一种机体保护多肽粗品的纯化方法与流程

1.本发明涉及生物分子分离纯化技术领域，尤其涉及一种机体保护多肽粗品的纯化方法。


背景技术：

2.机体保护多肽(bpc
‑
157)为胃液肽的片段，含有15个氨基酸，分子量为1419.5，序列为gly
‑
glu
‑
pro
‑
pro
‑
pro
‑
gly
‑
lys
‑
pro
‑
ala
‑
asp
‑
asp
‑
ala
‑
gly
‑
leu
‑
val。bpc
‑
157能够促进肌肉和韧带的再生，促进创面愈合，提高肌腱的硬度与弹性；对于健美运动员增肌具有重要作用。研究表明，bpc
‑
157在人体器官中有多种保护作用，如胰腺、肝损伤、内皮、心脏损伤和关节，使其成为一种多功能肽，能够给人类带来巨大的益处。公开号为cn 102229649a的中国专利公开了将合成的粗品使用0.1％三氟乙酸
‑
水、0.1％三氟乙酸
‑
乙腈体系进行hplc纯化洗脱冻干，得到bpc
‑
157样品。所得bpc
‑
157样品的纯度低，单杂含量高。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的在于提供了一种机体保护多肽粗品的纯化方法。本发明提供的纯化方法中得到的是机体保护多肽纯度高，单杂含量低。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了一种机体保护多肽粗品的纯化方法，包括以下步骤：
6.将机体保护多肽粗品溶解，得到机体保护多肽粗品溶液；
7.对所述机体保护多肽粗品溶液进行高效液相色谱分离纯化，得到机体保护多肽纯品；
8.所述高效液相色谱分离纯化包括依次进行第一高效液相色谱纯化和第二高效液相色谱纯化；
9.所述第一高效液相色谱纯化的参数包括：
10.第一色谱柱：c
18
柱；
11.第一流动a相：磷酸二氢钠水溶液，所述磷酸二氢钠水溶液的浓度为3～30g/l；
12.第一流动b相：乙腈；
13.第一流速：1～1000ml/min；
14.第一梯度洗脱程序为：
15.0～60min：n1vol％
→
m1vol％第一流动b相；n1为5～10，m1为30～60；
16.第一检测波长：210～260nm；
17.所述第二高效液相色谱纯化的参数包括：
18.第二流动a相：乙酸水溶液，所述乙酸水溶液中乙酸和水的体积比为(0.1～5)：100；
19.第二流动b相：乙腈；
20.第二流速：1～1000ml/min；
21.第二梯度洗脱程序为：
22.0～60min：n2vol％
→
m2vol％第二流动b相；n2为5～10，m2为30～60；
23.第二检测波长：210～260nm。
24.优选地，所述机体保护多肽粗品溶解的溶剂为乙酸水溶液；所述乙酸水溶液中乙酸的体积百分含量为5％～15％。
25.优选地，所述机体保护多肽粗品溶液中机体保护肽的浓度为10～100mg/ml。
26.优选地，所述第一高效液相色谱纯化得到第一纯化机体保护多肽；将所述第一纯化机体保护多肽进行第二高效液相色谱纯化。
27.优选地，所述第一检测波长和第二检测波长独立地为220～250nm。
28.优选地，所述第一色谱柱和第二色谱柱的有效长度独立地≥150mm；直径独立地为10～200mm；所述第一色谱柱和第二色谱柱的填充物的粒径独立地为10～30μm。
29.优选地，所述第一高效液相色谱纯化的参数包括：梯度洗脱程序为：0～60min：5vol％
→
55vol％第一流动b相；所述第二高效液相色谱纯化的参数包括：梯度洗脱程序为：0～60min：10vol％
→
60vol％第二流动b相。
30.优选地，所述第一高效液相色谱纯化的参数包括：梯度洗脱程序为：0～60min：10vol％
→
30vol％第一流动b相；所述第二高效液相色谱纯化的参数包括：梯度洗脱程序为：0～60min：10vol％
→
50vol％第二流动b相。
31.优选地，所述第一高效液相色谱纯化的参数包括：梯度洗脱程序为：0～60min：5vol％
→
55vol％第一流动b相；所述第二高效液相色谱纯化的参数包括：梯度洗脱程序为：0～60min：10vol％
→
40vol％第二流动b相。
32.优选地，所述第二高效液相色谱纯化后，还包括将所得第二高效液相色谱纯化馏分进行冷冻干燥，得到所述机体保护多肽纯品。
33.本发明提供了一种机体保护多肽粗品的纯化方法，包括以下步骤：将机体保护多肽粗品溶解，得到机体保护多肽粗品溶液；对所述机体保护多肽粗品溶液进行高效液相色谱分离纯化；所述高效液相色谱分离纯化包括依次进行第一高效液相色谱纯化和第二高效液相色谱纯化；所述第一高效液相色谱纯化的参数包括：第一色谱柱：c
18
柱；第一流动a相：磷酸二氢钠水溶液，所述磷酸二氢钠水溶液的浓度为3～30g/l；第一流动b相：乙腈；第一流速：1～1000ml/min；第一梯度洗脱程序为：0～60min：n1vol％
→
m1vol％第一流动b相；n1为5～10，m1为30～60；第一检测波长：210～260nm；所述第二高效液相色谱纯化的参数包括：第二流动a相：乙酸水溶液，所述乙酸水溶液中乙酸和水的体积比为(0.1～5)：100；第二流动b相：乙腈；第二流速：1～1000ml/min；第二梯度洗脱程序为：0～60min：n2vol％
→
m2vol％第二流动b相；n2为5～10，m2为30～60；第二检测波长：210～260nm。
34.本发明的第一高效液相色谱纯化能够除去粗品中含有的残留溶剂(包括三氟乙酸、乙二硫醇、甲基叔丁基醚)、残留保护基和大部分杂质；所述第二高效液相色谱纯化能够除去第一高效液相色谱纯化未除去的杂质以及磷酸根离子以及钠离子。本发明提供的纯化方法所得机体保护多肽纯度高，单杂含量低；同时，得到的是机体保护多肽的乙酸盐，利于人体吸收。实施例的数据表明：机体保护多肽纯品的纯度为99.58％以上，单杂的含量＜0.1％。
具体实施方式
35.本发明提供了一种机体保护多肽粗品的纯化方法，包括以下步骤：
36.将机体保护多肽粗品溶解，得到机体保护多肽粗品溶液；
37.对所述机体保护多肽粗品溶液进行高效液相色谱分离纯化，得到机体保护多肽纯品。
38.在本发明中，如无特殊说明，本发明所用原料均优选为市售产品。
39.本发明将机体保护多肽粗品溶解，得到机体保护多肽粗品溶液。
40.在本发明中，所述机体保护多肽粗品的纯度优选≥60％。本发明中，所述机体保护多肽粗品中的杂质优选包括乙酰化杂质，三氟乙酰化杂质，缺失单个或多个氨基酸、多连接单个或多个氨基酸的杂质。
41.在本发明中，所述机体保护多肽粗品优选采用fmoc法固相合成；所述基体保护多肽粗品的制备方法优选包括以下步骤：以fmoc
‑
val
‑
resin为起始树脂，依次连接以下带保护氨基酸：fmoc
‑
leu
‑
oh，fmoc
‑
gly
‑
oh，fmoc
‑
ala
‑
oh，fmoc
‑
asp(otbu)
‑
oh，fmoc
‑
asp(otbu)
‑
oh，fmoc
‑
ala
‑
oh，fmoc
‑
pro
‑
oh，fmoc
‑
lys(boc)
‑
oh，fmoc
‑
gly
‑
oh，fmoc
‑
pro
‑
oh，fmoc
‑
pro
‑
oh，fmoc
‑
pro
‑
oh，fmoc
‑
glu(otbu)
‑
oh，fmoc
‑
gly
‑
oh；得到肽树脂h
‑
gly
‑
glu(otbu)
‑
pro
‑
pro
‑
pro
‑
gly
‑
lys(boc)
‑
pro
‑
ala
‑
asp(otbu)
‑
asp(otbu)
‑
ala
‑
gly
‑
leu
‑
val
‑
resin；使用三氟乙酸：水体积比95：5的混合溶液对所述肽树脂h
‑
gly
‑
glu(otbu)
‑
pro
‑
pro
‑
pro
‑
gly
‑
lys(boc)
‑
pro
‑
ala
‑
asp(otbu)
‑
asp(otbu)
‑
ala
‑
gly
‑
leu
‑
val
‑
resin进行裂解，过滤取滤液，冰乙醚沉淀并洗涤，最终得到所述基体保护多肽粗品。
42.在本发明中，所述机体保护多肽粗品溶解的溶剂优选为乙酸水溶液；所述乙酸水溶液中乙酸的体积百分含量优选为5％～15％，进一步优选为10％。
43.在本发明中，所述机体保护多肽粗品溶液中机体保护肽的浓度优选为10～100mg/ml。
44.所述机体保护多肽粗品溶解后，优选还包括进行过滤，得到机体保护多肽粗品溶液。
45.得到机体保护多肽粗品溶液后，本发明对所述机体保护多肽粗品溶液进行高效液相色谱分离纯化，得到机体保护多肽纯品。
46.在本发明中，所述高效液相色谱分离纯化包括依次进行第一高效液相色谱纯化和第二高效液相色谱纯化。
47.所述第一高效液相色谱纯化的参数包括：
48.第一色谱柱：c
18
柱；所述第一色谱柱的有效长度优选≥150mm，进一步优选为150～250mm；直径优选为10～200mm；所述第一色谱柱的填充物的粒径优选为10～30μm，进一步优选为10μm。
49.第一流动相a：磷酸二氢钠水溶液，所述磷酸二氢钠水溶液的浓度为3～30g/l，优选为10～20g/l；
50.第一流动相b：乙腈；
51.第一流速：1～1000ml/min，在本发明中，所述第一流速优选与第一色谱柱的直径相关，具体为：当第一色谱柱的直径为10mm时，所述第一流速为5ml/min；当第一色谱柱的直径为20mm时，所述第一流速为10ml/min；当第一色谱柱的直径为30mm时，所述第一流速为
25ml/min；当第一色谱柱的直径为50mm时，所述第一流速为60ml/min；当第一色谱柱的直径为100mm时，所述第一流速为250ml/min；当第一色谱柱的直径为200mm时，所述第一流速为1000ml/min；
52.第一梯度洗脱程序为：
53.0～60min：n1vol％
→
m1vol％第一流动b相；n1为5～10，m1为30～60；具体优选为：0～60min：5vol％
→
55vol％第一流动b相；或，0～60min：10vol％
→
30vol％第一流动b相；或，0～60min：5vol％
→
55vol％第一流动b相。
54.第一检测波长：210～260nm，优选为220～250nm。
55.所述第一高效液相色谱纯化后，本发明优选得到第一纯化机体保护多肽；将所述第一纯化机体保护多肽进行第二高效液相色谱纯化。在本发明中，馏分收集是根据所确定的工艺和中控标准进行控制合并收集。在本发明中，进行第二高效液相色谱纯化的第n段馏分在进行第二高效液相色谱纯化前，优选进行稀释；所述稀释的试剂优选为纯化水；所述稀释的倍数优选为1倍。
56.在本发明中，所述第一高效液相色谱纯化能够除去除去粗品中含有的残留溶剂(包括三氟乙酸、乙二硫醇、甲基叔丁基醚)、残留保护基和大部分杂质。
57.在本发明中，所述第二高效液相色谱纯化的参数包括：
58.第二色谱柱：c
18
柱；所述第二色谱柱的有效长度优选≥150mm，进一步优选为150～250mm；直径优选为10～200mm；所述第二色谱柱的填充物的粒径优选为10～30μm，进一步优选为10μm。
59.第二流动相a：乙酸水溶液，所述乙酸水溶液中乙酸和水的体积比为(0.1～5)：100，优选为(0.5～2)：100；
60.第二流动相b：乙腈；
61.第二流速：1～1000ml/min；1～1000ml/min，在本发明中，所述第二流速优选与第二色谱柱的直径相关，具体为：当第二色谱柱的直径为10mm时，所述第二流速为5ml/min；当第二色谱柱的直径为20mm时，所述第二流速为10ml/min；当第二色谱柱的直径为30mm时，所述第二流速为25ml/min；当第二色谱柱的直径为50mm时，所述第二流速为60ml/min；当第二色谱柱的直径为100mm时，所述第二流速为250ml/min；当第二色谱柱的直径为200mm时，所述第二流速为1000ml/min；
62.第二梯度洗脱程序为：
63.0～60min：n2vol％
→
m2vol％第二流动b相；n2为5～10，m2为30～60；具体优选为：0～60min：10vol％
→
60vol％第二流动b相；或，0～60min：10vol％
→
50vol％第二流动b相；或，0～60min：10vol％
→
40vol％第二流动b相。
64.第二检测波长：210～260nm，优选为220～250nm。
65.在本发明中，所述第二高效液相色谱纯化能够除去第一高效液相色谱纯化未除去的杂质以及磷酸根离子以及钠离子。
66.所述第二高效液相色谱纯化后，本发明优选还包括将所得第二高效液相色谱纯化馏分进行冷冻干燥，得到所述机体保护多肽纯品。
67.在本发明中，当所述第二高效液相色谱纯化馏分的体积＜1l时，优选采用挂瓶式冷冻干燥；当所述第二高效液相色谱纯化馏分的体积≥1l时，优选采用平板冷冻干燥。
68.下面结合实施例对本发明提供的机体保护多肽粗品的纯化方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
69.实施例1
70.bpc
‑
157多肽粗品的制备方法包括以下步骤：
71.以fmoc
‑
val
‑
resin为起始树脂，按80mmol多肽规模进行偶联，依次连接以下带保护氨基酸fmoc
‑
leu
‑
oh，fmoc
‑
gly
‑
oh，fmoc
‑
ala
‑
oh，fmoc
‑
asp(otbu)
‑
oh，fmoc
‑
asp(otbu)
‑
oh，fmoc
‑
ala
‑
oh，fmoc
‑
pro
‑
oh，fmoc
‑
lys(boc)
‑
oh，fmoc
‑
gly
‑
oh，fmoc
‑
pro
‑
oh，fmoc
‑
pro
‑
oh，fmoc
‑
pro
‑
oh，fmoc
‑
glu(otbu)
‑
oh，fmoc
‑
gly
‑
oh，氨基酸原料按2倍摩尔量加入，即160mmol；得到肽树脂h
‑
gly
‑
glu(otbu)
‑
pro
‑
pro
‑
pro
‑
gly
‑
lys(boc)
‑
pro
‑
ala
‑
asp(otbu)
‑
asp(otbu)
‑
ala
‑
gly
‑
leu
‑
val
‑
resin；使用三氟乙酸：水体积比95：5的混合溶液对所述肽树脂h
‑
gly
‑
glu(otbu)
‑
pro
‑
pro
‑
pro
‑
gly
‑
lys(boc)
‑
pro
‑
ala
‑
asp(otbu)
‑
asp(otbu)
‑
ala
‑
gly
‑
leu
‑
val
‑
resin进行裂解，过滤取滤液，冰乙醚沉淀并洗涤，最终得到所述基体保护多肽粗品(以下简称bpc
‑
157多肽粗品)，纯度为72％，质量为115.2g。
72.称取bpc
‑
157多肽粗品182mg，用乙酸
‑
水(乙酸和水的体积比为5：100)溶液溶解至20ml，进行过滤，得到机体保护多肽粗品溶液。
73.上样后，进行第一高效液相色谱纯化，所述第一高效液相色谱纯化的参数包括：第一色谱柱为20mm
×
250mm的c
18
‑
20μm；第一流速为10ml/min；5.2g/l磷酸二氢钠水溶液作为第一流动a相，乙腈为第一流动b相；梯度洗脱程序为：0～60min：5vol％
→
55vol％第一流动b相；检测波长为210nm，对各洗脱液进行高效液相色谱检测，收集3#
‑
8#馏分，纯度为98.53％，最大单杂为0.38％，得到第一次纯化机体保护多肽。
74.所述高效液相色谱检测的条件为：
75.流动相：a：体积浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液；b：体积浓度为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液；
76.柱温度：40℃；
77.检测波长：220nm；
78.流速：1.0ml/min；
79.洗脱程序如表1所示：
80.表1洗脱程序
[0081][0082][0083]
将收集的第一次纯化机体保护多肽用纯化水稀释一倍体积后进行第二高效液相色谱纯化换盐洗脱：所述第二高效液相色谱纯化的参数包括：第二色谱柱为20mm
×
250mm的c
18
‑
20μm；第二流速为10ml/min；以乙酸体积百分含量为0.5％的乙酸水溶液做第二流动a
相，乙腈为第二流动b相；梯度洗脱程序为0～60min：10vol％
→
60vol％第二流动b相，检测波长为220nm，收集馏分1
‑
7#进行挂瓶冻干，按照上述高效液相色谱检测的条件进行检测，结果为：最终产物的色谱纯度为99.82％，最大单杂为0.06％；质量为83mg，收率为46％，乙酸含量为5.8％。
[0084]
实施例2
[0085]
称取bpc
‑
157多肽粗品10.5g，用乙酸
‑
水(乙酸和水的体积比为10：100)溶液溶解至200ml，进行过滤，得到机体保护多肽粗品溶液。
[0086]
上样后，进行第一高效液相色谱纯化，所述第一高效液相色谱纯化的参数包括：第一色谱柱为100mm
×
250mm的c
18
‑
10μm；第一流速为250ml/min；以15.6g/l磷酸二氢钠水溶液为第一流动a相，乙腈为第一流动b相，梯度洗脱程序为：0～60min，10vol％
→
30vol％第一流动b相，检测波长为220nm，对各洗脱液进行高效液相色谱法检测，收集1#
‑
7#馏分，按照实施例1的高效液相色谱检测的条件进行检测，结果为：纯度为98.45％，最大单杂为0.32％，得到第一次纯化机体保护多肽。
[0087]
将第一次纯化机体保护多肽用纯化水稀释一倍体积后进行第二高效液相色谱纯化换盐洗脱：所述第二高效液相色谱纯化的参数包括：第二色谱柱为100mm
×
250mm的c
18
‑
10μm；第二流速为250ml/min；以乙酸体积百分含量为1％的乙酸水溶液为第二流动a相，乙腈为第二流动b相；梯度洗脱程序为：0～60min，10vol％
→
50vol％第二流动b相；检测波长为220nm，收集馏分1
‑
7#进行挂瓶冻干，按照实施例1的高效液相色谱检测的条件进行检测，结果为：最终产物的色谱纯度为99.75％，最大单杂为0.08％；质量为5.04g，收率为48％，乙酸含量为6.1％。
[0088]
所述bpc
‑
157多肽粗品与实施例1相同。
[0089]
实施例3
[0090]
称取bpc
‑
157多肽粗品82.7g，用乙酸
‑
水(乙酸和水的体积比为15：100)溶液溶解至3.5l，进行过滤，得到机体保护多肽粗品溶液。
[0091]
上样后，进行第一高效液相色谱纯化，所述第一高效液相色谱纯化的参数包括：第一色谱柱为200mm
×
150mm的c
18
‑
10μm，第一流速为1000ml/min；以20.8g/l磷酸二氢钠水溶液为第一流动a相，乙腈为第二流动b相，梯度洗脱程序为：0～60min，5vol％
→
55vol％第一流动b相，检测波长为250nm，对各洗脱液进行高效液相色谱法检测，收集4#
‑
8#馏分，按照实施例1的高效液相色谱检测的条件进行检测，结果为：纯度为98.35％，最大单杂为0.41％，得到第一次纯化机体保护多肽。
[0092]
将第一次纯化机体保护多肽用纯化水稀释一倍体积后进行第二高效液相色谱纯化换盐洗脱：所述第二高效液相色谱纯化的参数包括：第二色谱柱为200mm
×
250mm的c
18
‑
10μm；第二流速为1000ml/min；以乙酸体积百分含量为2％的乙酸水溶液做第二流动a相，乙腈为第二流动b相；梯度洗脱程序为0～60min：10vol％
→
40vol％第二流动b相，检测波长为220nm，收集馏分1
‑
8#进行挂瓶冻干，按照实施例1的高效液相色谱检测的条件进行检测，结果为：最终产物的色谱纯度为99.58％，最大单杂为0.09％；质量为41.3g，收率为50％，乙酸含量为6.2％。
[0093]
所述bpc
‑
157多肽粗品与实施例1相同。
[0094]
对比例1
[0095]
称取bpc
‑
157多肽粗品9.8g，用乙酸
‑
水(乙酸和水的体积比为10：100)溶液溶解至200ml，进行过滤，得到机体保护多肽粗品溶液。
[0096]
上样后，进行第一高效液相色谱纯化，所述第一高效液相色谱纯化的参数包括：第一色谱柱为100mm
×
250mm的c
18
‑
10μm；第一流速为250ml/min；以1％磷酸三乙胺溶液为第一流动a相，乙腈为第一流动b相，梯度洗脱程序为：0～60min，10vol％
→
30vol％第一流动b相，检测波长为220nm，对各洗脱液进行高效液相色谱法检测，收集2#
‑
5#馏分，按照实施例1的高效液相色谱检测的条件进行检测，结果为：纯度为95.6％，最大单杂为3.23％，得到第一次纯化机体保护多肽。
[0097]
将第一次纯化机体保护多肽用纯化水稀释一倍体积后进行第二高效液相色谱纯化换盐洗脱：所述第二高效液相色谱纯化的参数包括：第二色谱柱为100mm
×
250mm的c
18
‑
10μm；第二流速为250ml/min；以乙酸体积百分含量为1％的乙酸水溶液为第二流动a相，乙腈为第二流动b相；梯度洗脱程序为：0～60min，10vol％
→
50vol％第二流动b相；检测波长为220nm，收集馏分1
‑
6#进行挂瓶冻干，按照实施例1的高效液相色谱检测的条件进行检测，结果为：最终产物的色谱纯度为97.2％，最大单杂为0.75％；质量为4.6g，收率为47％。
[0098]
所述bpc
‑
157多肽粗品与实施例1相同。
[0099]
对比例2
[0100]
称取bpc
‑
157多肽粗品203mg，用乙酸
‑
水(乙酸和水的体积比为5：100)溶液溶解至20ml，进行过滤，得到机体保护多肽粗品溶液。
[0101]
上样后，进行第一高效液相色谱纯化，所述第一高效液相色谱纯化的参数包括：第一色谱柱为20mm
×
250mm的c8‑
10μm；第一流速为10ml/min；5.2g/l磷酸二氢钠水溶液作为第一流动a相，乙腈为第一流动b相；梯度洗脱程序为：0～60min：5vol％
→
55vol％第一流动b相；检测波长为210nm，对各洗脱液进行高效液相色谱法检测，收集3#
‑
5#馏分，按照实施例1的高效液相色谱检测的条件进行检测，结果为：纯度为96.8％，最大单杂为2.12％，得到第一次纯化机体保护多肽。
[0102]
将收集的第一次纯化机体保护多肽用纯化水稀释一倍体积后进行第二高效液相色谱纯化换盐洗脱：所述第二高效液相色谱纯化的参数包括：第二色谱柱为20mm
×
250mm的c8‑
10μm；第二流速为10ml/min；以乙酸体积百分含量为0.5％的乙酸水溶液做第二流动a相，乙腈为第二流动b相；梯度洗脱程序为0～60min：10vol％
→
60vol％第二流动b相，检测波长为220nm，收集馏分1
‑
7#进行挂瓶冻干，按照实施例1的高效液相色谱检测的条件进行检测，结果为：最终产物的色谱纯度为97.5％，最大单杂为0.96％；质量为63mg，收率为31.03％。
[0103]
对比例3
[0104]
按照公开号为cn102229649a中的实施例1进行多肽的制备和纯化，按照实施例1的高效液相色谱检测的条件进行检测，结果为：纯化的有机多肽的纯度为98.02％，最大单杂为0.76％。
[0105]
对比例4
[0106]
取实施例1制备的有机多肽，按照公开号为cn102229649a中实施例1的纯化步骤进行纯化，按照实施例1的高效液相色谱检测的条件进行检测，结果为：纯化的有机多肽的纯度为97.58％，最大单杂为0.84％。
[0107]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。