‑
fu基因酶切反应体系
[0110][0111]
(2
‑
2)、分别对上述两种酶切产物进行凝胶电泳，并且分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化回收酶切过的pfastbac 1质粒以及酶切过的m.bovis
‑
fu基因片段。
[0112]
(2
‑
3)、将酶切过的pfastbac 1质粒和酶切过的m.bovis
‑
fu基因片段(又称m.bovis
‑
fu基因酶切产物)使用t4 dna连接酶16℃水浴连接过夜。连接体系见表4。
[0113]
表4 m.bovis
‑
fu基因与pfastbac 1质粒连接体系
[0114][0115]
(2
‑
4)、取10μl由步骤(2
‑
3)所得的连接产物，加入到100μl的dh5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μl不含amp的lb培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液离心浓缩成100μl涂布于含有amp的lb固体培养基上，37℃培养16小时。
[0116]
(2
‑
5)、挑取平板lb固体培养基上的单菌落分别接种lb液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，以m.bovis
‑
fu
‑
f和m.bovis
‑
fu
‑
r作为引物进行菌落pcr。将菌落pcr产物进行凝胶电泳，以验证目的基因大小。如图2所示，凝胶电泳图谱共有8个泳道，第1泳道至第6泳道对应挑取的6个菌落(即6个平行样)的菌落pcr产物，均在1.3kbp附近出现条带，说明这6个样品为阳性样品。第7泳道为空白对照泳道，第8泳道(m泳道)为标准物(marker)的泳道，用于展示其余泳道是否存在对应分子量的物质。
[0117]
(2
‑
6)、将菌落pcr鉴定结果呈阳性的菌液(即在1.3kbp附近出现条带的样品所对应的菌液)送测序公司测序，选择测序正确样品所对应的菌液进行保存。测序正确的菌液含有具有目的基因(m.bovis
‑
fu融合基因)的pf
‑
m.bovis
‑
fu转移载体，其序列组成的示意图如图3所示。
[0118]
实施例二构建bacmid
‑
m.bovis
‑
fu重组质粒(含有杆状病毒基因组)
[0119]
本实施例提供了一种bacmid
‑
m.bovis
‑
fu重组质粒，其构建方法包括：
[0120]
1、将pf
‑
m.bovis
‑
fu转移载体加入到dh10bac感受态细胞中进行转化，得到转化物；具体包括：
[0121]
取实施例1中的1μl pf
‑
m.bovis
‑
fu质粒加入100μl的dh10bac感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl不含amp的lb液体培养基，37℃培养5小时。取100μl菌液稀释81倍后，取100μl稀释的菌液涂布到含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、x
‑
gal以及iptg的lb固体培养基上，37℃培养48小时，得到转化物。
[0122]
2、从转化物中筛选得到bacmid
‑
m.bovis
‑
fu重组质粒，具体包括：
[0123]
使用接种针挑取面积大的白色菌落，然后在含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、x
‑
gal以及iptg的lb固体培养基上划线，37℃培养48小时，然后挑取单菌落(单克隆)接种于含有庆大霉素、卡那霉素、四环素的lb液体培养基培养，保存菌种，抽提质粒，获得bacmid
‑
m.bovis
‑
fu重组质粒。
[0124]
实施例三获得重组杆状病毒基因
[0125]
本实施例提供了一种重组杆状病毒基因的获得方法，其包括如下步骤：
[0126]
1、在六孔板中每个孔均接种0.8
×
106个sf9细胞，sf9细胞的汇合度为50
‑
70％。对于每一个孔制备以下的复合物：用100μl转染培养基t1稀释4μl的cellfectin转染试剂，短暂地漩涡震荡；用100μl转染培养基t1稀释3μg实施例二所得的重组bacmid
‑
m.bovis
‑
fu质粒，将稀释的转染试剂和bacmid
‑
m.bovis
‑
fu质粒混合，轻轻吹匀，制备转染混合物。
[0127]
2、待sf9细胞贴壁后加入上述的转染复合物，27℃孵育5小时，移除上清，添加2mlsf
‑
sfm新鲜培养基，27℃培养4～5日收获上清，获得重组杆状病毒基因rbac
‑
m.bovis
‑
fu。
[0128]
当采用重组杆状病毒基因rbac
‑
m.bovis
‑
fu转染sf9细胞之后，sf9细胞会表达该重组杆状病毒基因rbac
‑
m.bovis
‑
fu，以形成融合蛋白，故受转染的sf9细胞的细胞培养物中含有该融合蛋白。
[0129]
对收获的f1代重组杆状病毒使用间接免疫荧光法检测病毒含量，rbac
‑
m.bovis
‑
fu f1代种毒的病毒含量为1.83
×
108tcid
50
。扩增重组杆状病毒rbac
‑
m.bovis
‑
fu作为种毒备用。
[0130]
另外，按照上述的实施例方法构建表达如下表5所示的对照组的重组杆状病毒。在表5中，seq id no:4所示的序列为gdph的全长核苷酸序列，所表达的蛋白为gdph的全长氨基酸序列。seq id no:3所示的序列为gk的全长核苷酸序列，所表达的蛋白为gk的全长氨基酸序列。gdph的全长氨基酸序列和gk的全长氨基酸序列作为本技术的融合蛋白的对照组。
[0131]
表5对照组设置分组
[0132][0133][0134]
实施例四sds
‑
page检测
[0135]
本实施例提供了一种对受转染的sf9细胞的细胞培养物进行检测的方法，主要目的在于检测受转染细胞的细胞培养物中是否含有目的基因所表达的融合蛋白。
[0136]
本实施例的方法将实施例三中得到的含有重组杆状病毒基因(rbac
‑
m.bovis
‑
fu)的sf9细胞、含有gpdh全长基因的对照组1的sf9细胞、以及含有gk全长基因的对照组2的sf9细胞的细胞培养物进行sds
‑
page检测，同时使用感染空杆状病毒的sf9细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40μl收获的细胞培养物，加入10μl的5
×
loading buffer，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行sds
‑
page凝胶(12％浓度凝胶)电泳，电泳后取凝胶经染
色、脱色后观察目的条带。
[0137]
如图4所示，本实施例的蛋白条带图一共有5个泳道。第1泳道显示的条带在分子量约57kda处出现目的条带，该泳道的样品来自于对照组2的细胞培养物，说明对照组2的细胞培养物中含有gk蛋白(具有全长的氨基酸序列)。第2泳道显示的条带在分子量约37kda处出现目的条带，该泳道的样品来自于对照组1的细胞培养物，说明对照组1的细胞培养物中含有gdph蛋白(具有全长的氨基酸序列)。第3泳道显示的条带在分子量约47kda处出现目的条带，该泳道的样品来自于实验组的细胞培养物，说明rbac
‑
m.bovis
‑
fu实验组的细胞培养物中含有m.bovis
‑
fu融合基因表达的融合蛋白，该融合蛋白由截短的gk蛋白和截短的gdph蛋白串联而成。第4泳道为阴性对照，在37kda处、47kda处和57kda处均未出现目的条带，提示阴性对照组没有表达上述三种蛋白。第5泳道为标记物(marker)泳道，用于展示相关的分子量。上述结果说明融合蛋白在sf9细胞中得到正确表达。
[0138]
实施例五western blot检测
[0139]
本实施例提供了一种对实施例四的sds
‑
page电泳后的产物进行western blot检测的方法，具体包括：将实施例四的sds
‑
page电泳后的产物转印到硝酸纤维素膜(nc膜)上，用5％脱脂奶粉封闭2小时，兔源抗m.bovis阳性血清孵育2小时，漂洗，hrp标记的羊抗兔多克隆抗体作为二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照，得到图5的结果。
[0140]
如图5所示，本实施例的蛋白条带图一共有5个泳道。第1泳道显示的条带在分子量约57kda处出现目的条带，该泳道的样品来自于对照组2的细胞培养物，说明对照组2的细胞培养物中含有gk蛋白(具有全长的氨基酸序列)。第2泳道显示的条带在分子量约37kda处出现目的条带，该泳道的样品来自于对照组1的细胞培养物，说明对照组1的细胞培养物中含有gdph蛋白(具有全长的氨基酸序列)。第3泳道显示的条带在分子量约47kda处出现目的条带，该泳道的样品来自于实验组的细胞培养物，说明rbac
‑
m.bovis
‑
fu实验组的细胞培养物中含有m.bovis
‑
fu融合基因表达的融合蛋白，该融合蛋白由截短的gk蛋白和截短的gdph蛋白串联而成。第4泳道为阴性对照，在37kda处、47kda处和57kda处均未出现目的条带，提示阴性对照组没有表达上述三种蛋白。第5泳道为标记物(marker)泳道，用于展示相关的分子量。
[0141]
上述结果中，重组杆状病毒表达样品都有目的条带，阴性对照没有目的条带，说明目的融合蛋白在sf9细胞中得到正确表达。
[0142]
实施例六昆虫细胞的生物反应器无血清悬浮培养
[0143]
实施例三对受转染的sf9细胞进行实验室小试培养，并通过实施例四和五的实验证明了小试培养结果中含有目标融合蛋白，说明小试结果得到了正确表达的目标融合蛋白。为了进一步扩大目标融合蛋白的表达量，需要采用生物反应器进行放大培养，以便为工业化应用提供条件和参数。
[0144]
本实施例提供了一种对受转染的sf9细胞采用生物反应器进行放大培养的方法，其包括如下步骤：
[0145]
1、在1000ml摇瓶中无菌培养sf9昆虫细胞3
‑
4天，待浓度长到3
‑5×
106cell/ml，活力大于95％时，将sf9昆虫细胞接种到5l的生物反应器中，接种浓度为3
‑8×
105cell/ml。当sf9昆虫细胞浓度达到3
‑
55
×
106cell/ml时，将sf9昆虫细胞接种到50l生物反应器中，待
sf9昆虫细胞长至浓度为3
‑
55
×
106cell/ml，接种到500l生物反应器中，继续进行细胞培养；
[0146]
2、待500l生物反应器sf9昆虫细胞的细胞浓度达到2
‑
85
×
106cell/ml时，接种rbac
‑
m.bovis
‑
fu重组杆状病毒进行转染，生物反应器的培养条件为ph值6.0
‑
6.5、温度为25
‑
27℃、溶氧30
‑
80％、搅拌速度100
‑
180rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的ph6.2、细胞培养阶段温度设定27℃、溶氧50％、搅拌速度100
‑
180rpm。
[0147]
3、在转染之后继续培养5
‑
9天后，加入千分之一终浓度bei，37℃作用48h后，加千分之二终浓度na2s2o3终止灭活。通过离心或中空纤维过滤的方法收获细胞培养上清，置于2
‑
8℃保存上清(即m.bovis
‑
fu蛋白原液)。
[0148]
为了进行验证对比实验，也可以以同样的方法制备表达对照组1和对照组2的蛋白原液。
[0149]
本实施例中，因为生物反应器的体积比较大，其内不同区域的各项实验参数的控制难以达到完全精准的控制，所以上述的实验参数适宜用范围值表示。
[0150]
实施例七蛋白纯化
[0151]
实施例六所得的m.bovis
‑
fu蛋白原液除了含有m.bovis
‑
fu融合蛋白之外，还含有很多杂质，故需要进行提纯。
[0152]
本实施例提供了一种对实施例六所得的m.bovis
‑
fu蛋白原液进行纯化的方法，其包括如下步骤：
[0153]
将实施例六中所得的其中一种m.bovis
‑
fu蛋白原液进行超声破碎，12000r/min离心30分钟，取上清，0.22μm滤膜过滤，去除杂质，使用截留分子量为10kda的超滤管浓缩10倍，得到纯化的目的蛋白。
[0154]
将纯化的目的蛋白使用bca总蛋白定量，然后结合灰度扫描确定目的蛋白纯度，得到m.bovis
‑
fu融合蛋白的浓度为830μg/ml，纯度为98％。这说明采用实施例六的生物反应器进行放大培养成功得到了纯度很高的m.bovis
‑
fu融合蛋白。
[0155]
实施例八亚单位疫苗制备
[0156]
本实施例提供了一种亚单位疫苗的制备方法。其包括如下步骤：
[0157]
将实施例七中所收获的纯化后的m.bovis
‑
fu融合蛋白液体按一定比例稀释后，加入到montanide isa 206 vg佐剂中，使得最终乳化好的疫苗中融合蛋白的浓度为100μg/ml，质检合格后置于4℃保存。
[0158]
为了进行验证对比实验，也可以将对照组1和对照组2的蛋白原液以1:1的比例混合后按上述方法制备成疫苗，该疫苗作为对照a组，置于4℃保存。
[0159]
由此，实验组的疫苗中含有融合蛋白，其是由截短的gk蛋白和截短的gdph蛋白串联而成。而对照a组的疫苗为对照组1和对照组2的蛋白原液等比例混合而成，故对照a组含有两种蛋白，包括具有全长的氨基酸序列的gk蛋白和具有全长的氨基酸序列的gdph蛋白，并且上述两种蛋白之间并非串联，而是单独存在于疫苗中。
[0160]
以下通过各种免疫学实验对本技术的亚单位疫苗的有关性质进行验证。
[0161]
试验例1疫苗安全性试验
[0162]
本试验例的目的在于验证本技术的疫苗的生物体安全性，验证的方法包括如下步骤：
[0163]
选取成年的健康balb/c小鼠10只，每只25g左右。随机分为2组，每组5只。一组为免疫组，每只小鼠腿部肌肉注射1.0ml本发明的牛支原体亚单位疫苗，一组为阴性对照组，每只小鼠以同种方式注射同等剂量的生理盐水。连续7天测量小鼠体温和观察小鼠精神状态。
[0164]
结果显示，所有小鼠均无发热、食欲不振、被毛粗糙、精神萎靡等症状，无死亡情况。证明本发明疫苗符合安全性要求。正如上面提及的那样，如果被牛支原体感染，那么动物会出现体温升高、精神沉郁、气喘、流清亮或脓性鼻汁等症状，这可以作为是否感染牛支原体的症状指标。
[0165]
试验例2抗体水平检测试验
[0166]
本试验例的目的在于使用本技术的疫苗对健康牛进行感染，以检测本技术的疫苗是否能使健康牛产生抗体，从而验证本技术的疫苗的免疫活性。
[0167]
本试验例的检验方法包括如下步骤：
[0168]
取10
‑
15日龄的健康犊牛15头，随机分为3组，每组5头。第1组为免疫组，每只犊牛分别颈部肌肉注射3ml亚单位疫苗(含有融合蛋白)。第2组为对照a组，每只犊牛分别颈部肌肉注射3ml普通疫苗(含有全长的gk蛋白和全长的gdph蛋白的等比例混合物)。第3组为空白对照组，每只犊牛以同种方式注射同等剂量的生理盐水。首次免疫(首免)10天后以相同剂量进行二次免疫(二免)。分别于首免前、首免后10天和二免后14天经颈静脉采血并分离血清，利用牛支原体抗体elisa检测试剂盒进行抗体检测。结果见表6。
[0169]
表6抗体水平检测结果
[0170][0171]
注：待检样品的s/p值≥0.418时，判定为阳性；待检样品的s/p值＜0.418时，判定为阴性。s/p值＝(sample
‑
n)/(positive
‑
n)。
[0172]
从表6中可以看出，在排除了空白对照组的系统误差后，免疫组在首免后和二免后产生的抗体水平均为对照a组的2倍以上，说明本技术的疫苗具有很好的免疫活性，其免疫活性远高于全长的gk蛋白和全长的gdph蛋白的混合物。
[0173]
试验例3补体杀菌试验
[0174]
在试验例2中，当将相关疫苗注入健康牛体内后，会引发健康牛的体液免疫，即在血液中会产生抗体。本试验的目的在于检验牛体内的抗体对支原体的体外灭菌能力。为了增强抗体对牛支原体的杀菌效果，添加了补体。补体为商购产品，来源于中国兽药监察所的冻干补体产品。
[0175]
本试验例的具体方法包括如下步骤：
[0176]
分别取上述各组二免后14天的牛血清、免疫前牛阴性血清，进行补体杀菌试验。同时设置阳性组、补体组和空白组，各组反应体系见表7。反应后将各组溶液进行十倍比稀释，并分别取104、105、106稀释度的悬液100μl涂布于牛支原体固体培养基，每个稀释度涂布3个培养基，培养5
‑
7天后进行菌落计数，试验重复3次。并按照以下公式计算杀菌率：杀菌率(％)＝[|试验组cfu
‑
阴性组cfu|/补体组cfu]
×
100％，具体试验结果见表7。
[0177]
表7补体杀菌试验反应体系及结果
[0178][0179]
本试验例以牛支原体pg45作为测试菌种。实验结果说明如下：
[0180]
空白组在牛支原体悬液中加入pbs液体作为空白对照。
[0181]
补体组在牛支原体悬液中另行加入补体，其培养后的菌落平均值近似等于空白组的菌落平均值，说明补体本身对牛支原体基本起不到杀灭作用。
[0182]
阴性组在牛支原体悬液中加入首免前牛血清。因为首免前血清尚未经过体液免疫，其内不含有抗牛支原体的抗体，因此，对牛支原体基本起不到杀灭作用，使得培养后的菌落平均值近似等于空白组、补体组的菌落平均值。
[0183]
对照a组在牛支原体悬液中加入二免后14天的牛血清。对照a组采用含有全长的gk蛋白和全长的gdph蛋白的等比混合物的疫苗使得健康牛产生体液免疫，其杀菌平均值为46.69％，说明其起到了一定的杀菌作用，但是该疫苗的免疫活性太低，难以商业化应用。
[0184]
本发明免疫组在牛支原体悬液中加入二免后14天的牛血清。免疫组采用含融合蛋白的疫苗使得健康牛产生体液免疫，其杀菌平均值为85.54％，基本达到了阳性组疫苗的杀菌效果。上述实验结果说明：本技术的牛支原体亚单位疫苗在激发健康牛的体液免疫后，能够产生特异性的抗体，故具有很好的免疫活性。
[0185]
试验例4黏附抑制试验
[0186]
牛支原体在进入动物体内后，其细胞膜上的甘油激酶(gk)和甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶(gpdh)利用甘油作为碳源为其黏附到动物细胞表面提供能量。而经过体液免疫后产生的抗体能够特异性结合甘油激酶(gk)和甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶(gpdh)，使其难以利用甘油来提供能量，从而使牛支原体难以黏附到动物细胞的细胞膜上，进而使牛支原体的传染能力降低。本试验例的目的在于研究经体液免疫后的血清对牛支原体的黏附能力的抑制作用，具体包括如下步骤：
[0187]
1、将牛支原体pg45悬液按500moi的感染量加入1.5ml离心管中，加入已经灭活处理过的本发明免疫组的犊牛二免后14天的牛血清，使得血清与总体积之比为1:100，37℃水浴1h。同时设立对照a组、阳性组、阴性组和空白组。
[0188]
2、经离心、洗涤后，用1ml预热无抗无血清dmem重悬，感染已经预处理过的ebl细
胞，37℃作用2h，经无菌pbs洗涤5次后用200μl胰蛋白酶消化。于显微镜下观察，待其消化完全后加入完全营养液终止消化。
[0189]
3、收集细胞，经离心、洗涤后，加入1ml预热的牛支原体培养基，室温静置10min。将各组溶液进行十倍比稀释，并分别取104、105、106稀释度的悬液100μl涂布于牛支原体固体培养基，每个稀释度涂布3个培养基，培养5
‑
7天后进行菌落计数，试验重复3次。并按照以下公式计算黏附抑制率：黏附抑制率(％)＝[|试验组cfu
‑
阴性组cfu|/空白组cfu]
×
100％，试验结果见表8。
[0190]
表8黏附抑制试验结果
[0191][0192][0193]
从表8的结果可知，本发明免疫组对牛支原体的黏附抑制率远远高于对照a组，说明本发明的融合蛋白能够抑制牛支原体的黏附，从而降低其强毒性。
[0194]
以上对本技术进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本技术的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本技术的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本技术的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本技术的限制。