多功能环二核苷酸及其用途的制作方法

1.本发明涉及多功能环二核苷酸化合物及其衍生物，其功能包括可作为细胞凋亡诱导剂或细胞毒性剂的前药用于诱导肿瘤细胞凋亡或抗病毒，又作为免疫调节剂以调控免疫通路以产生有治疗益处的免疫应答，特别是激活sting所介导的免疫通路。本公开进一步涉及包含本发明环二核苷酸化合物的药物组合物和药物组合、用于合成其的方法以及其医疗用途。


背景技术：

2.癌症是一种以细胞分化和增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性为生物学特征的恶性疾病，已经成为人类的重要死亡原因之一，且在世界范围内发病率仍在持续增长；同时，病毒感染也已在世界范围内导致数以百万计的人类死亡。
3.在抗癌/抗肿瘤和抗病毒感染的治疗策略中，抗代谢的核苷类似物是主要的治疗手段之一。具体地，抗代谢的核苷类药物本身并不能直接发挥作用，必须在体内经过各种细胞激酶被转化为三磷酸化的形式，作为伪代谢物成为聚合酶的活性底物，经核酸生物合成途径被嵌入dna或rna中，抑制dna或rna的修饰和延伸，或抑制dna或rna合成相关的反转录酶，由此诱导肿瘤细胞的凋亡或阻止病毒的复制，表现出细胞毒性，可用于癌症/肿瘤或病毒感染的治疗；同时，因核苷类药物细胞毒性产生的细胞碎片会引起宿主细胞的免疫反应，从而进一步抑制肿瘤细胞或病毒的生长和繁殖。
4.目前临床上使用的抗癌性核苷类，可以列举以下：
5.[0006][0007]
但是核苷类药物分子结构上有多个羟基、氨基等活性基团，导致透膜效率低、稳定性欠缺、药代性质差，常常需要特殊或者频繁地给药，给患者带来了诸多不便。因此，寻找新的核苷类药物改进方案一直是一个活跃的药物研发领域。
[0008]
内源性环状二核苷酸(cdn)cgamp是先天免疫系统的重要组成部分
‑ꢀ
cgas-sting(环状gmp-amp合酶-干扰素基因刺激物)信号通路-的重要环节。具体地，cgas与来自肿瘤细胞、濒死细胞、病毒、细菌或线粒体的dna相互作用，催化atp和gtp合成环状二核苷酸(cdn)cgamp。所生成的内源性 cgamp进一步结合内质网膜(er)上的sting，与cgamp结合的sting被激活，经历构象改变，易位至golgi，诱导关键的转录因子irf-3和nf-κb的活化，后者进入细胞核，诱导表达i型干扰素和促炎细胞因子如il-6、tnf-α和 ifn-γ(jiang等人，cgas-sting，an important pathway in cancer immunotherapy， journal of hematology&oncology，2020，13：81；xiangling cui等人，stingmodulators：predictive significance in drug discovery，european journal of medicinalchemistry 182(2019)111591)。
[0009][0010]
而本领域已熟知，i型干扰素不仅显示出抗病毒活性，还可直接抑制人类肿瘤细胞增殖、通过诱导适应性和先天免疫细胞的激活而显著增强抗肿瘤免疫应答以及通过调节与组织重塑相关的酶表达来抑制肿瘤侵袭，因此可用作抗癌剂。
[0011]
鉴于内源性环状二核苷酸(cdn)cgamp是上述先天免疫系统响应于病毒和肿瘤、最终促成干扰素或促炎细胞因子生成并由此实现治疗益处的关键介体，已经有一系列cdn sting激动剂被合成并经过实验室活性验证，其实例例如描述于wo2014/189805、wo2017/027645以及wo2018/060323中。但是，基于 cdn的现有治疗仍然缺乏足够的临床治疗效果，因此也仍然需要改进的基于 cdn的sting激动剂，以提供更为安全和强效的抗病毒或抗肿瘤效果。
[0012]
根据本领域共识，sting通路可由外源dna(肿瘤或病毒等)激活。如无蛋白新抗原的介导，sting通路通过干扰素等驱动的下游促炎因子缺乏靶向性，导致自免反应耐受性差、治疗窗口窄。第一代的单一sting激动剂与pd-1抗体联用依旧聚焦在系统性免疫的激
活，没有能够解决适应性免疫的选择性问题以及激起肿瘤微环境的响应。
[0013]
本发明的化合物一方面作为已知高活性的sting激动剂，激活信号通路，释放干扰素及其他炎症因子，激活免疫系统；其次，它的细胞毒功能随后被启动，选择性地杀死肿瘤，释放大量肿瘤新抗原和肿瘤dna，以建立适应性免疫的识别功能，训练免疫系统有的放矢；再次，肿瘤新抗原和肿瘤dna继续激活sting 通路和其他免疫系统，杀伤肿瘤细胞；最后，释放的肿瘤新抗原被dc细胞识别，与t细胞相互作用，形成免疫记忆，达到对远程瘤和癌细胞迁移的长期控制。
[0014]
具体地，本技术在寻找新的、具有改进性质的细胞毒性核苷类药物的过程中，将具有细胞毒性作用的核苷类药物开创性地作为构建单元引入cdn的分子结构，即在cdn的分子水平引入隐蔽的细胞毒性药效基团。由此形成的新型 cdn药物分子，首先能够激活sting从而诱导i型干扰素产生，进而实现抗病毒或抗肿瘤免疫治疗效果。更具创新性的是，本发明的分子在体内分解形成的产物即核苷细胞毒性药，能够特异性干扰核酸的代谢、阻止细胞的分裂和繁殖、导致肿瘤细胞死亡或阻止病毒复制，释放肿瘤dna以持续激活sting，并释放肿瘤新抗原以建立适应性免疫的识别功能，训练免疫系统有的放矢，克服了单独的核苷类药物透膜效率低、稳定性欠缺、药代性质差、常常需要特殊或者频繁给药的缺陷，同时也克服了持续激活sting通路需要的外源性dna(如肿瘤dna) 的来源问题。更重要的是，本技术披露的分子所具有的cdn结构骨架能够激活 sting、从而诱导i型干扰素产生、进而实现抗病毒或抗肿瘤免疫治疗效果。另一方面，本发明新型cdn分子中隐蔽的细胞毒性药效团会适时释放产生细胞凋亡碎片，为免疫系统提供针对肿瘤或病毒的抗原，在免疫白细胞亚群的协同下产生抗体-抗原应答，从而提供针对所遇抗原的“免疫记忆”或持久免疫的能力。
[0015]
由此，本发明提供一类新的cdn化合物，通过亚分子水平的药物联用，同时实现病毒感染或肿瘤的抗代谢治疗和免疫抑制，相比单独的细胞毒性药或者单纯的cdn sting激动剂，能够提供增强、甚至协同的效果。
[0016]
需要说明的是，提供以上对发明背景的讨论仅仅是为了有助于读者理解本发明，并不承认描述或构成本发明的现有技术。
[0017]
发明概述
[0018]
本发明的目的在于提供一组基于环状二核苷酸结构的新的抗病毒或抗肿瘤化合物。
[0019]
一方面，本发明提供一组具有以下通式的环状二核苷酸化合物、其立体异构体、互变异构体、稳定的同位素变体、药学上可接受的盐或溶剂合物，
[0020]
例如
[0021]
其中x1和x2各自独立地选自-oh和-sh；且在成环的两个核苷酸的两个核苷中至少之一具有细胞毒性或抗病毒作用。该结构的化合物，一方面在体内分解后产生单独的核苷
类细胞毒性或抗病毒化合物，经细胞内核苷激酶三磷酸化活化后，通过特异性干扰核酸的代谢，阻止细胞的分裂和繁殖，从而抑制肿瘤细胞增殖或病毒的复制。另一方面本发明的分子保留了环二核苷酸的免疫激活功能，即激活靶点sting并通过sting信号传导级联最终诱导i型干扰素产生，从而产生肿瘤免疫活性，抑制肿瘤的生长和转移，或发挥抗病毒活性；而且，细胞凋亡的组织碎片为免疫系统提供宿主中非天然表达的抗原，产生抗原-抗体应答，从而提供针对所遇抗原的“记忆”或持久免疫的能力。
[0022]
具体地，本发明在该方面提供式(y)的环状二核苷酸化合物，
[0023][0024]
其中x1、x2、b1、b2、r1、r1’
、r2、r2’
如本文所定义；其立体异构体、互变异构体、稳定的同位素变体、药学上可接受的盐、前药或溶剂合物。
[0025]
更具体地，本发明在该方面提供式(i)、(ii)、(iii)和(iv)及其各个子通式的环状二核苷酸化合物；更具体地，本发明在该方面提供式(i)、(ii)、(iii)和(iv)的各个子通式的环状二核苷酸化合物；以及其各自具体的实施方式，如本文下文所描述。
[0026]
在另一方面，本发明提供制备本文所述的本发明化合物的方法，还提供了通过本文所述的方法可获得的本文所述的本发明化合物。
[0027]
在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本文所述的本发明化合物、其立体异构体、互变异构体、稳定的同位素变体、药学上可接受的盐、前药或溶剂合物和一种或多种药学可接受的赋形剂。
[0028]
在另一方面，本发明提供本文所述的本发明化合物或本文所述的药物组合物，用作用于治疗或预防与免疫反应相关或由其介导的疾病的活性剂，具体地用于治疗或预防与sting相关或由其介导的疾病，更具体地用于治疗或预防炎症、变应性或自身免疫疾病、感染性疾病或癌症，尤其是用于抗病毒或抗肿瘤，或用作疫苗佐剂。
[0029]
在另一方面，本发明提供本文所述的本发明化合物或本文所述的药物组合物，用作用于治疗或预防过度增殖性疾病的细胞毒性药、尤其是抗肿瘤药。
[0030]
在另一方面，本发明提供本文所述的本发明化合物或本文所述的药物组合物，用作用于治疗或预防病毒感染的细胞毒性药。
[0031]
在另一方面，本发明提供本文所述的本发明化合物或本文所述的药物组合物用于治疗或预防与免疫反应相关或由其介导的疾病的用途，例如作为sting 激动剂，具体地用于治疗或预防与sting相关或由其介导的疾病，更具体地用于治疗或预防炎症、变应性或自身免疫疾病、感染性疾病或癌症、尤其是肿瘤或病毒感染中的用途；或作为疫苗佐剂的用途。
[0032]
在另一方面，本发明提供本文所述的本发明化合物或本文所述的药物组合物作为
细胞毒性药在治疗或预防过度增殖性疾病、尤其是肿瘤中的用途；或作为细胞毒性药在治疗或预防病毒感染中的用途。
[0033]
在另一方面，本发明提供在受试者中治疗或预防与免疫反应相关或由其介导的疾病、具体地与sting相关或由其介导的疾病、更具体地炎症、变应性或自身免疫疾病、感染性疾病或癌症、尤其是肿瘤或病毒感染的方法，该方法包括向人或动物施用本文所述的本发明化合物或本文所述的药物组合物。
[0034]
在另一方面，本发明提供在受试者中治疗或预防过度增殖性疾病、尤其是肿瘤的方法，该方法包括向人或动物施用本文所述的本发明化合物或本文所述的药物组合物。
[0035]
在另一方面，本发明提供在受试者中治疗或预防病毒感染的方法，该方法包括向人或动物施用本文所述的本发明化合物或本文所述的药物组合物。
[0036]
在另一方面，本发明提供本文所述的本发明化合物或本文所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防与免疫反应相关或由其介导的疾病、具体地与sting相关或由其介导的疾病、更具体地炎症、变应性或自身免疫疾病、感染性疾病或癌症、尤其是肿瘤或病毒感染，或用作疫苗佐剂。
[0037]
在另一方面，本发明提供本文所述的本发明化合物或本文所述的药物组合物在制备用于治疗或预防过度增殖性疾病、尤其是肿瘤的药物中的用途。
[0038]
在另一方面，本发明提供本文所述的本发明化合物或本文所述的药物组合物在制备用于治疗或预防病毒感染的药物中的用途。
[0039]
在另一方面，本发明提供用作多功能活性剂的本文所述的本发明化合物或本文所述的药物组合物，兼具免疫治疗活性和细胞毒治疗活性，包括用于通过激动sting信号通路来激活免疫系统以发挥抗肿瘤和抗病毒复制的功能、通过释放细胞毒性剂导致肿瘤细胞死亡或阻止病毒复制、继而通过释放肿瘤dna持续激活sting以杀伤肿瘤细胞、并且通过释放肿瘤新抗原以产生抗体-抗原应答从而提供对肿瘤的“免疫记忆”或持久免疫的能力。在这方面，本发明还提供了本文所述的本发明化合物或本文所述的药物组合物用于实现上述多种功能的用途，例如具体地用于治疗或预防病毒感染或肿瘤；本文所述的本发明化合物或本文所述的药物组合物通过上述多种功能在受试者中治疗或预防与免疫反应相关或由其介导的疾病、具体地与sting相关或由其介导的疾病、更具体地炎症、变应性或自身免疫疾病、感染性疾病或癌症、尤其是肿瘤或病毒感染的方法，该方法包括向人或动物施用本文所述的本发明化合物或本文所述的药物组合物；以及本文所述的本发明化合物或本文所述的药物组合物在制备用于实现上述多种功能的药物中的用途，例如具体地所述药物用于治疗或预防病毒感染或肿瘤。
[0040]
在另一方面，本发明提供药物组合，包含本文所述的本发明化合物、其立体异构体、互变异构体、稳定的同位素变体、药学上可接受的盐或溶剂合物、以及至少一种其他治疗剂，
[0041]
在另一方面，本发明提供药物组合物，其包含本文所述的本发明化合物、其立体异构体、互变异构体、稳定的同位素变体、药学上可接受的盐或溶剂合物、至少一种其他治疗剂和一种或多种药学可接受的赋形剂。
[0042]
在另一方面，本发明提供本文所述的包含本发明化合物和至少一种其他治疗剂的药物组合，用于治疗或预防过度增殖性疾病、病毒感染或与sting相关或由其介导的疾病、
sting是人类中的跨膜蛋白受体，环二核苷酸(cdn)对sting的激活会导致 irf3和nf-κb途径的激活，因此分别导致i型干扰素和促炎性细胞因子的诱导。术语“sting激动剂”是指在体外或体内激活sting以引起生理反应的任何物质。
[0056]
术语“与sting相关或由其介导的疾病”意指通过sting途径诱导免疫反应可被缓解的疾病，即激活sting将降低疾病的发生率、减少或消除疾病病状的疾病，包括但不限于炎症、变应性或自身免疫性疾病、感染性疾病或癌症等。对于本发明而言，“与sting相关或由其介导的疾病”优选选自肿瘤或癌症。
[0057]
术语“过度增殖性疾病”、“肿瘤”或“癌症”是指受试者中以细胞生长或死亡的不受控或失调为特征的生理状况，包括实体瘤和血源性肿瘤，无论是恶性的或良性的，包括但不限于脑癌、皮肤癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、血癌、肺癌和骨癌。上述癌症类型的实例包括成神经细胞瘤，肠癌例如直肠癌、结肠癌、家族性腺瘤息肉病癌和遗传性非淋巴性结肠直肠癌、食道癌、唇癌、喉癌、鼻咽癌、口腔癌、唾液腺癌、腹膜癌、软组织肉瘤、尿道上皮癌、汗腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、肾癌、肾实质性癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌(包括her2阴性乳腺癌)、泌尿癌、黑素瘤，脑瘤例如成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、成神经管瘤和外周神经外胚层瘤，霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病 (cll)、慢性骨髓性白血病(cll)和淋巴细胞癌、急性骨髓性白血病(aml)、骨髓性白血病(慢性骨髓性白血病(cml)、成人t细胞淋巴瘤、弥漫性淋巴瘤 (dlbcl)、肝细胞瘤、多发性骨髓瘤、精原细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、肛管癌、肾上腺皮质癌、脊索瘤、输卵管癌、胃肠道间质瘤、骨髓增生性病症、间皮瘤、胆道癌、尤因肉瘤和其它罕见的肿瘤类型。
[0058]
术语“治疗剂”是指一种或多种给药于人或动物以获得某种治疗效果的物质，包括预防、治愈或减轻疾病影响、改善健康状况的物质。本发明的治疗剂不仅包括所提供的cdn化合物本身，还包括可以与所提供的cdn化合物联合使用的治疗剂，包括但不限于化疗剂、免疫剂(特别是免疫肿瘤药剂)、疫苗、佐剂以及放射疗法。
[0059]
术语“化疗剂”是指一种或多种化学物质，其被施用于人或动物以杀死肿瘤，或减慢或阻止肿瘤的生长，和/或减慢或阻止癌细胞的分裂，和/或预防或减缓转移。
[0060]
术语“免疫剂”是指可与免疫系统的任何一个或多个成分相互作用的任何内源性或外源性物质，包括抗体、抗原、疫苗及其组成成分、核酸、合成药物、天然或合成有机化合物、细胞因子、天然或修饰的细胞、其合成类似物和/或其片段。
[0061]
术语“免疫疗法”是指其中人或动物的免疫系统的一个或多个成分被故意调节以便直接或间接获得某种治疗益处的任何医学治疗，包括全身和/或局部作用以及预防性和/或治疗性作用。免疫疗法可通过任何途径、例如口服、静脉内、皮肤、注射、吸入等单独或以任何组合方式对人和动物受试者给药一种或多种免疫剂，无论是全身、局部或两者结合。
[0062]
术语“疫苗”是指施用于人或动物以引起或增强特异性免疫系统响应和/或针对该人或动物中的一种或多种抗原的保护的生物制剂。
[0063]
术语“佐剂”是指与主要治疗物质以任何顺序一起施用的次要治疗物质，以实现某种互补、协同或其他有益效果，该效果是单独使用主要治疗物质无法达到的。佐剂可与疫苗、化学疗法或其他治疗物质一起使用，可增强主要治疗物质的功效、降低主要治疗物质的
毒副作用或为接受主要治疗物质的受试者提供某种保护，例如但不限于改善免疫系统的功能。
[0064]
本文使用的术语“细胞毒性剂”或“细胞凋亡诱导剂”或类似表述指的是用于治疗细胞不正常和不受控制的发展生长的活性剂。对于本发明而言，“细胞毒性剂”尤其是指核苷类抗代谢细胞毒性剂或抗病毒剂，包括但不限于阿糖胞苷、阿扎胞苷、氟脲苷、脱氧尿苷、依诺他滨、脱氧氟脲苷、喷司他丁、氟达拉滨、克拉屈滨、吉西他滨、卡培他滨、氯法拉滨、奈拉滨、三氟胸苷、8-氯腺苷、曲西立滨、呋咯地辛、5-氟脱氧胞苷、利巴韦林或阿卡地新。
[0065]
本文所用的术语“多功能活性剂”是指本发明化合物分子基于其独特的结构设计，在受试者体内能够发挥多重功能，兼具免疫治疗活性和细胞毒治疗活性，包括但不限于通过激动sting信号通路来激活免疫系统以发挥抗肿瘤和抗病毒复制的功能、通过释放细胞毒性剂导致肿瘤细胞死亡或阻止病毒复制、通过释放肿瘤dna持续激活sting以杀伤肿瘤细胞、通过释放肿瘤新抗原以产生抗体
‑ꢀ
抗原应答从而提供对肿瘤的“免疫记忆”或持久免疫的能力。
[0066]
术语疾病的“治疗”包括抑制疾病状态，即阻止疾病状态或其临床症状的发展，或缓解疾病状态，即引起疾病状态或其临床症状的暂时或永久消退。
[0067]
术语疾病的“预防”或“防止”表示使疾病状态的临床症状在可能暴露于或易患疾病状态但尚未经历或显示疾病状态的症状的受试者中不发展。
[0068]
术语“治疗有效量”表示本发明的化合物或分子的量，其(i)治疗或预防特定疾病、病症或障碍，(ii)减轻、改善或消除特定疾病、病症或障碍的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文所述的特定疾病、病症或障碍的一种或多种症状的发作。治疗有效量将根据化合物、所治疗的疾病状态、所治疗疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、给药途径和形式、主治医师或兽医的判断和其它因素而变化。
[0069]
本文所用的术语“受试者”、“个体”或“患者”是指脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于农场动物(如牛)、运动动物、宠物(如豚鼠、猫、狗、兔子和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。在优选实施方案中，哺乳动物是人类。
[0070]
术语“药物组合物”和“药物制剂”(或“制剂”)互换使用，并且表示待施用于有需要的哺乳动物(例如人)的、包含治疗有效量的活性药物成分以及药学可接受的赋形剂的混合物或溶液。
[0071]
术语“药物组合”是指本发明化合物可与其它活性剂组合用于实现本发明的目的。所述其他活性剂可以是一种或多种另外的本发明化合物，或可以是与本发明化合物相容即不会相互不利影响、或具有互补活性的第二种或另外的(例如第三种)化合物。这类活性剂以达到预期目的的有效量适宜地组合存在。所述其他活性剂可以与本发明化合物在单一药物组合物中共同施用，或与本发明化合物处于不同的离散单元中分别施用，当分别施用时可以同时或相继进行。
[0072]
术语“药学可接受的”表示可用于制备药物组合物的材料的属性，其通常是安全、无毒的，并且在生物学上或其它方面都不是不期望的，并且对于兽医以及人类药物用途是可接受的。
[0073]
术语“药学可接受的赋形剂”、“药学可接受的载体”和“治疗惰性赋形剂”可互换使用，并且表示药物组合物中的任何药学可接受的成分，其不具有治疗活性并且对施用的受
试者无毒，例如用于配制药物产品的崩解剂、粘合剂、填充剂、溶剂、缓冲剂、张度剂、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂、载体、稀释剂或润滑剂。
[0074]
本文所用的术语“药学可接受的盐”意指药学上可接受且具有母体化合物所需药理学活性的本发明化合物的盐。具体地，此类盐无毒，可为无机酸加成盐或有机酸加成盐及碱加成盐，包括但不限于：(1)与无机酸形成的酸加成盐，该无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或与有机酸形成的酸加成盐，该有机酸如乙酸、丙酸、己酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、丁二酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、葡糖庚酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、黏康酸等；或(2)当存在于母体化合物中的酸性质子经金属离子如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子置换时、或与有机碱如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、 n-甲基葡糖胺等配位时形成的盐。本领域技术人员了解制备药用盐的一般原理和技术，例如berge等，pharm scl，66，1-19.(1977)中所述的那些。
[0075]
本文所用的术语“药学可接受的前药”意指具有可裂解基团且通过溶剂分解或在生理条件下变成在体内具有药学活性的本发明化合物的化合物，具体地，前药包括那些可以被氧化、还原、氨化、去氨化、羟化、去羟化、水解、去水解、烷化、去烷化、酰化、去酰化、磷酸化或去磷酸化而生成活性化合物的化合物，包括本发明化合物的衍生物。各种形式的前药在本领域众所周知，合适的前药部分描述于例如“prodrugs and targeted delivery”，j.rautico，ed.，john wiley&sons， 2011中。
[0076]
本文所述的cdn化合物的前药一般可增加化合物的活性、生物利用度或稳定性。通常，磷酸酯部分的烷化、酰化或其他亲脂性修饰或使用核苷酸的其他类似物将有助于增加核苷酸的稳定性。
[0077]
本文所用的术语“溶剂合物”是指包含化学计量的或非化学计量的溶剂的溶剂加成形式，包括例如与水的溶剂合物，例如水合物，或与有机溶剂、例如甲醇、乙醇或乙腈的溶剂合物，即分别作为甲醇化物、乙醇化物或乙腈化物；或为任何多晶型物的形式。应当理解的是，本发明化合物的这类溶剂合物还包括本发明化合物的药学可接受盐的溶剂合物。
[0078]
本文所使用的术语“同位素变体”是指构成该化合物的一或多个原子被具有与自然界中通常发现的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子所取代的化合物。可以掺入本发明化合物的一个或多个原子上的同位素的实例包括例如2h、3h、
13
c、
14
c、
15
n、
17
o、
18
o、
31
p、
32
p、
35
s和
18
f，从而形成本发明化合物的同位素变化形式，其无论是否具有放射性，都旨在涵盖在本发明的范围内。在一些实施方案中，所掺入的同位素是2h(氘)；在另一些实施方案中，所掺入的同位素是3h(氚)。
[0079]
本文中所用的术语“立体异构体”表示由于至少一个不对称中心形成的异构体。在具有一个或多个(例如1个、2个、3个或4个)不对称中心的化合物中，其可产生外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物和单独的非对映异构体。类似地，本发明的化合物可以以两种或更多种处于快速平衡的不同结构形式的混合物(通常称作互变异构体)存在。需要理解的是，本技术的范围涵盖所有这样的以任意比例(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％、99％)的异构体或其混合物。
[0080]
本发明化合物可具有一或多个不对称中心，因此可以分别以(r)-或(s)-立体异构
体形式制备或以其混合物形式制备。本文化合物结构式或结构片段中使用的表示不对称中心即手性中心的构型。相应地，在本发明所提供的化合物或中间体的命名中以r和s表示关于该手性中心的构型。本领域技术人员将意识到，本发明化合物中的硫代磷酸键是固有手性的，可各自以r构型或s构型存在，因此两个硫代磷酸键呈r，r、s，s、s，r和r，s形式是可能的。本发明涵盖呈基本上纯净形式或呈混合物形式的本发明化合物及其具体实施方式，含有两个硫代磷酸键的化合物优选呈基本上纯净形式的r，r、s，s、s，r和 r，s立体异构体，特别优选基本上纯净的r，r立体异构体，即两个磷原子均具有 r构型。它们的绝对构型归属可依据文献方法进行(zhao et al.nucleosides， nucleotides and nucleic acids 2009，289，352-378；knouse et al.science 2018，361， 1234)。需要指出的是，基于文献方法失误而导致的构型的指定错误并不影响本发明化合物的实际构型。
[0081]
本文关于cdn所用的术语“基本上纯净的”是指某种立体构型形式相对于上图中指示的手性中心处的其它可能的立体化学构型而言为至少75％纯的。在优选的实施方案中，基本上纯的cdn为至少85％纯的、至少90％纯的、至少 95％纯的、至少97％纯的以及至少99％纯的。本发明的基本上纯的cdn制剂为“立体化学上纯的”，是指制剂内的所有cdn在这些手性中心处具有特定立体化学构型，而并非意在指示制剂内的在这些手性中心处具有特定立体化学构型的所有cdn在其它方面是相同的。例如，基本上纯的cdn r，r cgamp硫代磷酸制剂可包含r，r c-di-gmp硫代磷酸和r，r c-di-amp硫代磷酸的组合，并且仍为基本上纯的环状嘌呤二核苷酸制剂。
[0082]
本文中所有的术语“保护基”表示选择性封闭多官能化合物中的反应性位点的基团，使得化学反应可以在合成化学中通常与其相关的含义上的另一个未保护的反应性位点选择性进行。保护基可以在适当的时间点除去。示例性的保护基包括氨基保护基，包括但不限于tbs(叔丁基二甲基硅烷基)、dmtr(双(4-甲氧基苯基)苯甲基)、bz(苯甲酰基)、i-buco(异丁酰基)、苄基、苄氧羰基(羰基苄基氧基，cbz)、fmoc(9-芴基甲氧羰基)、对甲氧基苄氧羰基、对硝基苄氧羰基、叔丁氧羰基(boc)和三氟乙酰基；以及羟基保护基，包括但不限于形成酯和醚的基团，特别是四氢吡喃氧基、bz(苯甲酰基)、
i-buco(异丁酰基)、dmtr(双(4-甲氧基苯基)苯甲基)、乙酰氧基、氨基甲酰氧基、苄基和甲硅烷基醚如tbs(叔丁基二甲基硅烷基)、tbdps(叔丁基二苯基硅烷基)。这些基团的其它实例见于t.w.greene 和p.g.m.wuts，“greene’s protective groups in organic synthesis”，第5版。johnwiley&sons.，inc.，hoboken，new jersey，2014。
[0083]
术语“脱保护”或“去保护”表示在选择性反应完成后除去保护基的过程。脱保护试剂包括酸、碱或氢，特别是碳酸钾或碳酸钠、氢氧化锂的醇溶液、锌的甲醇溶液、乙酸、三氟乙酸、钯催化剂或三溴化硼。
[0084]
本文所用的术语“烷基”意指具有指定碳原子数目的直链或支链脂族烃基。具体地，烷基可以具有1至14个、1至12个、1至10个、1至8个、1至7个、 1至6个、1至5个、1至4个、1至3个或1至2个碳原子。适合的c1-14烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、二甲基甲基、二丙基甲基、乙基丁基甲基、二乙基甲基、甲基乙基甲基、乙基丙基甲基、二乙基乙基、二乙基丙基、二丙基乙基等。特定的烷基具有1至7个碳原子，例如1至6个碳原子，1至4个碳原子。
[0085]
本文所用的术语“卤代”或“卤素”意指氟(f)、氯(cl)、溴(br)及碘(i)。特定的卤代为氟或氯。
[0086]
为清楚起见，本文所用的术语“鸟嘌呤也可表示为本发明化合物结构式中所用的硫代磷酸酯基团可被绘制为
[0087]
本发明化合物
[0088]
本技术通篇使用的术语“本文所述的化合物”、“发明的化合物”和“本发明的化合物”等，除非另外指出，涵盖本文定义的式(x)、式(y)以及具体实施方案式(i)、(ii)、(iii)和(iv)化合物、其各个子通式实施方式及其具体或优选实施方式、它们的立体异构体、互变异构体、外消旋物、稳定的同位素变体、药学上可接受的盐或溶剂合物，以及药学可接受的前药，各自如上文定义部分所描述。本发明化合物可作为异构体的混合物或作为单独的异构体分离，单独的异构体可通过例如色谱法或分步结晶法拆分外消旋物或由旋光原料而合成制得。类似地，本文中对“中间体”的称谓，无论其本身是否被请求保护，若上下文允许，则均意欲涵盖其游离形式以及上述各衍生形式。
[0089]
优选地，本发明化合物为游离形式或其药学上可接受的盐或溶剂合物；最优选为游离形式或其药学上可接受的盐。
[0090]
本发明的某些化合物可以以多晶型或无定形形式存在，它们也落入本发明的范围内。当为固体结晶形式时，本发明化合物可以是与另一种化学实体的共晶体形式，并且本说明书包括所有这些共晶体。
[0091]
具体地，一方面，本发明提供下式的环状二核苷酸化合物、其立体异构体、互变异构体、稳定的同位素变体、药学上可接受的盐、前药或溶剂合物：
[0092]
例如
[0093]
其中x1和x2各自独立地选自-oh和-sh；且在成环的两个核苷酸的两个核苷中至少之一具有细胞毒性或抗病毒作用，优选那些抗代谢抗癌药即核苷类抗癌药或其衍生物，包括但不限于临床使用的依诺他滨(enocitabine)、氟达拉滨 (fludarabine)、阿糖胞苷
(cytarabine)、奈拉滨(nelarabine)、脱氧氟脲苷(doxifluridine)、卡培他滨(capecitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、喷司他丁 (pentostatin)、克拉屈滨(cladribine)、吉西他滨(gemcitabine)和氯法拉滨(clofarabine)，更优选克拉屈滨、吉西他滨和氯法拉滨或其衍生物。此处所述的核苷类抗癌药衍生物是指化合物结构中的氢原子或原子团被其他原子或原子团取代而衍生的保留抗癌细胞毒性的化合物。
[0094]
在具体的实施方式中，本发明提供下式(y)的环状二核苷酸化合物，
[0095][0096]
其中x1和x2各自独立地选自-oh和-sh；
[0097]
b1为被x取代的腺嘌呤其中x选自cl、f或-nhc
1-6
烷基；或任选被ra取代的胞嘧啶其中ra选自h或-c(o)-c
1-14
烷基；
[0098]
r1和r1’
各自独立地选自h、f或-oh；
[0099]
b2选自任选被x取代的腺嘌呤其中x选自h、f或cl；任选被ra取代的胞嘧啶其中ra选自h或-c(o)-c
1-14
烷基；或鸟嘌呤其中的oh任选被c
1-6
烷基取代；
[0100]
表示磷酸键可连接至戊糖的2’位或3
′
位，二者中未与磷酸成环的位点被r2和r2’
取代；和
[0101]
r2和r2’
各自独立地选自h、-oh或f；
[0102]
条件是，当b1或b2之一为任选被ra取代的胞嘧啶时，其所连接的戊糖环上与其相邻的碳原子被两个f取代；
[0103]
其立体异构体、互变异构体、稳定的同位素变体、药学上可接受的盐、前药或溶剂合物。
[0104]
在具体的实施方式中，式(y)化合物可以是
[0105][0106]
其中b1、b2、r1、r1’
、r2、r2’
具有上文对式(y)化合物所定义的含义。
[0107]
在具体的实施方式中，本发明化合物中(存在时)的两个硫代磷酸键以r，r、s，s、s，r或r，s构型或其混合物形式存在。在优选的实施方式中，本发明化合物中(存在时)的两个硫代磷酸键以基本上纯净形式的r，r、s，s、s，r或r，s构型存在，特别优选以基本上纯净的r，r构型存在。
[0108]
在具体的实施方式中，本发明化合物中存在的单一硫代磷酸键可以以r或 s构型存在，优选以r构型存在。
[0109]
在一种式(i)、(ii)、(iii)或(iv)化合物的实施方式中，b1为被x取代的腺嘌呤
其中x选自cl或f，优选cl，或任选被ra取代的胞嘧啶其中ra选自h或-c(o)-c
1-14
烷基。
[0110]
在一种式(i)、(ii)、(iii)或(iv)化合物的实施方式中，b1为被x取代的腺嘌呤其中x是-nhc
1-6
烷基，例如-nhch3、-nhch2ch3、
‑ꢀ
nhch2ch2ch3，优选-nhch3。
[0111]
在一种式(i)、(ii)、(iii)或(iv)化合物的实施方式中，b1为任选被ra取代的胞嘧啶其中ra选自h或-c(o)-c
1-14
烷基。
[0112]
在一种式(i)、(ii)、(iii)或(iv)化合物的实施方式中，r1和r1’
均是h，或其中一个是h且另一个是f，或均是f。
[0113]
在一种式(i)、(ii)、(iii)或(iv)化合物的实施方式中，b2是任选被x取代的腺嘌呤其中x选自h、f或cl，优选h或cl。
[0114]
在一种式(i)、(ii)、(iii)或(iv)化合物的实施方式中，b2是任选被ra取代的胞嘧啶其中ra选自h或-c(o)-c
1-14
烷基。
[0115]
在一种式(i)、(ii)、(iii)或(iv)化合物的实施方式中，b2是鸟嘌呤
[0116]
在一种式(i)、(ii)、(iii)或(iv)化合物的实施方式中，r2和r2’
均是h，或其中之一是h且另一个是f，或其中之一是h且另一个是oh，或均是f。
[0117]
在一种式(i)、(ii)、(iii)或(iv)化合物的实施方式中，ra为-c(o)c
1-14
烷基时可以是例如-c(o)c
1-10
烷基、-c(o)c
1-9
烷基、-c(o)c
1-8
烷基、-c(o)c
1-7
烷基、
‑ꢀ
c(o)ch(c
1-4
烷基)2、-c(o)ch(c
1-3
烷基)2、-c(o)ch2ch(c
1-4
烷基)2、
‑ꢀ
c(o)ch2ch(c
1-3
烷基)2。
[0118]
本发明的式(i)、(ii)、(iii)或(iv)化合物，还涵盖上述各个实施方式及其优选或示例方式之间的任何组合。
[0119]
在进一步具体的实施方式中，本发明提供具有以下子通式的式(y)环状二核苷酸化合物，
[0120][0121][0122]
其中b1、b2、r1、r1’
、r2、r2’
具有上文对式(i)、(ii)、(iii)或(iv)化合物及其各个具体实施方式所定义的含义。
[0123]
在一种式(ii-a)或式(ii-b)化合物、尤其是式(ii-a)化合物的实施方式中，b1为且b2为在一个具体的该实施方式中，r1和r1’
均为h；在另一个具体的该实施方式中，r1和r1’
之一为h，另一个为f。进一步地，在所述各个具体的该实施方式中，r2和r2’
均为 h，或其中一个为h且另一个为f，或其中一个为h且另一个为oh。
[0124]
在一种式(ii-a)或式(ii-b)化合物、尤其是式(ii-a)化合物的实施方式中，b1和 b2均为任选被ra取代的胞嘧啶在具体的该实施方式中，r1、r1’
、 r2、r2’
均为f。
[0125]
在一种式(ii-a)或式(ii-b)化合物、尤其是式(ii-b)化合物的实施方式中，b1为且b2为在具体的该实施方式中，r1和r1’
均为h；在另一个具体的该实施方式中，r1和r1’
之一为h，另一个为f。进一步地，在所述各个该实施方式中，r2和r2’
均为h，或一个为h且另一个为 f，或一个为h且另一个为oh，优选一个为h且另一个为oh。
[0126]
在一种式(ii-a)或式(ii-b)化合物、尤其是式(ii-b)化合物的实施方式中，b1为任选被ra取代的胞嘧啶且b2为在具体的该实施方式中，r1和r1’
均为f。进一步地，在所述各个该实施方式中，r2和r2’
均为h，或一个为h且另一个为f，或一个为h且另一个为oh，优选一个为h且另一个为oh。
[0127]
在一种式(ii-a)或式(ii-b)化合物的实施方式中，ra为h，或为-c(o)c
1-10
烷基，例如-c(o)c
1-9
烷基、-c(o)c
1-8
烷基、-c(o)c
1-7
烷基、-c(o)ch(c
1-4
烷基)2、
ꢀ‑
c(o)ch(c
1-3
烷基)2、-c(o)ch2ch(c
1-4
烷基)2、-c(o)ch2ch(c
1-3
烷基)2。
[0128]
在一种式(ii-a)或式(ii-b)化合物的实施方式中，b1为r1和r1’
均为h。
[0129]
在一种式(ii-a)或式(ii-b)化合物的实施方式中，b1为r1和r1’
之一为h，另一个为f；在具体的该实施方式中，f和b1位于核糖同侧。
[0130]
在一种式(ii-a)或式(ii-b)化合物、尤其是式(ii-b)化合物的实施方式中，b1为优选且r1和r1’
均为h，或r1和r1’
之一为h，另一个为f，优选r1和r1’
之一为h，另一个为f。
[0131]
在一种式(ii-a)或式(ii-b)化合物的实施方式中，b1为任选被ra取代的胞嘧啶其中ra选自h，r1和r1’
均为f。
[0132]
在一种式(ii-a)或式(ii-b)化合物的实施方式中，b1为任选被ra取代的胞嘧啶其中ra为-c(o)c
1-10
烷基，优选-c(o)ch(c
1-4
烷基)2，r1和r1’
均为 f。
[0133]
在示例性实施方式中，ra为-c(o)ch(ch3)2、-c(o)ch(ch2ch3)2、
‑ꢀ
c(o)ch(ch3)(ch2ch3)、-c(o)ch(ch2ch2ch3)2、
‑ꢀ
c(o)ch(ch2ch3)(ch2ch2ch3)、-c(o)ch2ch(ch2ch3)(ch2ch2ch3)、 c(o)ch2ch(ch2ch2ch3)2，优选ra为c(o)ch(ch2ch2ch3)2。
[0134]
在一种式(ii-a)或式(ii-b)化合物的实施方式中，b2为鸟嘌呤或腺嘌呤且r2和r2’
之一为h，另一个选自-oh或f。
[0135]
在一种式(ii-a)化合物的实施方式中，b2为鸟嘌呤r2和r2’
之一为h，另一个选自-oh或f。
[0136]
在一种式(ii-a)化合物的实施方式中，b2为腺嘌呤r2和r2’
之一为h，另一个选自-oh或f。
[0137]
在一种式(ii-a)化合物的实施方式中，b2为被卤素x取代的腺嘌呤其中x为cl；r2和r2’
之一为h，另一个为f，优选f和b2位于核糖同侧。
[0138]
在一种式(ii-a)化合物的实施方式中，b2为被卤素x取代的腺嘌呤其中x为c1；r2和r2’
均为h。
[0139]
在一种式(ii-a)化合物的实施方式中，b2为任选被ra取代的胞嘧啶其中ra选自h，r1和r1’
均为f。
[0140]
在一种式(ii-a)化合物的实施方式中，b2为被ra取代的胞嘧啶其中ra为-c(o)c
1-10
烷基，优选-c(o)ch(c
1-4
烷基)2，r1和r1’
均为f。
[0141]
在示例性实施方式中，ra为-c(o)c(ch3)2、-c(o)ch(ch2ch3)2、
‑ꢀ
c(o)ch(ch3)(ch2ch3)、-c(o)ch(ch2ch2ch3)2、
‑ꢀ
c(o)ch(ch2ch3)(ch2ch2ch3)、-c(o)ch2ch(ch2ch3)(ch2ch2ch3)、 c(o)ch2ch(ch2ch2ch3)2，优选ra为c(o)ch(ch2ch2ch3)2。
[0142]
在一种式(ii-b)化合物的实施方式中，b2为鸟嘌呤或腺嘌呤r2和r2’
之一为h，另一个为-oh。
[0143]
在上述式(ii-a)或式(ii-b)化合物及其各个具体实施方式中，两个硫代磷酸键以r，r、s，s、s，r或r，s构型或其混合物形式存在；优选以基本上纯净形式的 r，r、s，s、s，r或r，s构型存在，特别优选以基本上纯净的r，r构型存在。
[0144]
以上对于式(ii-a)或式(ii-b)化合物给出的具体实施方式及其优选或示例方式，也分别适用于式(i-a)或式(i-b)化合物、式(iii-a)或式(iii-b)化合物、式(iv-a)或式(iv-b)化合物，即本发明也涵盖式(i-a)或式(i-b)化合物、式(iii-a)或式(iii-b)化合物、式(iv-a)或式(iv-b)化合物，其中各个具体取代基分别取上述对式(ii-a)或式(ii
‑ꢀ
b)化合物或其具体实施方式给出的具体定义。
[0145]
例如，在一种式(i-a)或式(i-b)化合物、式(iii-a)或式(iii-b)化合物、或式(iv-a) 或式(iv-b)化合物、尤其是式(i-b)、式(iii-b)或式(iv-b)化合物的实施方式中，b1为且b2为优选在一个具体的该实施方式中，r1和r1’
之一为h，另一个为f。进一步地，在所述各个该实施方式中，r2和r2’
之一为h，另一个为oh。
[0146]
本发明的式(i-a)/(i-b)、(ii-a)/(ii-b)、(iii-a)/(iii-b)或(iv-a)/(iv-b)化合物，还涵盖上述各个实施方式及其优选或示例方式之间的任何组合。
[0147]
在再进一步具体的实施方式中，本发明提供以下子通式的环状二核苷酸化合物，
[0148]
[0149][0150]
其中b1、b2、r1、r1’
、r2、r2’
具有上文对式(i)、(ii)、(iii)或(iv)化合物或其各个具体实施方式所定义的含义；更具体地，具有上文对式(i-a)/(i-b)、(ii-a)/(ii-b)、 (iii-a)/(iii-b)或(iv-a)/(iv-b)化合物或其各个具体实施方式所定义的含义。
[0151]
在一种式(ii-a’)或式(ii-b’)化合物、尤其是式(ii-a’)化合物的实施方式中，b1为且b2为在具体的该实施方式中，r1和r1’
均为h；在另一个具体的该实施方式中，r1为f，r1’
为 h，即f与b1在核糖同侧。进一步地，在所述各个具体的该实施方式中，r2和 r2’
均为h，或r2为h且r2’
为f，或r2为f且r2’
为h，或r2为oh且r2’
为 h。
[0152]
在一种式(ii-a’)或式(ii-b’)化合物、尤其是式(ii-a’)化合物的实施方式中，b1和b2均为任选被ra取代的胞嘧啶在具体的该实施方式中，r1、r1’
、 r2、r2’
均为f。
[0153]
在一种式(ii-a’)或式(ii-b’)化合物、尤其是式(ii-b’)化合物的实施方式中，b1为且b2为在具体的该实施方式中， r1和r1’
均为h；在另一个具体的该实施方式中，r1为f，r1’
为h，即f与b1 在核糖同侧。进一步地，在所述各个该实施方式中，r2和r2’
均为h，或r2为 h且r2’
为f，或r2为f且r2’
为h，或r2为oh且r2’
为h；优选r2为oh且 r2’
为h。
[0154]
在一种式(ii-a’)或式(ii-b’)化合物、尤其是式(ii-b’)化合物的实施方式中，b1为任选被ra取代的胞嘧啶且b2为在具体的该实施方式中，r1和r1’
均为f。进一步地，在所述各个该实施方式中，r2和r2’
均为h，或r2为h且r2’
为f，或r2为f且r2’
为h，或r2为oh且r2’
为h；优选r2为oh且r2’
为h。
[0155]
在一种式(ii-a’)或式(ii-b’)化合物的实施方式中，ra为h，或-c(o)c
1-10
烷基，例如-c(o)c
1-9
烷基、-c(o)c
1-8
烷基、-c(o)c
1-7
烷基、-c(o)ch(c
1-4
烷基)2、
‑ꢀ
c(o)ch(c
1-3
烷基)2、-c(o)ch2ch(c
1-4
烷基)2、-c(o)ch2ch(c
1-3
烷基)2。
[0156]
在一种式(ii-a’)或式(ii-b’)化合物的实施方式中，b1为r1和r1’
均为h，由此该b1连同其所连接的核糖一起形成核苷类抗肿瘤药克拉屈滨。
[0157]
在一种式(ii-a’)或式(ii-b’)化合物的实施方式中，b1为r1为f， r1’
为h，即f和b1位于核糖同侧，由此该b1连同其所连接的核糖一起形成核苷类抗肿瘤药氯法拉滨。
[0158]
在一种式(ii-a’)或式(ii-b’)化合物、尤其是式(ii-b’)化合物的实施方式中，b1为优选且r1和r1’
均为h，或r1为f 且r1’
为h，优选r1为f且r1’
为h。
[0159]
在一种式(ii-a’)或式(ii-b’)化合物的实施方式中，b1为任选被ra取代的胞嘧啶其中ra选自h，r1和r1’
均为f，由此该b1连同其所连接的核糖一起形成核苷类抗肿瘤药吉西他滨。
[0160]
在一种式(ii-a’)或式(ii-b’)化合物的实施方式中，b1为任选被ra取代的胞嘧啶其中ra为-c(o)c
1-10
烷基，优选-c(o)ch(c
1-4
烷基)2，r1和r1’
均为f，由此该b1连同其所连接的核糖一起形成核苷类抗肿瘤药吉西他滨的烷酰化衍生物。在示例性实施方式中，ra为-c(o)ch(ch3)2、-c(o)ch(ch2ch3)2、
‑ꢀ
c(o)ch(ch3)(ch2ch3)、-c(o)ch(ch2ch2ch3)2、
‑ꢀ
c(o)ch(ch2ch3)(ch2ch2ch3)、-c(o)ch2ch(ch2ch3)(ch2ch2ch3)、 c(o)ch2ch(ch2ch2ch3)2，优选ra为c(o)ch(ch2ch2ch3)2。
[0161]
在一种式(ii-a’)化合物的实施方式中，b2为鸟嘌呤r2’
为h， r2选自-oh或f。
[0162]
在一种式(ii-a’)化合物的实施方式中，b2为腺嘌呤r2’
为h，r2选自-oh或f。
[0163]
在一种式(ii-a’)化合物的实施方式中，b2为被卤素x取代的腺嘌呤其中x为cl，r2为h，r2’
为f，且f和b2位于核糖同侧，由此该b2连同其所连接的核糖一起形成核苷类抗肿瘤药氯法拉滨。
[0164]
在一种式(ii-a’)化合物的实施方式中，b2为被卤素x取代的腺嘌呤其中x为cl，r2和r2’
均为h，由此该b2连同其所连接的核糖一起形成核苷类抗肿瘤药克拉屈滨。
[0165]
在一种式(ii-a’)化合物的实施方式中，b2为任选被ra取代的胞嘧啶其中ra选自h，r1和r1’
均为f，由此该b2连同其所连接的核糖一起形成核苷类抗肿瘤药吉西他滨。
[0166]
在一种式(ii-a’)化合物的实施方式中，b2为被ra取代的胞嘧啶其中ra为-c(o)c
1-10
烷基，优选-c(o)ch(c
1-4
烷基)2，r1和r1’
均为f，由此该b2连同其所连接的核糖一起形成核苷类抗肿瘤药吉西他滨的烷酰化衍生物。在示例性实施方式中，ra为-c(o)ch(ch3)2、-c(o)ch(ch2ch3)2、
‑ꢀ
c(o)ch(ch3)(ch2ch3)、-c(o)ch(ch2ch2ch3)2、
‑ꢀ
c(o)ch(ch2ch3)(ch2ch2ch3)、-c(o)ch2ch(ch2ch3)(ch2ch2ch3)、 c(o)ch2ch(ch2ch2ch3)2，优选ra为c(o)ch(ch2ch2ch3)2。
[0167]
在一种式(ii-b’)化合物的实施方式中，b2为鸟嘌呤或腺嘌呤r2’
为h，r2为-oh。
[0168]
以上对于式(ii-a’)或式(ii-b’)化合物给出的具体实施方式及其优选或示例方式，也分别适用于式(i-a’)或式(i-b’)化合物、式(iii-a’)或式(iii-b’)化合物、式(iv
‑ꢀ
a’)或式(iv-b’)化合物，即本发明也涵盖式(i-a’)或式(i-b’)化合物、式(iii-a’)或式 (iii-b’)化合物、式(iv-a’)或式(iv-b’)化合物，其中各个具体取代基分别取上述对式(ii-a’)或式(ii-b’)化合物或其具体实施方式给出的具体定义。
[0169]
例如，在一种式(i-a’)或式(i-b’)化合物、式(iii-a’)或式(iii-b’)化合物、或式(iv
‑ꢀ
a’)或式(iv-b’)化合物、尤其是式(i-b’)、式(iii-b’)或式(iv-b’)化合物的实施方式中， b1为且b2为优选在一个具体的该实施方式中，r1为f且r1’
为h。进一步地，在所述各个该实施方式中，r2为oh且r2’
为h。
[0170]
需要说明的是，本发明的化合物涵盖以上各个具体实施方式，还涵盖上述各个具体实施方式的任何组合或亚组合构成的实施方式，也涵盖以上任何优选或例举的任何组合所构成的实施方式。
[0171]
本发明化合物的优选具体实施方式包括以下化合物、其立体异构体、互变异构体、稳定的同位素变体、药学上可接受的盐或溶剂合物，
[0172]
[0173][0174]
本发明化合物的药理学活性和有益效果
[0175]
经研究发现，本发明提供的环二核苷酸化合物，具有下列药理学活性和有益效果：
[0176]
●
有效刺激thp-1细胞分泌ifn-β，由此可以说明其对sting受体有高亲和力，可有效激活sting，诱导i型干扰素产生；
[0177]
●
有效抑制小鼠结直肠癌细胞系ct26的体外生长，表明对肿瘤细胞具有毒性作用，阻止肿瘤细胞分裂和繁殖；
[0178]
●
在免疫健全ct26同基因小鼠双侧移植瘤模型中显示出优于在免疫缺陷小鼠模型中的抗肿瘤活性，表明同时具有激活sting产生的肿瘤免疫活性和细胞毒性作用，二者产生加和、甚至协同的抗肿瘤效果；
[0179]
●
在ct26同基因小鼠移植瘤模型中显示免疫记忆功能，能够有效防止肿瘤复发；
[0180]
●
在肝细胞代谢研究中显示良好的药物代谢动力学性质，例如具有较长的t
1/2
和低清除速率，从而可以加大给药间隔，使患者具有更好的依从性；和
[0181]
●
局部用药于病灶部位，作用精准，可减少用药量，且由于分子极性高，难以扩散到病灶外，毒性有限，具有良好的安全性。
[0182]
药物组合物
[0183]
本发明的另一方面提供包含本发明化合物和一种或多种药学可接受赋形剂的药物组合物，以及使用本发明化合物制备所述组合物的方法。
[0184]
组合物或剂型以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用。在此背景下考虑的因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用时间安排以及医学从业者已知的其他因素。
[0185]
典型的药物组合物或剂型通过将本发明的化合物与载体或赋形剂混合来制备。合适的载体和赋形剂是本领域技术人员熟知的，并详细描述于例如gennaroa.r.等人，remington：the science and practice of pharmacy(2000)lippincott，williams&wilkins，philadelphia。制剂还可以包括一种或多种缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、调味剂、稀释剂和其它已知的添加剂，以提供药物(即本发明的化合物或其药物组合物)的优雅的外观或有助于药物产品(即药剂)的制备。
[0186]
本发明的化合物可以通过任何合适的方式给药，包括口服、局部(包括含服和舌下)、直肠、阴道、经皮、肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、皮内、鞘内和硬膜外和鼻内给药，并且如果需要局部治疗、病灶内给药。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。
[0187]
在优选的实施方式中，提供了包含本发明的一种或多种化合物的药物组合物，其中所述药物组合物适于静脉内、肿瘤内、瘤周或皮下施用。本发明化合物的肿瘤内(直接进入肿瘤块)或肿瘤周围(肿瘤块周围)给药可直接活化局部亲润性树突状细胞，直接促进肿瘤细胞的细胞凋亡或使肿瘤细胞对细胞毒性剂敏感。
[0188]
本发明的化合物可以以任何方便的给药形式给药，例如片剂、粉剂、胶囊剂、无菌可注射制剂、溶液剂、分散剂、混悬剂、糖浆剂、喷雾剂、栓剂、凝胶剂、乳剂、贴剂等。这样的组合物可以包含药物制剂中常规的组分，例如稀释剂、载体、ph调节剂、防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、矫味剂、用于改变渗透压的盐、缓冲剂、掩蔽剂、抗氧化剂和其它活性剂。它们还可以包含其它有治疗价值的物质。各种制剂形式可以根据制剂领域中的常规方法制备，例如参见gennaro a.r.等人，remington：the science and practice ofpharmacy(2000)lippincott，williams&wilkins，philadelphia或各国药典。
[0189]
在优选的实施方式中，提供了包含本发明的一种或多种化合物的药物组合物，其为胃肠外制剂形式，尤其是无菌可注射制剂形式，如在无毒且胃肠外可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，或制备成冻干粉末。在可接受的媒介或溶剂中，可采用例如水、1，3-丁二醇、林格氏溶液或等渗氯化钠溶液；此外，无菌不挥发性油可常规用作溶剂或悬浮介质，为此可采用任何温和的不挥发油，包括例如合成单甘油酯或二甘油酯、脂肪酸等。
[0190]
本发明化合物的给药剂量可以在很宽的范围内变化，当然，在每种具体情况下可以根据个体需要进行调整。通常，本发明化合物的全身施用的有效量为约 0.1μg/kg/天至
约50mg/kg/天，例如0.5μg/kg/天至约10mg/kg/天、1μg/kg/天至约 1mg/kg/天。各剂量单位可以方便地含有0.001μg至10mg，例如0.01μg至1mg，例如50μg至500μg。有效量可以以一个或多个剂量给出，即可以为1次、2次或更多次施用，且可以以相等或不等的时间间隔多次施用，包括每天-次或多次，每周一次或多次，或按照每若干天/周的施用方案进行。
[0191]
用途和方法
[0192]
鉴于本发明的化合物能够激活sting、诱导表达i型干扰素和促炎细胞因子如il-6、tnf-α和ifn-γ等，同时具有细胞毒活性，本发明另一方面提供本发明化合物的治疗用途和方法。
[0193]
一方面，本文所述的化合物或药物组合物，可用作治疗物质，用于治疗或预防与免疫反应相关或由其介导的疾病，具体地用于治疗或预防与sting相关或由其介导的疾病，包括炎症、变应性或自身免疫疾病、感染性疾病或癌症，或用作疫苗佐剂。
[0194]
在优选的实施方式中，本发明的化合物或组合物用作细胞毒性药，用于治疗或预防过度增殖性疾病，尤其是肿瘤。在另外优选地实施方式中，本发明的化合物或组合物用于治疗复发性肿瘤，或用于预防肿瘤复发。
[0195]
在优选的实施方式中，本发明的化合物或组合物用作细胞毒性药，用于治疗或预防病毒感染。
[0196]
另一方面，本发明由此相应地提供在个体中诱导、刺激或辅助免疫反应的方法，包括向个体施用本发明的化合物或药物组合物。在一个实施方案中，本发明的化合物作为免疫疗法施用于个体，以诱导体内产生对人或动物治疗上有用的一种过多种细胞因子，包括i型干扰素和促炎细胞因子如il-6、tnf-α和ifn
‑ꢀ
γ，以调节该人或动物的免疫系统以实现某些治疗益处。
[0197]
另一方面，本发明由此相应地提供治疗或预防与免疫反应相关或由其介导的疾病、具体地与sting相关或由其介导的疾病、包括炎症、变应性或自身免疫疾病、感染性疾病或癌症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的化合物或药物组合物。
[0198]
在优选的实施方式中，本发明提供治疗或预防过度增殖性疾病、尤其是肿瘤的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的化合物或药物组合物。在另外优选的实施方式中，本发明提供治疗复发性肿瘤或预防肿瘤复发的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的化合物或药物组合物。
[0199]
在优选的实施方式中，本发明提供治疗或预防病毒感染的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的化合物或药物组合物。
[0200]
另一方面，本发明由此相应地提供本发明化合物或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防与免疫反应相关或由其介导的疾病、具体地与sting相关或由其介导的疾病、包括炎症、变应性或自身免疫疾病、感染性疾病或癌症。
[0201]
另一方面，本发明由此还相应地提供本发明化合物或药物组合物在制备疫苗佐剂中的用途。
[0202]
在优选的实施方式中，本发明提供本发明的化合物或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防过度增殖性疾病、尤其是肿瘤。在另外优选的实施方式中，本发明提供本发明的化合物或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗复发性肿瘤或用于预防肿瘤复发。
[0203]
在优选的实施方式中，本发明提供本发明的化合物或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防病毒感染。
[0204]
针对上述用途和方法的炎症可以是急性的或慢性的，涉及身体任何器官或组织的炎症，包括肌肉骨骼炎症、血管炎症、神经炎症、消化系统炎症、眼部炎症、生殖系统炎症或其他炎症，当然也包括具有炎症性质的自身免疫病症及过敏性病症如接触性皮炎、荨麻疹和呼吸道过敏。
[0205]
针对上述用途和方法的自身免疫疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害的疾病，包括但不限于全身性红斑狼疮、银屑病、胰岛素依赖性糖尿病、皮肌炎、斯耶格伦氏综合症、慢性疲劳综合症、再生障碍性贫血、自身免疫肝炎、多发性硬化、视神经炎、天疱疮、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、局限性回肠炎、硬斑病、硬皮病等。
[0206]
针对上述用途和方法的过度增殖性疾病是指受试者中以细胞生长或死亡的不受控或失调为特征的生理状况，尤其是指肿瘤或癌症，包括实体瘤和血源性肿瘤，包括但不限于脑癌、皮肤癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、血癌、肺癌和骨癌。上述癌症类型的实例包括成神经细胞瘤，肠癌例如直肠癌、结肠癌、家族性腺瘤息肉病癌和遗传性非淋巴性结肠直肠癌、食道癌、唇癌、喉癌、鼻咽癌、口腔癌、唾液腺癌、腹膜癌、软组织肉瘤、尿道上皮癌、汗腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、肾癌、肾实质性癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌(包括her2阴性乳腺癌)、泌尿癌、黑素瘤，脑瘤例如成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、成神经管瘤和外周神经外胚层瘤，霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病 (cll)、慢性骨髓性白血病(cll)和淋巴细胞癌、急性骨髓性白血病(aml)、骨髓性白血病(慢性骨髓性白血病(cml)、成人t细胞淋巴瘤、弥漫性淋巴瘤 (dlbcl)、肝细胞瘤、多发性骨髓瘤、精原细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、肛管癌、肾上腺皮质癌、脊索瘤、输卵管癌、胃肠道间质瘤、骨髓增生性病症、间皮瘤、胆道癌、尤因肉瘤和其它罕见的肿瘤类型，以及上述肿瘤的复发形式。
[0207]
在优选的实施方式中，针对上述用途和方法的过度增殖性疾病为小细胞肺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、黑素瘤、肾细胞癌、头颈癌、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤、白血病或膀胱癌。
[0208]
针对上述用途和方法的病毒感染是指病毒通过多种途径侵入机体并在易感的宿主细胞中增殖的过程，所涉及的病毒包括但不限于双链dna病毒和单链 dna病毒、单正链rna病毒、单负链rna病毒和双链rna病毒及逆转录病毒，实例有乙型肝炎病毒、ttv病毒、腺病毒、乳头瘤病毒、带状疱疹病毒、天花病毒和牛痘病毒、流感病毒、猪瘟病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、狂犬病毒、埃博拉病毒、肠道病毒和人免疫缺陷病毒等。本发明提供的治疗用途和方法可用于上述病毒感染及其导致的疾病。
[0209]
针对上述本发明化合物或组合物作为疫苗佐剂的用途和在制备疫苗佐剂中的用途，是指本发明的化合物或组合物可在采用疫苗的治疗或预防策略中用作佐剂，即本发明的化合物或组合物与一种或多种经选择用于刺激对一种或多种预定抗原的免疫反应的疫苗一起使用，所述疫苗包含灭活或减毒细菌或病毒，例如包含表达并分泌gm-csf、ccl-20、ccl3、il-12p70、flt-3配体、细胞因子中一个或多个的灭活肿瘤细胞。
[0210]
药物组合
[0211]
鉴于本发明化合物的有利药理学活性，其除了单独可用于上述提及的治疗用途或方法外，还可以与至少一种其他治疗剂或疗法联合使用以提供进一步的治疗益处。
[0212]
由此，本发明另一方面还提供了药物组合，包含本文所述的环二核苷酸化合物、其立体异构体、互变异构体、稳定的同位素变体、药学上可接受的盐、前药或溶剂合物或其药物组合物、以及至少一种其他治疗剂，或由二者组成。
[0213]
另一方面，本发明提供药物组合物，其包含本文所述的药物组合和一种或多种药学可接受的赋形剂。
[0214]
另一方面，本发明提供包含本文所述的药物组合或包含其的药物组合物用于治疗或预防疾病的用途，或在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，所述疾病包括过度增殖性疾病、病毒感染或与sting相关或由其介导的疾病、更具体地炎症、变应性或自身免疫疾病、感染性疾病或癌症。在优选的实施方案中，所述用途涉及的疾病是肿瘤或病毒感染。
[0215]
另一方面，本发明还提供了治疗方法，其中将本发明的化合物与一种过多种其他治疗剂一起施用。
[0216]
针对本发明的药物组合及包含其的药物组合物的用途而言的炎症、自身免疫疾病、过度增殖性疾病和病毒感染如上文对本发明的用途和方法所述。
[0217]
本发明的化合物还可以与手术、辐射治疗、移植(例如干细胞移植、骨髓移植)、免疫肿瘤药剂等联合施用。
[0218]
与本发明组合使用的其他治疗剂可以与本发明的化合物通过相同或不同的施用途径同时、分别或依次地进行施用。所述其他治疗剂可以与本发明化合物在单一药物组合物中共同施用，或与本发明化合物处于不同的离散单元中分别施用，例如组合产品，优选为药盒形式，当分别施用时可以同时或相继进行，所述相继施用在时间上可以是接近或隔远的。它们可以由相同或不同的制造商制备和/或配制。而且，本发明的化合物和其他治疗剂可以(i)在将组合产品发送给医师之前(例如在包含本发明的化合物和另外的药物的药盒的情形中)；(ii)在临施用前由医师自身(或在医师指导下)；(iii)由患者自身、例如在本发明的化合物和其他治疗剂的依次施用期间一起加入组合治疗中。
[0219]
因此，另一方面，本发明还提供了药盒，其包含两种或多种单独的药物组合物，其中至少一种包含本发明的环二核苷酸化合物、其立体异构体、互变异构体、稳定的同位素变体、药学上可接受的盐、前药或溶剂合物，其余共同存在的药物组合物包含至少一种其他治疗剂，以及分别容纳所述组合物的装置，如容器、分装瓶或分立的箔包装，例如用于包装片剂、胶囊等的泡罩包装。本发明的药盒特别适用于施用不同的剂型，如口服剂型和胃肠外剂型，或者适合于以不同的剂量间隔施用不同的组合物。
[0220]
所述其他治疗剂可以是一种或多种另外的本发明化合物，或可以是与本发明化合物相容即不会相互不利影响、或具有互补活性或另外活性的第二种或另外的(例如第三种)治疗剂。
[0221]
在具体的实施方案中，可以与本发明化合物组合使用的其他治疗剂包括但不限于疫苗、佐剂、免疫检查点抑制剂、t细胞受体激动剂、tlr激动剂、治疗性抗体、脂质、脂质体、化疗剂、免疫调节细胞系等。
[0222]
在一个具体的实施方案中，与本发明化合物组合使用的佐剂由于其性质可用于刺
激或以其他方式利用免疫系统对存在于肿瘤细胞上的癌症抗原起反应，包括但不限于脂质、脂质体、诱导先天免疫的灭火细菌、介导先天免疫活化的化合物等。
[0223]
在一个具体的实施方案中，与本发明化合物组合使用的免疫检查点抑制剂例如选自ctla-4通路拮抗剂、pd-1通路拮抗剂、tim-3通路拮抗剂、vista通路拮抗剂、btla通路拮抗剂、lag-3通路拮抗剂或tigit通路拮抗剂。
[0224]
在一个具体的实施方案中，与本发明化合物组合使用的t细胞受体激动剂包括但不限于cd28激动剂、ox40激动剂、gitr激动剂、cd137激动剂、cd27 激动剂或hvem激动剂。
[0225]
在一个具体的实施方案中，与本发明化合物组合使用的tlr激动剂包括但不限于pam3cys、cfa、malp2、pam2cys、fsl-1、hib-ompc、聚腺苷-聚尿苷酸(聚au)、lps、细菌鞭毛蛋白、单磷酰基脂质a(mpl)、咪喹莫特、雷希莫特、洛索立宾等。
[0226]
在一个具体的实施方案中，与本发明化合物组合使用的化疗剂包括但不限于烷化抗肿瘤药、基于铂的抗肿瘤药、抗代谢药、抗微管剂、抗有丝分裂剂、拓扑异构酶抑制剂以及抗肿瘤抗生素等。
[0227]
在一个具体的实施方案中，与本发明化合物组合使用的治疗性抗体包括但不限于muromonab-cd3、infliximab和adalimumab omalizumabdaclizumabrituximab(traderituximab(trade)、ibritumomab(trade)、tositumomab cetuximabtrastuzumabalemtuzumab lym-1ipilimumabvitaxin、bevacizumab abciximab其他可联合使用的治疗性抗体包括催乳素受体抑制剂、her3抑制剂、egfr2和/或egfr4抑制剂、m-csf抑制剂、抗april 抗体或抗sirpa或抗cd47抗体。
[0228]
在其他实施方案中，本发明化合物还可以与pkc抑制剂、bcr-abl抑制剂、hsp90抑制剂、pi3k和/或mtor的抑制剂、fgfr抑制剂、细胞色素p450 的抑制剂hdm2抑制剂、芳香酶抑制剂、p53和/或p53/mdm2相互作用抑制剂或或csf-1r酪氨酸激酶抑制剂组合使用。
[0229]
上述各类治疗剂的实例以及其他可与本发明化合物联合使用的治疗剂的实例可参见wo2016/145102以及wo2018/060323，其相应内容在此并入本文。
[0230]
对于上述本发明化合物、药物组合物、方法、用途、药物组合及药盒而言，优选上文所述各个优选实施方案中的本发明环二核苷酸化合物、其立体异构体、互变异构体、稳定的同位素变体、药学上可接受的盐、前药或溶剂合物或其药物组合物，更优选具体实施方案中所定义的化合物，即实施例1-26化合物，最优选在活性实施例中显示优异活性的那些化合物。
[0231]
对于上述本发明化合物、药物组合物、方法、用途、药物组合及药盒而言，优选使用本文所定义的环二核苷酸化合物的游离形式或药学可接受的盐或前药，优选本发明所定义的基本上纯的环二核苷酸化合物的游离形式或药学可接受的盐或前药。
[0232]
对于上述本发明的治疗用途和方法，优选使用或治疗的对象为哺乳动物，优选人。
[0233]
当本文描述药物或其药学上可接受的盐的剂量时，应理解，该剂量基于游离碱的重量，不包括其任何水合物或溶剂化物，除非另有说明。
[0234]
本发明化合物的制备方法
[0235]
通用合成方法
[0236]
本发明的化合物、其立体异构体、互变异构体、稳定的同位素变体、药学上可接受的盐或溶剂合物可以通过有机合成领域众所周知的多种方法制备，包括下文给出的方法、实施例中给出的方法或本领域技术人员理解的与之类似的方法制备。
[0237]
下文举例说明合成本发明化合物的通用合成方案。对于各反应步骤而言，适当的反应条件是本领域技术人员已知的或可以常规确定的。具体地，用于合成本发明的化合物的方法步骤可以在本身己知的反应条件(包括具体提及的那些条件)下、在不存在或通常在存在溶剂或稀释剂(包括例如对所用试剂而言是惰性的且可溶解所用试剂的溶剂或稀释剂)的情况下、在不存在或存在催化剂、缩合剂或中和剂(例如离子交换剂，如阳离子交换剂，例如h+形式)的情况下、根据反应和/或反应物的性质在降低的、正常的或升高的温度(例如约-100℃至约190℃，包括例如约-78℃至约150℃，例如约0℃至约125℃、室温、-20至40℃或回流温度)下、在大气压力下或在密闭容器中、当适宜时在加压下、和/或在惰性气氛例如氧气或氮气气氛下进行。
[0238]
在制备这些化合物中使用的原料和试剂通常可商购获得，或者可以通过下文的方法、与下文给出的方法类似的方法或本领域已知的方法制得。如果需要，合成反应流程中的原料和中间体可以采用常规技术进行分离和纯化，所述技术包括但不限于过滤、蒸馏、结晶、色谱法等。所述材料可以采用包括物理常数和波谱数据在内的常规方法表征。
[0239]
除非在方法的描述中另有说明，否则适用于任何特定反应的溶剂包括：具体提及的那些溶剂，或者例如水；酯类，如低级脂肪酸低级烷基酯，例如乙酸乙酯；醚类，如脂肪族醚，例如乙醚，或环状醚，例如四氢呋喃或二恶烷；液体芳族烃类，如苯或甲苯；醇类，如甲醇、乙醇或1-或2-丙醇类，如乙腈；卤化烃类，如二氯甲烷或氯仿；酰胺类，如n，n-二甲基甲酰胺或n，n-二甲基乙酰胺；碱类，如杂环氮碱类，例如吡啶；羧酸酐类，如低级脂肪链羧酸酐，例如乙酸酐；环状、直链或支链烃类，如环己烷、己烷或异戊烷；或这些溶剂的混合物，例如水溶液。该类溶剂混合物也可用于后处理，例如通过色谱法或分配进行的后处理。
[0240]
本领域技术人员能认识到式i化合物中存在立体中心。在反应的所有阶段，所形成的异构体的混合物可被分离成单个异构体，例如非对映异构体或对映异构体，或者分离成任何所需的异构体混合物，例如外消旋物或非对映异构体的混合物，参见例如e.l.eliel，s.h.wilen和l.n.mander的
″
stereochemistry oforganic compounds
″
(wiley-interscience，1994)。
[0241]
以下流程1举例说明了可用于制备本文所定义的式ii化合物及其各个具体实施方式的一种通用合成路线。以下流程中的通式的各变量具有与本文所定义化合物或其各个具体实施方式中相同的含义，另有说明除外。
[0242]
流程1
[0243][0244]
其中p1和p2是合适的羟基保护基，p3和p4是适合的羟基或氨基保护基，包括但不限于tbs(叔丁基二甲基硅烷基)、dmtr(双(4-甲氧基苯基)苯甲基)、bz(苯甲酰基)、
i-buco(异丁酰基)。本发明化合物合成流程中所用脱保护在酸性条件(包括但不限于如醋酸/水、三氟醋酸/水等)、碱性条件(包括但不限于如氨水、氨/甲醇溶液等)或者含氟负离子化合物(包括但不限于如四丁基氟化铵、三乙胺三氢氟酸盐等)存在条件下进行。
[0245]
流程2举例说明流程1中的式a化合物和式c的合成路线，以及其中所进一步使用的中间体的合成。
[0246]
流程2
[0247][0248]
流程3举例说明当式h化合物是如下式h-1化合物(吉西他滨前药 ly2334737)时的合成路线。
[0249]
流程3
[0250]
[0251]
流程4～7举例说明流程1中的式b化合物的合成路线，以及其中所进一步使用的中间体的合成。
[0252]
流程4
[0253][0254]
流程5
[0255][0256]
流程6
[0257][0258]
流程7
[0259][0260]
流程8举例说明流程1中的式d化合物的合成路线。
[0261]
流程8
[0262][0263]
具体地，本发明提供上述本发明化合物的制备方法，其包括：
[0264]
将式a化合物
[0265][0266]
其中b1、r1、r1’
具有上文对本发明式(ii)化合物或其各个具体实施方式所定义的含义；p1为适合的羟基保护基，例如但不限于tbs(叔丁基二甲基硅烷基)、 dmtr(双(4-甲氧基苯基)苯甲基)、bz(苯甲酰基)、
i-buco(异丁酰基)；
[0267]
与式b化合物在碱、例如dbu存在下反应，
[0268][0269]
其中b2、r2、r2’
具有上文对本发明式(ii)化合物或其各个具体实施方式所定义的含义；p2为适合的羟基保护基，p3和p4各自为适合的羟基或氨基保护基，例如但不限于tbs(叔丁基二甲基硅烷基)、dmtr(双(4-甲氧基苯基)苯甲基)、bz(苯甲酰基)、
i-buco(异丁酰基)；
[0270]
或者将式c化合物
[0271][0272]
其中b1、r1、r1’
和p1如以上对式a化合物所定义；
[0273]
与式d化合物在碱、例如dbu存在下反应，
[0274][0275]
其中b2、r2、r2’
、p2、p3和p4如以上对式b化合物所定义；
[0276]
得到式e化合物，
[0277][0278]
将以上式e化合物例如在三氟醋酸/水、四丁基氟化铵或者三乙胺三氢氟酸盐条件
下选择性的脱保护，得到式f化合物
[0279][0280]
其中各个基团具有以上所定义的含义；
[0281]
a)当r2′
＝-o(h)，保护基p3为苯甲酰基时，将式f化合物与(-)-psi试剂在碱、例如dbu存在下关环，得到环二核苷式g化合物
[0282][0283]
然后在氨水或者氨甲醇溶液中脱苯甲酰基保护，得到环二核苷式ii化合物，
[0284][0285]
其中r2′
＝-o(h)，其余各个基团具有上文对式ii化合物或其各个具体实施方式所定义的含义；
[0286]
或者b)当r2′
＝-f或者-h的时候，将式f化合物与(-)-psi试剂在碱、例如dbu 存在下关环，得到环二核苷式ii化合物
[0287][0288]
其中r2′
＝-f或者-h，其余各个基团具有上文对式ii化合物或其各个具体实施方式所定义的含义。
[0289]
式a化合物和式c化合物可如下制备：
[0290]
将式h化合物在碱、例如咪唑存在下选择性的保护伯醇，
[0291][0292]
得到式c化合物
[0293][0294]
将以上式c化合物与(+)-psi试剂在碱、例如dbu存在下反应，得到式a化合物，
[0295][0296]
其中b1、r1、r1’
以及p1如上对式a化合物所定义。
[0297]
其中当式h化合物为如下式h-1化合物(吉西他滨前药ly2334737)时，
[0298][0299]
其通过式h-1-1化合物与2-丙基戊酸制备得到，
[0300][0301]
式b化合物可如下制备为式b-1形式：
[0302]
将式h化合物在碱、例如咪唑存在下保护两个羟基，
[0303][0304]
得到式b-1-1化合物
[0305][0306]
将式b-1-1化合物在例如三氟醋酸/水条件下选择性脱除伯醇上的保护基，得到式b-1化合物
[0307][0308]
其中b2、r2、r2’
、p2如以上对式b化合物所定义。
[0309]
式b化合物还可如下制备为式b-2形式：
[0310]
将式c化合物在碱、例如dbu/吡啶存在下进一步保护仲醇，
[0311][0312]
得到式b-2-1化合物
[0313][0314]
将式b-2-1化合物在例如醋酸/水条件下选择性脱除伯醇上的保护基，得到式b
‑ꢀ
2化合物，
[0315][0316]
其中b2、r2、r2’
、p1、p2如以上对式a或式b化合物所定义。
[0317]
式b化合物还可如下制备为式b-3形式：
[0318]
将式b-3-1化合物在碱、例如咪唑存在下选择性保护伯醇和一个仲醇，
[0319]
[0320]
得到式b-3-2化合物，
[0321][0322]
将上式b-3-2化合物在碱、例如n-甲基咪唑存在下使用保护基、例如苯甲酰氯与其中未保护的仲醇和碱基上的氨基反应，得到式b-3-3化合物
[0323][0324]
将式b-3-3化合物在例如三氟醋酸/水条件下选择性脱除伯醇上的保护基，得到式b-3化合物，
[0325][0326]
其中b2、r2、r2’
、p1、p2和p3如上文对式a或式b化合物所定义。
[0327]
式b化合物还可如下制备为式b-4形式：
[0328]
将式b-4-1化合物在碱、例如n-甲基咪唑存在下使用保护基、例如苯甲酰氯与其中未保护的仲醇反应，
[0329][0330]
得到式b-4-2化合物，
[0331][0332]
将式b-4-2化合物在例如醋酸/水条件下选择性脱除伯醇上的保护基，得到式b
‑ꢀ
4化合物
[0333][0334]
其中b2、r2、r2’
、p1、p2和p4如上文对式a或式b化合物所定义。
[0335]
式d化合物可如下制备：
[0336]
将式b化合物与(-)-psi试剂在碱、例如dbu存在下反应，
[0337][0338]
得到式d化合物
[0339][0340]
其中b2、r2、r2’
、p2、p3以及p4如上文对式b化合物所定义。
[0341]
以下流程9举例说明了可用于制备本文所定义的式(i-b)、(ii-b)、(iii-b)、(iv
‑ꢀ
b)化合物及其各个具体实施方式的一种通用合成路线。以下流程中的通式的各变量具有与本文所定义化合物或其各个具体实施方式中相同的含义，另有说明除外。
[0342]
流程9
[0343][0344]
其中x各自独立地为羟基或者巯基；r1、r1’
、b1和b2各自如上文对式(i-b)、(ii
‑ꢀ
b)、(iii-b)、(iv-b)及其各个子通式及具体实施方式所定义；p1和p2是合适的羟基保护基，p3和p4是适合的羟基或氨基保护基，包括但不限于tbs(叔丁基二甲基硅烷基)、dmtr(双(4-甲氧基苯基)苯甲基)、bz(苯甲酰基)、
i-buco(异丁酰基)。 p5是适合的磷酸/磷酸酯上的羟基或巯基保护基，包括但不限于腈乙基。
[0345]
本发明化合物的上述合成流程中所用脱保护在酸性条件(包括但不限于如醋酸/水、三氟醋酸/水等)、碱性条件(包括但不限于如氨水、氨/甲醇溶液、甲胺/乙醇溶液、氢氧化锂等)或者含氟负离子化合物(包括但不限于如四丁基氟化铵、三乙胺三氢氟酸盐、氟化铵等)存在条件下进行。本发明化合物合成流程中所用氧化条件在包括但不限于碘存在下进行，硫化条件在包括并不限于3h-1，2-苯并二磺酚-3-酮存在下进行。
[0346]
流程10举例说明流程9中的式j化合物的合成路线，以及其中所进一步使用的中间体的合成。
[0347]
流程10
[0348][0349]
流程11举例说明式k化合物的合成路线，以及其中所进一步使用的中间体的合成。
[0350]
流程11
[0351][0352]
具体地，本发明提供上述本发明化合物的制备方法，其包括：
[0353]
将式j化合物
[0354][0355]
其中b1、r1、r1’
具有上文对本发明式(i-b)、(ii-b)、(iii-b)、(iv-b)化合物或其各个具体实施方式所定义的含义；p3为适合的羟基保护基，例如但不限于tbs(叔丁基二甲基硅烷基)、dmtr(双(4-甲氧基苯基)苯甲基)、bz(苯甲酰基)、
i-buco(异丁酰基)，
[0356]
与式k化合物在碱(例如dbu)存在下反应，
[0357][0358]
其中b2具有上文对本发明式(i-b)、(ii-b)、(iii-b)、(iv-b)化合物或其各个具体实施方式所定义的含义；p1、p2为适合的羟基保护基，p4为适合的羟基或氨基保护基，例如但不限于tbs(叔丁基二甲基硅烷基)、dmtr(双(4-甲氧基苯基)苯甲基)、bz(苯甲酰基)、
i-buco(异丁酰基)，
[0359]
或者将式j化合物与式l化合物在四唑存在下反应，并经氧化或者硫化，其中氧化条件包括但不限于使用碘、叔丁基过氧化氢等，硫化条件包括但不限于使用n，n-二甲基-n
’‑
(3-硫代-3h-1，2，4-二噻唑-5-基)甲咪(ddtt)、3h-1，2-苯并二磺酚-3-酮等；保护基团的引入和脱除根据本领域技术人员熟知的标准方法进行，
[0360][0361]
其中b2、p1、p2和p4如以上对式k化合物所定义；
[0362]
得到式m化合物，
[0363][0364]
其中x为oh或sh，p5是适合的磷酸/磷酸酯上的羟基或巯基保护基，例如但不限于腈乙基；
[0365]
将以上式m化合物例如在氢氧化锂条件下选择性的脱保护，得到式n化合物
[0366][0367]
其中各个基团具有以上所定义的含义；
[0368]
a)将式n化合物与(+)-psi试剂或(+)-psi试剂在碱、例如dbu存在下反应，得到式o化合物，
[0369][0370]
然后在醋酸/水溶液中脱p1(例如dmtr)保护，得到式p化合物，
[0371][0372]
将式p化合物在碱、例如dbu存在下关环，得到环二核苷式q化合物，
[0373][0374]
然后在氟化铵等条件下脱p4(例如tbs)保护，得到式(i-b)、(ii-b)、(iii-b)或(iv
‑ꢀ
b)的环二核苷化合物，其中r2为oh且r2’
为h，
[0375][0376]
其中各个基团具有以上所定义的含义；
[0377]
b)或者将式n化合物与亚磷酸二苯酯在碱、例如dbu存在下反应，得到式r化合物，
[0378][0379]
然后在醋酸/水溶液中脱p1(例如dmtr)保护，得到式s化合物，
[0380][0381]
将式s化合物在活化试剂、例如特戊酰氯存在下关环，并经氧化或者硫化，得到式q环二核苷化合物
[0382][0383]
然后在氟化铵等条件下脱p4(例如tbs)保护，得到式(i-b)、(ii-b)、(iii-b)或(iv
‑ꢀ
b)的环二核苷化合物，其中r2为oh且r2’
为h，
[0384][0385]
其中各个基团具有上文所定义的含义。
[0386]
式j化合物可如下制备：
[0387]
将式c化合物在碱、例如n-甲基咪唑存在下保护仲醇，
[0388][0389]
得到式j-1化合物，
[0390][0391]
将以上式j-1化合物选择性脱保护，得到式j化合物，
[0392][0393]
其中各个基团如上文所定义。
[0394]
式k化合物可如下制备：
[0395]
将式k-1化合物与(+)-psi试剂在碱、例如dbu存在下反应，
[0396][0397]
得到式k化合物
[0398][0399]
其中各个基团如上文所定义。
[0400]
以上合成方法和流程中所用的实验材料和试剂，如无特别说明，均可从市售渠道
获得、依据现有技术的方法制得或根据与本技术公开的类似的方法制得。以上合成方法和流程中所用的合成条件，如无特别说明，可由本领域技术人员常规确定。
[0401]
本发明还涉及如下制备方法：其中将可在本文所述各制备方法和流程中的任何步骤以中间体形式获得的化合物，用作起始材料并且进行剩余的方法步骤，或者其中起始材料在反应条件下原位形成或以衍生物的形式例如以被保护的形式或盐形式使用，或者可按照本发明的方法获得的化合物在所述方法条件下生成并且被进一步原位处理。
实施例
[0402]
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。需要说明的是，下述实施例不能作为对本发明保护范围的限制。
[0403]
除非结构式明显存在错误，否则当本发明的任意化合物的化学名称与所给出的结构式不一致时，以结构式为准。
[0404]
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照这类反应的常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得、依据现有技术的方法制得或根据与本技术公开的类似的方法制得。
[0405]
除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数；液体的比为体积比；除非另有说明，所有温度皆以摄氏度给出。
[0406]
在下列实施例中，1h nmr谱
31
p nmr谱通常是用bruker 400mhz nmr 和500mhz nmr核磁共振仪记录，化学位移以δ(ppm)表示；质谱是用agilent1290液相色谱+6120b质谱lcms液质联用仪记录。硅胶柱纯化采用biotageselektsel-2sv或者iso-1sv进行；制备型液相色谱纯化采用gilson 281进行 (柱：waters xbridge 19x250mm，5μm或welch c18，21.2x250mm，10μm。流动相：a：水(10mm nh4hco3或0.05％甲酸)，b：乙腈(或含0.05％甲酸)。流速：20-30ml/min。检测波长：214nm/254nm)，或另有说明。
[0407]
以下合成实施例中使用如下缩写，未列出的各个缩写具有本领域技术人员通常理解的含义。
[0408]
缩写列表
[0409]
cdcl3ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
氘代氯仿
[0410]
dmso-d6ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
氘代二甲基亚砜
[0411]
mhz
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
兆赫兹
[0412]
ms-esi
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
电喷雾质谱
[0413]
dbu
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯
[0414]
dmf
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
n，n-二甲基甲酰胺
[0415]
cdi
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
n，n
’‑
羰基二咪唑
[0416]
tmscl
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
三甲基氯硅烷
[0417]
tfa
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
三氟醋酸
[0418]
thf
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
四氢呋喃
[0419]
h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
水
[0420]
hoac
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
醋酸
[0421]
bzcl
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
苯甲酰氯
[0422]
ifn
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
干扰素
[0423]
fbs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
胎牛血清
[0424]
pbs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
磷酸盐缓冲溶液
[0425]
elisa
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
酶联免疫吸附测定
[0426]
(+)-psi试剂
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(2r，3ar，6s，7ar)-3a-甲基-2-((全氟苯基) 硫基)-6-(丙基-1-烯-2-基)六氢苯并 [d][1，3，2]氧硫磷杂环戊烷-2-硫化物) (cas：2245335-71-9)
[0427][0428]
(-)-psi试剂
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(2s，3as，6r，7as)-3a-甲基-2-((全氟苯基) 硫基)-6-(丙基-1-烯-2-基)六氢苯并 [d][1，3，2]氧硫磷杂环戊烷-2-硫化物 (cas：2245335-70-8)
[0429][0430]
合成实施例
[0431]
中间体1的制备：2-氯-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷
[0432][0433]
向2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷(2.50g，8.25mmol)的dmf溶液(15ml)中依次加入咪唑(1.12g，16.5mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(1.31g，8.66mmol)，所得混合物在20-25℃搅拌16小时。将反应混合液倒入水(150ml)中，用乙酸乙酯萃取两次(每次100ml)。合并有机相，饱和食盐水洗涤两次(每次100ml)后用无水硫酸钠干燥。浓缩得到的粗产品用硅胶柱纯化，石油醚∶乙酸乙酯(2∶3)洗脱，得到白色固体(2.53g)。
[0434]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.18(s，1h)，7.89(brs，2h)，6.33(dd，j＝12.0，4.8 hz，1h)，6.00(d，j＝4.8hz，1h)，5.28(dt，j＝52，4.8hz，1h)，4.50-4.30(m，1h)，3.98-3.73(m，3h)，0.89(s，9h)，0.07(s，6h)。
[0435]
中间体2的制备：(2s，3ar，6s，7ar)-2-((2r，3r，4s，5r)-5-(6-氨基-2-氯-9h-嘌呤-9
‑ꢀ
基)-2-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-4-氟四氢呋喃-3-基)氧基)-3a-甲基-6
‑ꢀ
(异丙基-1-烯-2-基)六氢化苯并[d][1，3，2]氧硫磷杂环戊烷2-硫化物
[0436][0437]
向0℃的中间体1(1.00g，2.40mmol)和(+)-psi试剂(1.39g，3.12mmol)的四氢呋喃溶液(10ml)中加入1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯(474mg，3.12mmol)，所得混合物在0-5℃搅
6.8hz，1h)，6.14(t，j＝7.6hz，1h)，5.75(d，j＝7.6hz，1h)，4.15-4.02(m，1h)，3.98
‑ꢀ
3.73(m，3h)，0.90(s，9h)，0.09(s，6h)。ms-esi[m+h]
+
：378.2。
[0451]
中间体6的制备：4-氨基-1-((2r，4r，5r)-5-((叔丁基二甲基硅烷基(氧基)甲基)-3，3
‑ꢀ
二氟-4-(((2s，3ar，6s，7ar)-3a-甲基-6-(丙基-1-烯-2-基)-2-硫代六氢苯并[d][1，3，2] 氧硫磷杂环戊烷-2-基)氧基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2(1h)-酮
[0452][0453]
中间体6是采用中间体2的路线、由中间体5和(+)-psi试剂得到。
[0454]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.73(d，j＝8.0hz，1h)，6.34(t，j＝8.0hz，1h)， 6.21(d，j＝8.0hz，1h)，5.36-5.24(m，1h)，5.04(s，1h)，4.87(s，1h)，4.55-4.43(m， 1h)，4.17-4.06(m，1h)，4.05-3.86(m，2h)，2.66-2.52(m，1h)，2.30-2.05(m，2h)，2.02
‑ꢀ
1.80(m，3h)，1.80-1.62(m，7h)，0.92(s，9h)，0.13(s，3h)，0.12(s，3h)。
31
p nmr(162mhz，cdcl3)δ103.0。ms-esi[m+h]
+
：624.2。
[0455]
中间体7的制备：n4-(2-丙基戊酰基)-2
’‑
脱氧-2’，2
’‑
二氟胞苷
[0456][0457]
向0℃的2
’‑
脱氧-2’，2
’‑
二氟胞苷盐酸盐(2.00g，6.67mmol)的吡啶溶液(20 ml)中逐滴加入三甲基氯硅烷(3.61g，33.4mmol)，所得混合物在0-5℃搅拌2小时。同时，向2-丙基戊酸(1.06g，7.33mmol)的乙腈溶液(20ml)中分批加入羰基二咪唑(1.19g，7.33mmol)，所得混合物在25℃搅拌2小时。然后，将所得的乙腈混合液逐滴加入到之前0℃的吡啶混合液中，所得混合物在45℃搅拌16小时。向以上混合液中加入乙醇(20ml)，45℃搅拌0.5小时。然后向以上混合液中加入水(20ml)，45℃搅拌1小时。将所得反应液旋干后用水(50ml)稀释。用 2n的盐酸水溶液将以上混合液的ph调至2-3，用乙酸乙酯萃取两次(每次50 ml)。合并有机相，用水洗涤两次(每次50ml)后用无水硫酸钠干燥。浓缩得到的粗产品用硅胶柱纯化，石油醚∶乙酸乙酯(2∶3)洗脱，得到白色固体(1.20g)。
[0458]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ11.06(brs，1h)，8.25(d，j＝8.0hz，1h)，7.33(d，j ＝8.0hz，1h)，6.32(d，j＝8.0hz，1h)，6.17(t，j＝8.0hz，1h)，5.32-5.25(m，1h)，4.25-4.10(m，1h)，3.97-3.75(m，2h)，3.70-3.58(m，1h)，2.70-2.55(m，1h)，1.56-1.42 (m，2h)，1.38-1.10(m，6h)，0.85(t，j＝7.6hz，6h)。ms-esi[m+h]
+
：390.2。
[0459]
中间体8的制备：n4-(2-丙基戊酰基)-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧-2’，2
’‑
二氟胞苷
[0460][0461]
中间体8是采用中间体1的路线、由中间体7得到。
[0462]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ9.07(brs，1h)，8.27(brs，1h)，7.51(d，j＝8.0hz，1h)， 6.45-6.30(m，1h)，4.46-4.33(m，1h)，4.12-4.00(m，2h)，3.91(dd，j＝8.0，2.4hz， 1h)，2.25-2.12(m，1h)，1.71-1.60(m，2h)，1.56-1.42(m，2h)，1.40-1.25(m，4h)，1.05
‑ꢀ
0.85(m，15h)，0.13(s，6h)。
[0463]
中间体9的制备：n-(1-((2r，4r，5r)-5-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-3，3-二氟-4-(((2s，3ar，6s，7ar)-3a-甲基-6-(丙基-1-烯-2-基)-2-硫代六氢苯并[d][1，3，2]氧硫磷杂环戊烷-2-基)氧基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基)-2-丙基戊酰胺
[0464][0465]
中间体9是采用中间体2的路线、由中间体8和(+)-psi试剂得到。
[0466]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ9.63(brs，1h)，8.29-8.15(m，1h)，7.60-7.48(m，1h)， 6.48-6.39(m，1h)，5.40-5.25(m，1h)，5.04(s，1h)，4.88(s，1h)，4.55-4.45(m，1h)， 4.28-4.05(m，1h)，4.00-3.88(m，2h)，2.65-2.55(m，1h)，2.46-2.35(m，1h)，2.33-2.23 (m，1h)，2.20-1.80(m，5h)，1.79-1.60(m，8h)，1.58-1.45(m，2h)，1.45-1.25(m，4h)， 0.98-0.85(m，15h)，0.15(d，j＝4.0hz，6h)。
[0467]
中间体10的制备：n6-双(4-甲氧基苯基)苯甲基-2-氯-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基 3
’‑
双(4-甲氧基苯基)苯甲基-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷
[0468][0469]
向中间体1(1.53g，3.67mmol)的吡啶溶液(10ml)中加入双(4-甲氧基苯基)苯甲基氯(1.49g，4.40mmol)，所得混合物25℃搅拌2小时。然后再依次加入双(4
‑ꢀ
甲氧基苯基)苯甲基氯(497mg，1.47mmol)和1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯(669mg， 4.40mmol)，所得混合物在20-25℃搅拌16小时。再依次加入双(4-甲氧基苯基) 苯甲基氯(1.49g，4.40mmol)和1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯(669mg，4.40mmol)，所得混合物在20-25℃搅拌24小时。将反应混合液浓缩后用乙酸乙酯(100ml) 稀释。有机相用饱和食盐水洗涤两次(每次100ml)后用无
水硫酸钠干燥。浓缩得到的粗产品用硅胶柱纯化，石油醚∶乙酸乙酯(5∶1)洗脱，得到白色固体(2.60g)。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.00(s，1h)，7.95(s，1h)，7.50-7.10(m，18h)，6.90
‑ꢀ
6.78(m，8h)，6.33-6.20(m，1h)，4.46-4.30(m，2h)，4.25-4.15(m，1h)，3.76-3.68(m， 12h)，3.55-3.49(m，2h)，0.76(s，9h)，-0.08(s，3h)，-0.11(s，3h)。
[0470]
中间体11的制备：n6-双(4-甲氧基苯基)苯甲基-2-氯-3
’‑
双(4-甲氧基苯基)苯甲基
ꢀ‑2’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷
[0471][0472]
向中间体10(2.60g，2.55mmol)的四氢呋喃溶液(15ml)中加入四丁基氟化铵 (1.33g，5.10mmol)，所得混合物25℃搅拌1小时。将反应混合液浓缩后用乙酸乙酯(30ml)稀释。有机相用水(30ml)洗涤后用无水硫酸钠干燥。浓缩得到的粗产品用硅胶柱纯化，石油醚∶乙酸乙酯(2∶3)洗脱，得到白色固体(1.20g)。
[0473]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.17(d，j＝2.4hz，1h)，7.97(s，1h)，7.50-7.10(m， 18h)，6.90-6.78(m，8h)，6.30-6.18(m，1h)，4.86(t，j＝6.0hz，1h)，4.30-4.10(m， 3h)，3.76-3.68(m，12h)，3.49-3.30(m，2h)。
[0474]
中间体12的制备：n6-双(4-甲氧基苯基)苯甲基-2-氯-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基 3
’‑
双(4-甲氧基苯基)苯甲基-2
’‑
脱氧腺苷
[0475][0476]
向中间体3(1.80g，4.51mmol)的吡啶溶液(10ml)中依次加入双(4-甲氧基苯基)苯甲基氯(3.81g，11.3mmol)和1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯(743mg，11.3 mmol)，所得混合物在20-25℃搅拌16小时。将反应混合液浓缩后倒入水(100 ml)中，用乙酸乙酯萃取两次(每次50ml)。合并有机相，饱和食盐水洗涤两次 (每次50ml)后用无水硫酸钠干燥。浓缩得到的粗产品用硅胶柱纯化，石油醚∶乙酸乙酯(3∶7)洗脱，得到白色固体(2.50g)。
[0477]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.19(s，1h)，7.83(s，1h)，7.50-7.10(m，18h)，6.95
‑ꢀ
6.78(m，8h)，6.28-6.18(m，1h)，4.36-4.28(m，1h)，4.00-3.88(m，1h)，3.80-3.65(m， 12h)，3.50-3.41(m，1h)，3.40-3.30(m，1h)，2.33-2.25(m，1h)，1.88-1.76(m，1h)， 0.71(s，9h)，-0.14(s，6h)。
[0478]
中间体13的制备：n6-双(4-甲氧基苯基)苯甲基-2-氯-3
’‑
双(4-甲氧基苯基)苯甲基
ꢀ‑2’‑
脱氧腺苷
[0479][0480]
中间体13是采用中间体11的路线、由中间体12得到。
[0481]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.32(s，1h)，7.87(s，1h)，7.50-7.10(m，18h)，6.95
‑ꢀ
6.77(m，8h)，6.24(t，j＝6.8hz，1h)，4.83(brs，1h)，4.39-4.28(m，1h)，3.85-3.65(m， 13h)，3.22-3.12(m，1h)，2.35-2.21(m，1h)，1.88-1.70(m，1h)。
[0482]
中间体14的制备：3
’‑5’‑
二-o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧-2’，2
’‑
二氟胞苷
[0483][0484]
向2
’‑
脱氧-2’，2
’‑
二氟胞苷盐酸盐(3.00g，10.0mmol)的dmf溶液(50ml)中依次加入咪唑(3.41g，50.0mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(4.53g，30.0mmol)，所得混合物在20-25℃搅拌2小时，然后60℃搅拌16小时。将反应混合液倒入乙酸乙酯(100ml)和水(100ml)的混合物中。分离有机相，依次用水(100ml)和饱和食盐水(100ml)洗涤后用无水硫酸钠干燥。浓缩得到的粗产品用硅胶柱纯化，用二氯甲烷∶甲醇(9∶2)洗脱，得到白色固体(2.70g)。
[0485]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.53(d，j＝7.6hz，1h)，7.40(brs，2h)，6.17(t，j＝ 8.0hz，1h)，5.78(d，j＝7.6hz，1h)，4.40-4.22(m，1h)，3.98-3.83(m，2h)，3.78-3.70 (m，1h)，1.00-0.75(m，18h)，0.15-0.00(m，12h)。
[0486]
中间体15的制备：3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧-2’，2
’‑
二氟胞苷
[0487][0488]
0℃下，将中间体14(1.00g，2.04mmol)溶于四氢呋喃溶液(10ml)、三氟乙酸(5ml)和水(5ml)的混合物中，在0-5℃搅拌2小时。将反应混合液的ph用饱和碳酸氢钠水溶液调至约9，然后倒入乙酸乙酯(50ml)和水(50ml)的混合物中。分离有机相，用饱和食盐水(50ml)洗涤后用无水硫酸钠干燥。浓缩得到的粗产品用硅胶柱纯化，用乙酸乙酯∶甲醇(17∶3)洗脱，得到白色固体(620mg)。
[0489]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.67(d，j＝7.6hz，1h)，7.50-7.35(m，2h)，6.14(t， j＝8.0hz，1h)，5.79(d，j＝7.6hz，1h)，5.26(d，j＝7.6hz，1h)，4.40-4.22(m，1h)， 3.86-3.72(m，2h)，3.68-3.50(m，1h)，0.88(s，9h)，0.11(s，3h)，0.10(s，3h)。ms-esi [m+h]
+
：378.2。
[0490]
中间体16的制备：n4-(2-丙基-戊酰基)-3
’‑5’‑
二-o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱
氧
ꢀ‑2’
，2
’‑
二氟胞苷
[0491][0492]
25℃下，向2-丙基戊酸(322mg，2.24mmol)的乙腈溶液(5ml)中加入羰基二咪唑(363mg，2.24mmol)，所得混合物在25℃搅拌2小时。所得混合物逐滴加入到0℃的中间体14(1.0g，2.03mmol)的吡啶(10ml)溶液中。所得混合物在45℃搅拌16小时，将所得反应液旋干后用水(20ml)稀释，用乙酸乙酯萃取两次(每次 30ml)。合并有机相，用水洗涤两次(每次50ml)后用无水硫酸钠干燥。浓缩得到的粗产品用硅胶柱纯化，用石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)，得到白色固体(430mg)。
[0493]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.09(d，j＝7.6hz，1h)，7.49(d，j＝7.6hz，1h)，6.33 (d，j＝10.0hz，1h)，4.39-4.29(m，1h)，4.02(d，j＝12.0hz，1h)，3.96(d，j＝7.6hz， 1h)，3.81(d，j＝11.2hz，1h)，2.50-2.30(m，1h)，1.49-1.44(m，2h)，1.33(q，j＝7.6 hz，6h)，0.99-0.80(m，24h)，0.13(s，9h)，0.10(s，3h)。ms-esi[m+h]
+
：619.4。
[0494]
中间体17的制备：n4-(2-丙基-戊酰基)-3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧-2’，2
’‑ꢀ
二氟胞苷
[0495][0496]
中间体17是采用中间体15的路线、由中间体16得到。
[0497]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.38(s，1h)，8.00(d，j＝7.6hz，1h)，7.50(d，j＝7.6 hz，1h)，6.25(t，j＝7.6hz，1h)，4.49-4.40(m，1h)，4.08(d，j＝12.4hz，1h)，4.02
‑ꢀ
3.90(m，1h)，3.88-3.75(m，1h)，2.51(s，1h)，2.40-2.30(m，1h)，1.75-1.55(m，2h)，1.52-1.41(m，2h)，1.38-1.28(m，4h)，0.95-0.85(m，15h)，0.14(d，j＝2.8hz，6h)。 ms-esi[m+h]
+
：504.2。
[0498]
中间体18：5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
叔丁基二甲基硅烷基-腺苷，和
[0499]
中间体19：5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-3
’‑
叔丁基二甲基硅烷基-腺苷
[0500]
向腺苷(3.35g，12.5mmol)的四氢呋喃溶液(40ml)中在室温(10℃)下依次加入三乙烯二胺(7.0g，62.5mmol)和硝酸银(5.08g，28.8mmol)。此混合物在室温 (10℃)下搅拌30min，然后加入叔丁基二甲基氯硅烷(4.71g，30mmol)，所得混合物在10℃搅拌16小时。将反应混合液通过硅藻土过滤，滤液用水(50ml)淬灭，然后乙酸乙酯萃取两次(每次50ml)。合并有机相，饱和食盐水洗涤两次(每次100ml)后用无水硫酸钠干燥。浓缩得到的粗产品用硅胶柱纯化，用石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)洗脱得到中间体18(1.0g，白色固体)。用乙酸乙酯洗脱，得到中间体 19(4.4g，白色固体)。
[0501]
中间体18：
[0502][0503]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.35(s，1h)，8.24(s，1h)，6.11(d，j＝4.8hz，1h)，5.72 (brs，2h)，4.64(t，j＝4.8hz，1h)，4.31-4.26(m，1h)，4.24-4.20(m，1h)，4.02(dd，j＝ 11.6，2.8hz，1h)，3.87(dd，j＝11.6，2.8hz，1h)，2.76(d，j＝3.6hz，1h)，0.96(s， 9h)，0.84(s，9h)，0.18-0.11(m，6h)，-0.05(s，3h)，-0.12(s，3h)。
[0504]
中间体19：
[0505][0506]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.35(s，1h)，8.10(s，1h)，6.03(d，j＝3.6hz，1h)，5.75 (brs，2h)，4.56(d，j＝1.6hz，1h)，4.12(d，j＝2.8hz，1h)，3.92(dd，j＝11.6，3.6hz， 1h)，3.77(dd，j＝11.2，2.8hz，1h)，3.31(brs，1h)，0.95(s，9h)，0.90(s，9h)，0.17(s， 6h)，0.06(s，3h)，-0.01(s，3h)。
[0507]
中间体20的制备：n4-苯甲酰基-2
’‑5’‑
二-o-叔丁基二甲基硅烷基-3
’‑
苯甲酰基
‑ꢀ
腺苷
[0508][0509]
向中间体18(500mg，1.01mmol)和n-甲基咪唑(248mg，3.03mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中在室温(25℃)下滴加入苯甲酰氯(354.4mg，2.52mmol)。所得的混合物液在室温下反应16小时。将反应液用水(20ml)淬灭，有机相分离，水相用二氯甲烷萃取两次(每次20ml)。有机相合并后用饱和食盐水洗涤一次(20 ml)，然后用无水硫酸钠干燥。浓缩得到的粗产品用硅胶柱纯化，用石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)洗脱，得到白色固体(400mg)。
[0510]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ9.36(s，1h)，8.85(s，1h)，8.48(s，1h)，8.15-8.10(m， 2h)，8.08-8.05(m，2h)，7.70-7.55(m，2h)，7.55-7.47(m，4h)，6.33(d，j＝6.0hz，1h)， 5.63-5.50(m，1h)，4.89(d，j＝1.2hz，1h)，4.48(d，j＝2.4hz，1h)，4.05(d，j＝2.4 hz，1h)，4.00(d，j＝2.4hz，1h)，0.99(s，9h)，0.65(s，9h)，0.19(d，j＝4.4hz，6h)，
ꢀ‑
0.10(s，3h)，-0.26(s，3h)。ms-esi[m+h]
+
：704.3。
[0511]
中间体21的制备：n4-苯甲酰基-2
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-3
’‑
苯甲酰基-腺苷
[0512][0513]
中间体21是采用中间体15的路线、由中间体20得到。
[0514]1h nmr(500mhz，cdcl3)δ8.86(s，1h)，8.17-8.09(m，3h)，8.08-8.03(m，2h)，7.66
ꢀ‑
7.60(m，2h)，7.55(t，j＝7.6hz，2h)，7.50(t，j＝7.6hz，2h)，5.97(d，j＝7.6hz， 1h)，5.75(d，j＝5.2hz，1h)，5.27(dd，j＝7.6，5.2hz，1h)，4.51(s，1h)，4.08-4.03 (m，1h)，3.93(d，j＝12.8hz，1h)，0.62(s，9h)，-0.10(s，3h)，-0.43(s，3h)。ms-esi [m+h]
+
：591.2。
[0515]
中间体22的制备：n4-苯甲酰基-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-3
’‑
叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
苯甲酰基-腺苷
[0516][0517]
中间体22是采用中间体20的路线、由中间体19和苯甲酰氯得到。
[0518]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ9.02(brs，1h)，8.83(s，1h)，8.41(s，1h)，8.08-7.99(m，4h)，7.64-7.49(m，4h)，7.47-7.39(m，2h)，6.54(d，j＝6.0hz，1h)，5.81(t，j＝5.6 hz，1h)，4.84(dd，j＝4.8，3.6hz，1h)，4.26(dd，j＝6.0，3.2hz，1h)，4.02(dd，j＝ 11.6，3.2hz，1h)，3.85(dd，j＝11.6，2.8hz，1h)，0.95(s，9h)，0.84(s，9h)，0.18-0.11 (m，6h)，0.03
‑‑
0.05(m，6h)。
[0519]
中间体23的制备：n4-苯甲酰基-3
’‑
叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
苯甲酰基-腺苷
[0520][0521]
中间体23是采用中间体15的路线、由中间体22得到。
[0522]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ9.08(brs，1h)，8.84(s，1h)，8.18(s，1h)，8.08-7.98(m，4h)，7.67-7.41(m，6h)，6.32(d，j＝7.6hz，1h)，6.01(dd，j＝7.6，5.2hz，1h)，4.94 (d，j＝5.2hz，1h)，4.35(d，j＝0.8hz，1h)，4.07(dd，j＝13.2，1.6hz，1h)，3.84(d， j＝12.4hz，1h)，0.89(s，9h)，0.11(s，3h)，0.00(s，3h)。
[0523]
中间体24的制备：n2-异丁酰基-5
’‑
o-双(4-甲氧基苯基)苯甲基-3
’‑
o-苯甲酰基
‑ꢀ2’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷
[0524][0525]
中间体24是采用中间体20的路线、由n2-异丁酰基-5
’‑
o-双(4-甲氧基苯基) 苯甲基-2
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷得到。ms-esi[m+h]
+
：874.3。
[0526]
中间体25的制备：n2-异丁酰基-3
’‑
o-苯甲酰基-2
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷
[0527][0528]
将中间体24(5.50g，6.30mmol)溶于冰醋酸(60ml)和水(10ml)的混合物中，在25℃搅拌2小时。反应混合液旋干后用乙酸乙酯共蒸两次(每次25ml)。粗产品用硅胶柱纯化，乙酸乙酯洗脱，得到白色固体(2.2g)。
[0529]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ12.15(brs，1h)，8.35(s，1h)，8.15-8.02(m，2h)，7.74 (s，1h)，7.68-7.56(m，1h)，7.55-7.42(m，2h)，5.80(d，j＝7.6hz，1h)，5.66(dd，j＝ 5.6，1.2hz，1h)，5.52(d，j＝9.2hz，1h)，4.98(dd，j＝7.2，5.6hz，1h)，4.45(d，j＝ 1.2hz，1h)，4.06-3.82(m，2h)，2.78-2.62(m，1h)，1.35-1.25(m，6h)，0.66(s，9h)，
‑ꢀ
0.09(s，3h)，-0.33(s，3h)。ms-esi[m+h]
+
：572.3。
[0530]
中间体26的制备：n2-异丁酰基-5
’‑
o-双(4-甲氧基苯基)苯甲基-3
’‑
叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
苯甲酰基-鸟苷
[0531][0532]
中间体26是采用中间体20的路线、由n2-异丁酰基-5
’‑
o-双(4-甲氧基苯基) 苯甲基-3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷得到。ms-esi[m+h]
+
：874.3。
[0533]
中间体27的制备：n2-异丁酰基-3
’‑
叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
苯甲酰基-鸟苷
[0534][0535]
中间体27是采用中间体25的路线、由中间体26得到。
[0536]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ12.06(brs，1h)，8.24(brs，1h)，8.01-7.96(m，2h)，7.83 (s，1h)，7.62-7.55(m，1h)，7.43(d，j＝8.0hz，2h)，6.13(d，j＝7.2hz，1h)，5.81(dd， j＝
7.2，5.6hz，1h)，4.80(dd，j＝4.8，1.6hz，1h)，4.30-4.25(m，1h)，4.02(dd，j＝ 12.8，2.0hz，1h)，3.78(d，j＝12.4hz，1h)，2.71-2.60(m，1h)，1.30-1.28(m，6h)， 0.83(s，9h)，0.07(s，3h)，0.00(s，3h)。
[0537]
中间体28的制备：2
’‑5’‑
二-o-叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷
[0538][0539]
中间体28是采用中间体18的路线、由鸟嘌呤核苷得到。ms-esi [m+h]
+
：513.3。
[0540]
中间体29的制备：2
’‑5’‑
二-o-叔丁基二甲基硅烷基-3
’‑
苯甲酰基-鸟苷
[0541][0542]
中间体29是采用中间体20的路线、由中间体28得到。
[0543]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ12.04(brs，1h)，8.14-8.09(m，2h)，7.94(s，1h)，7.61 (t，j＝7.6hz，1h)，7.49(t，j＝7.6hz，2h)，6.09(s，2h)，6.00(d，j＝6.0hz，1h)，5.53 (s，1h)，4.76(t，j＝5.6hz，1h)，4.41(d，j＝2.8hz，1h)，4.01(d，j＝11.6hz，1h)， 3.93(dd，j＝11.6，2.4hz，1h)，0.97(s，9h)，0.70(s，9h)，0.16(d，j＝3.2hz，6h)，
‑ꢀ
0.09(s，3h)，-0.16(s，3h)。ms-esi[m-h]-：615.3。
[0544]
中间体30的制备：2
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-3
’‑
苯甲酰基-鸟苷
[0545][0546]
中间体30是采用中间体15的路线、由中间体29得到。
[0547]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.71(brs，1h)，8.05(d，j＝7.2hz，3h)，7.75-7.68 (m，1h)，7.59(t，j＝7.6hz，2h)，6.51(s，2h)，5.84(d，j＝7.6hz，1h)，5.58(dd，j＝ 5.6，1.6hz，1h)，5.42(t，j＝5.6hz，1h)，4.96(dd，j＝7.6，5.2hz，1h)，4.39-4.25(m， 1h)，4.20-4.00(m，1h)，0.57(s，9h)，-0.12(s，3h)，-0.29(s，3h)。ms-esi[m
‑ꢀ
h]-：501.3。
[0548]
中间体31的制备：3
’‑5’‑
二-o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟腺苷
[0549]
[0550]
向2
’‑
脱氧-2
’‑
氟腺苷(1.10g，4.09mmol)的dmf溶液(10ml)中加入咪唑(1.81 g，26.6mmol)和4-二甲氨基吡啶(50mg，0.41mmol)，然后加入叔丁基二甲基氯硅烷(2.16g，14.3mmol)，所得混合物在15-20℃搅拌16小时。将反应混合液倒入水(100ml)中，用乙酸乙酯萃取两次(每次100ml)。合并有机相，用饱和食盐水 (100ml)洗涤两次后用无水硫酸钠干燥。浓缩得到的粗产品用硅胶柱纯化，用石油醚∶乙酸乙酯(3∶2)洗脱，得到白色固体(1.90g)。
[0551]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.35(s，1h)，8.12(s，1h)，6.25(dd，j＝16.0，2.4hz， 1h)，5.66(brs，2h)，5.48-5.20(m，1h)，4.79-4.62(m，1h)，4.18-3.95(m，2h)，3.85
‑ꢀ
3.72(m，1h)，1.00-0.80(m，18h)，-0.05-0.18(m，12h).ms-esi[m+h]
+
：498.4。
[0552]
中间体32的制备：3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟腺苷
[0553][0554]
中间体31是采用中间体15的路线、由中间体31得到。
[0555]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.37(s，1h)，8.14(s，1h)，7.38(brs，2h)，6.22(dd， j＝16.4，3.6hz，1h)，5.70-5.40(m，1h)，5.29(t，j＝5.6hz，1h)，4.80-4.62(m，1h)， 4.02-3.90(m，1h)，3.79-3.68(m，1h)，3.63-3.48(m，1h)，0.90(s，9h)，0.14(s，3h)， 0.13(s，3h)。
[0556]
中间体33的制备：(2r，3as，6r，7as)-2-((2r，3r，4r，5r)-5-(6-氨基-9h-嘌呤-9-基)
‑ꢀ
3-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)-4-氟四氢呋喃-2-基)甲氧基)-3a-甲基-6-(丙基-1
‑ꢀ
烯-2-基)六氢化苯并[d][1，3，2]氧硫磷杂环戊烷2-硫化物
[0557][0558]
中间体33是采用中间体2的路线、由中间体32和(-)-psi试剂得到。
[0559]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.36(s，1h)，8.05(s，1h)，6.30-6.18(m，1h)，5.58(brs， 2h)，5.50-5.22(m，1h)，4.80-4.62(m，3h)，4.50-4.25(m，4h)，2.59-2.48(m，1h)，2.33
‑ꢀ
2.20(m，1h)，2.15-2.02(m，1h)，1.99-1.76(m，3h)，1.75-1.55(m，7h)，0.93(s，9h)， 0.19(s，3h)，0.15(s，3h)。
[0560]
中间体34的制备：3
’‑5’‑
二-o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-鸟苷
[0561]
[0562]
中间体34是采用中间体31的路线、由2
’‑
脱氧-2
’‑
氟鸟苷得到。
[0563]
1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.69(brs，1h)，7.84(s，1h)，6.52(brs，2h)，6.00 (d，j＝16.8hz，1h)，5.36(d，j＝52.0hz，1h)，4.62-4.45(m，1h)，3.98-3.86(m，2h)， 3.74(d，j＝11.6hz，1h)，0.93-0.85(m，18h)，0.20-0.00(m，12h)。ms-esi [m+h]
+
：515.3。
[0564]
中间体35的制备：3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-鸟苷
[0565][0566]
中间体35是采用中间体15的路线、由中间体34得到。
[0567]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.71(brs，1h)，7.97(s，1h)，6.56(s，2h)，5.36(dd， j＝52.5，5.0hz，1h)，5.20(s，1h)，4.52(dd，j＝12.6，6.4hz，1h)，3.96-3.89(m，1h)， 3.70(d，j＝12.0hz，1h)，0.89(s，9h)，0.12(s，6h)。ms-esi[m+h]
+
：401.2。
[0568]
中间体36的制备：2-氨基-9-((2r，3r，4r，5r)-4-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)-3-氟
ꢀ‑
5-((((2r，3as，6r，7as)-3a-甲基-6-(丙基-1-烯-2-基)-2-硫代六氢苯并[d][1，3，2]氧硫磷杂环戊烷-2-基)氧基)甲基)四氢呋喃-2-基)-1，9-二氢-6h-嘌呤-6-酮
[0569][0570]
中间体36是采用中间体2的路线、由中间体35和(-)-psi试剂在dmf中得到。ms-esi[m+h]
+
：646.4。
[0571]
中间体37的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧
ꢀ‑2’‑
氟-beta-腺苷]-(3’，5’)-[n6-双(4-甲氧基苯基)苯甲基-2-氯-3
’‑
双(4-甲氧基苯基) 苯甲基-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]
[0572][0573]
向中间体2(280mg，0.422mmol)和中间体11(383mg，0.422mmol)的乙腈溶液(3ml)中加入1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯(192mg，1.27mmol)，所得混合物在25℃搅拌1小时。将反应混合液用乙酸乙酯(25ml)稀释。有机相依次用水(25 ml)和饱和食盐水(25ml)洗涤后用无水硫酸钠干燥。浓缩得到的粗产品用硅胶柱纯化，用乙酸乙酯∶甲醇(7∶3)洗脱，得到白色固体(260mg)。
[0574]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.26(s，1h)，8.08(s，1h)，7.91(brs，3h)，7.45-7.10 (m，18h)，6.95-6.76(m，8h)，6.32-6.15(m，2h)，5.40-5.18(m，2h)，5.00-4.80(m，2h)， 4.40-4.02(m，3h)，3.85-3.62(m，15h)，0.84(s，9h)，0.01(s，6h)。
[0575]
中间体38的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧腺苷]-(3’，5’)-[n6-双(4-甲氧基苯基)苯甲基-2-氯-3
’‑
双(4-甲氧基苯基)苯甲基-2
’‑ꢀ
脱氧腺苷]
[0576][0577]
中间体38是采用中间体37的路线、由中间体4和中间体13在四氢呋喃和乙腈的混合溶液中得到。
[0578]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.68(s，1h)，8.22(s，1h)，7.82(brs，2h)，7.75(s， 1h)，7.42(d，j＝8.0hz，2h)，7.39-7.10(m，16h)，6.95-6.78(m，8h)，6.32-6.10(m， 2h)，4.90-4.80(m，1h)，4.43-4.36(m，1h)，4.15-4.08(m，1h)，3.85-3.40(m，17h)， 2.50-2.20(m，4h)，0.81(s，9h)，0.00(s，3h)，-0.02(s，3h)。
[0579]
中间体39的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧-2’，2
’‑ꢀ
二氟胞苷]-(3’，5’)-[3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧-2’，2
’‑
二氟胞苷]
[0580][0581]
中间体39是采用中间体37的路线、由中间体6和中间体15在四氢呋喃和乙腈的混合溶液中得到。
[0582]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ9.58(brs，1h)，7.79-7.60(m，2h)，7.48-7.25(m， 4h)，6.28-6.05(m，2h)，5.76(dd，j＝7.6，1.6hz，2h)，5.00-4.85(m，1h)，4.38-4.25 (m，1h)，4.15-3.80(m，6h)，0.95-0.80(m，18h)，0.18-0.00(m，12h)。
[0583]
中间体40的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-n4-(2-丙基戊酰基)-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧-2’，2
’‑
二氟胞苷]-(3’，5’)-[n4-(2-丙基戊酰基)-3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧-2’，2
’‑
二氟胞苷]
[0584][0585]
中间体40是采用中间体37的路线、由中间体17和中间体9得到。
[0586]1h nmr(500mhz，dmso-d6)δ11.07(brs，1h)，11.02(brs，1h)，8.32(d，j＝7.6hz， 1h)，8.24(d，j＝7.6hz，1h)，7.36-7.30(m，2h)，6.28-6.15(m，2h)，4.97(t，j＝10.4 hz，1h)，4.40-4.30(m，1h)，4.17(s，1h)，4.08(q，j＝9.1，8.5hz，2h)，4.04*3.99(m， 2h)，3.93(t，j＝7.8hz，1h)，2.62(d，j＝3.2hz，2h)，1.60-1.45(m，4h)，1.42-1.27 (m，4h)，1.25-1.20(m，9h)，1.00-0.75(m，30h)，0.11(d，j＝3.0hz，6h)，0.05(s，3h)， 0.02(s，3h)。
[0587]
中间体41的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧
ꢀ‑2’‑
氟-beta-腺苷]-(3’，5’)-[n6-苯甲酰基-2
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-3
’‑
o-苯甲酰基-腺苷]
[0588][0589]
中间体41是采用中间体37的路线、由中间体21和中间体2得到。
[0590]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ11.19(brs，1h)，9.10(brs，1h)，8.76(s，1h)，8.12(d， j＝2.4hz，1h)，8.05(dd，j＝7.6，2.0hz，4h)，7.89(s，2h)，7.75-7.61(m，2h)，7.60
‑ꢀ
7.45(m，4h)，6.33(dd，j＝18.0，4.0hz，1h)，6.23(d，j＝7.2hz，1h)，5.77(d，j＝5.2 hz，1h)，5.30(dd，j＝7.6，5.2hz，1h)，5.04(s，1h)，4.53(s，1h)，4.21(t，j＝10.0hz， 1h)，4.18-4.08(m，3h)，4.00-3.92(m，1h)，3.92-3.85(m，1h)，0.85(s，9h)，0.49(s， 9h)，0.05(s，6h)，-0.12(s，3h)，-0.42(s，3h)。ms-esi[(m+2h)/2]
+
：543.7。
[0591]
中间体42的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧腺苷]-(3’，5’)-[n6-苯甲酰基-2
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-3
’‑
o-苯甲酰基-腺苷]
[0592]
[0593]
中间体42是采用中间体37的路线、由中间体21和中间体4得到。ms-esi [(m+h)]
+
：1067.2。
[0594]
中间体43的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧
ꢀ‑2’‑
氟-beta-腺苷]-(3’，5’)-[n6-苯甲酰基-3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
o-苯甲酰基-腺苷]
[0595][0596]
中间体43是采用中间体37的路线、由中间体23和中间体2在n，n
’‑
二甲基甲酰胺溶液中得到。
[0597]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ11.23(brs，1h)，8.96(s，1h)，8.76(s，1h)，8.11(d， j＝2.4hz，1h)，8.02(d，j＝7.6hz，2h)，7.88(d，j＝7.6hz，4h)，7.64(dd，j＝6.8， 6.0hz，2h)，7.65-7.45(m，4h)，6.51(d，j＝5.6hz，1h)，6.32(dd，j＝18.8，3.6hz，1h)，5.92(t，j＝5.6hz，1h)，5.55-5.30(m，1h)，5.11-4.98(m，1h)，4.83(t，j＝4.0hz， 1h)，4.29(s，1h)，4.28-4.15(m，1h)，4.15-4.05(m，1h)，4.00-3.89(m，2h)，3.87-.80 (m，1h)，0.85(s，9h)，0.76(s，9h)，0.08(s，3h)，0.04(s，6h)，-0.09(s，3h)。ms-esi [m+h]
+
：1085.3。
[0598]
中间体44的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧
ꢀ‑2’‑
氟-beta-腺苷]-(3’，5’)-[n2-异丁酰基-3
’‑
o-苯甲酰基-2
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷]
[0599][0600]
中间体44是采用中间体37的路线、由中间体2和中间体25在dmf溶液中得到。
[0601]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.59(brs，1h)，12.11(brs，1h)，8.37(s，1h)，8.14 (d，j＝2.8hz，1h)，8.08-7.85(m，4h)，7.80-7.50(m，3h)，6.35(dd，j＝18.0，4.0hz， 1h)，5.92(d，j＝8.0hz，1h)，5.68(d，j＝5.2hz，1h)，5.55-5.38(m，2h)，5.15-4.98 (m，1h)，4.52-4.40(m，1h)，4.20-3.95(m，5h)，2.90-2.80(m，1h)，1.25-1.05(m，6h)， 0.87(s，9h)，0.53(s，9h)，0.07(s，6h)，-0.13(s，3h)，-0.38(s，3h)。ms-esi[(m
‑ꢀ
2h)/2]-：532.2。
[0602]
中间体45的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧腺苷]-(3’，5’)-[n2-异丁酰基-3
’‑
o-苯甲酰基-2
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷]
[0603][0604]
中间体45是采用中间体37的路线、由中间体4和中间体25在dmf溶液中得到。
[0605]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.76(brs，1h)，12.12(brs，1h)，8.37(s，1h)，8.27 (s，1h)，8.03(d，j＝7.6hz，2h)，7.81(brs，2h)，7.70-7.50(m，3h)，6.29(t，j＝6.8hz， 1h)，5.92(d，j＝7.6hz，1h)，5.76-5.65(m，1h)，5.55-5.45(m，1h)，5.10-4.96(m，1h)， 4.47(s，1h)，4.30-4.20(m，1h)，4.10-3.75(m，3h)，2.98-2.83(m，1h)，2.81-2.55(m， 2h)，1.20-1.05(m，6h)，0.84(s，9h)，0.54(s，9h)，0.03(s，6h)，-0.11(s，3h)，-0.36(s， 3h)。ms-esi[(m+2h)/2]
+
：525.3。
[0606]
中间体46的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧-2’，2
’‑ꢀ
二氟胞苷]-(3’，5’)-[n2-异丁酰基-3
’‑
o-苯甲酰基-2
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷]
[0607][0608]
中间体46是采用中间体37的路线、由中间体6和中间体25在dmf溶液中得到。
[0609]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.49(brs，1h)，12.09(brs，1h)，8.39(brs，1h)，8.05 (d，j＝7.2hz，2h)，7.78-7.50(m，4h)，7.40(brs，2h)，6.19(t，j＝8.4hz，1h)，5.91(d， j＝8.0hz，1h)，5.78(d，j＝7.6hz，1h)，5.66(d，j＝4.8hz，1h)，5.49-5.35(m，1h)， 5.10-4.90(m，1h)，4.45(s，1h)，4.20-3.80(m，5h)，2.95-2.77(m，1h)，1.12(d，j＝6.8 hz，6h)，0.89(s，9h)，0.54(s，9h)，0.15-0.05(m，6h)，-0.10(s，3h)，-0.37(s，3h)。 ms-esi[(m+2h)/2]
+
：514.3。
[0610]
中间体47的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-n4-(2-丙基戊酰基)-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧-2’，2
’‑
二氟胞苷]-(3’，5’)-[2
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-3
’‑
o-苯甲酰基-鸟苷]
[0611][0612]
中间体47是采用中间体37的路线、由中间体30和中间体9在dmf溶液中得到。
[0613]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ11.10(brs，1h)，10.60(brs，1h)，8.22(d，j＝7.6hz， 1h)，8.16(s，1h)，8.02(d，j＝7.6hz，2h)，7.68(t，j＝7.6hz，1h)，7.56(t，j＝7.6hz， 2h)，7.35(d，j＝7.6hz，1h)，6.51(brs，2h)，6.23(t，j＝7.6hz，1h)，5.82(d，j＝7.6 hz，1h)，5.67(d，j＝5.2hz，1h)，5.09(dd，j＝7.6，5.2hz，1h)，5.02-4.95(m，1h)， 4.41(d，j＝3.6hz，1h)，4.18-3.92(m，4h)，2.70-2.55(m，1h)，1.65-1.50(m，2h)， 1.45-1.30(m，2h)，1.28-1.15(m，4h)，0.96-0.88(m，12h)，0.87-0.80(m，9h)，0.53(s， 9h)，-0.11(s，3h)，-0.31(s，3h)。ms-esi[(m-2h)/2]-：540.3。
[0614]
中间体48的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧
ꢀ‑2’‑
氟-beta-腺苷]-(3’，5’)-[n2-异丁酰基-3
’‑
叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
苯甲酰基-鸟苷]
[0615][0616]
中间体48是采用中间体37的路线、由中间体27和中间体2在dmf溶液中得到。
[0617]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.53(brs，1h)，12.13(brs，1h)，8.36(s，1h)，8.14 (d，j＝2.8hz，1h)，7.98-7.80(m，4h)，7.64(t，j＝7.6hz，1h)，7.48(t，j＝8.0hz， 2h)，6.36(dd，j＝18.0，4.0hz，1h)，6.22(d，j＝7.2hz，1h)，5.88(dd，j＝7.2，5.2hz， 1h)，5.60
‑‑
5.43(m，1h)，5.19-5.05(m，1h)，4.72(d，j＝4.8hz，1h)，4.29-4.22(m， 1h)，4.22-4.09(m，2h)，4.08-3.91(m，3h)，2.96-2.86(m，1h)，1.18-1.09(m，6h)，0.87 (s，9h)，0.72(s，9h)，0.07(s，6h)，0.00(s，3h)，-0.02(s，3h)。
[0618]
中间体49的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧
ꢀ‑
腺苷]-(3’，5’)-[n2-异丁酰基-3
’‑
叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
苯甲酰基-鸟苷]
[0619]
[0620]
中间体49是采用中间体37的路线、由中间体27和中间体4在-dmf溶液中得到。
[0621]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.55(brs，1h)，12.14(brs，1h)，8.37(s，1h)，8.28 (s，1h)，7.94-7.76(m，4h)，7.65(t，j＝7.6hz，1h)，7.49(t，j＝8.0hz，2h)，6.33-6.21 (m，2h)，5.95-5.85(m，1h)，5.10-5.02(m，1h)，4.75(d，j＝4.8hz，1h)，4.31-4.23(m， 2h)，4.22-4.15(m，1h)，4.14-4.09(m，1h)，3.91-3.78(m，2h)，2.93-2.86(m，1h)，2.76
‑ꢀ
2.71(m，1h)，2.68-2.60(m，1h)，1.20-1.10(m，6h)，0.84(s，9h)，0.74(s，9h)，0.07
‑ꢀ
0.00(m，9h)，-0.10(s，3h)。
[0622]
中间体50的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]-(3’，5’)-[3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟腺苷]
[0623][0624]
中间体50是采用中间体37的路线、由中间体32和中间体2在dmf溶液中得到。
[0625]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.49(s，1h)，8.18-8.08(m，2h)，7.92(brs，2h)，7.34 (brs，2h)，6.32-6.20(m，2h)，5.50(dt，j＝52.0，4.4hz，1h)，5.30(d，j＝52.0hz，1h)， 5.05-4.94(m，1h)，4.78-4.65(m，1h)，4.14-4.06(m，3h)，3.95-3.70(m，3h)，0.90-0.75 (m，18h)，0.10(d，j＝8.8hz，6h)，0.04(s，6h)。
[0626]
中间体51的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧腺苷]-(3’，5’)-[3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟腺苷]
[0627][0628]
中间体51是采用中间体37的路线、由中间体3和中间体33得到。
[0629]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.51(s，1h)，8.25(s，1h)，8.13(s，1h)，7.82(brs， 2h)，7.31(brs，2h)，6.30-6.15(m，2h)，5.69(dt，j＝52.4，4.0hz，1h)，5.00-4.86(m， 1h)，4.80-4.65(m，1h)，4.19-4.00(m，3h)，3.99-3.85(m，1h)，3.78-3.62(m，2h)，2.75
‑ꢀ
2.62(m，1h)，2.60-2.50(m，1h)，0.88(s，9h)，0.81(s，9h)，0.14(s，3h)，0.11(s，3h)， 0.00(s，3h)，-0.01(s，3h)。
[0630]
中间体52的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧
ꢀ‑2’‑
氟-beta-腺苷]-(3’，5’)-[3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟鸟苷]
[0631][0632]
中间体52是采用中间体37的路线、由中间体1和中间体36在dmf溶液中得到。
[0633]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.64(brs，1h)，8.12(s，1h)，8.05(s，1h)，7.93-7.82 (m，3h)，6.54(brs，2h)，6.36-6.25(m，1h)，6.00(dd，j＝14.8，4.8hz，1h)，5.58-5.28 (m，2h)，5.15-4.98(m，1h)，4.60-4.50(m，1h)，4.15-4.00(m，3h)，3.98-3.88(m，3h)， 0.86(s，18h)，0.10-0.04(m，12h)。
[0634]
中间体53的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧腺苷]-(3’，5’)-[3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟鸟苷]
[0635][0636]
中间体53是采用中间体37的路线、由中间体3和中间体36在dmf溶液中得到。
[0637]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.65(brs，1h)，8.25(s，1h)，8.05(s，1h)，7.80(brs， 2h)，6.55(brs，2h)，6.25(t，j＝7.2hz，1h)，6.03-5.95(m，1h)，5.47(d，j＝52.0hz，1h)，4.97(s，1h)，4.65-4.50(m，1h)，4.19(s，1h)，4.15-4.00(m，3h)，3.99-3.85(m， 1h)，3.82(d，j＝11.2hz，1h)，3.76-3.69(m，1h)，2.75-2.60(m，1h)，0.88(s，9h)， 0.80(s，9h)，0.11(s，3h)，0.10(s，3h)，0.02(s，6h)。ms-esi[(m-h)]-：875.4。
[0638]
中间体54的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]-(3’，5’)-[2
‑ꢀ
氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]
[0639][0640]
将中间体37(260mg，0.188mmol)溶于四氢呋喃(2ml)、三氟乙酸(2ml)和水(1ml)的混合物中，在25℃搅拌2小时。将反应混合液旋干后用甲醇(5ml)稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液将以上混合液的ph调至约8-9。旋干后再次用甲醇 (5ml)稀释，过滤。浓缩滤液，得到的粗产品用硅胶柱纯化，用乙酸乙酯∶甲醇 (7∶3)洗脱，得到白色固体(120mg)。
[0641]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.30(s，1h)，8.23(s，1h)，7.88(brs，4h)，6.40-6.18 (m，2h)，6.06(d，j＝5.2hz，1h)，5.45-5.12(m，2h)，5.04(t，j＝6.0hz，1h)，5.00
‑ꢀ
4.85(m，
1h)，4.50-4.40(m，1h)，4.18-3.90(m，4h)，3.75-3.58(m，2h)。ms-esi[m
‑ꢀ
h]-：682.8。
[0642]
中间体55的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧腺苷]-(3’，5’)-[2-氯-2
’‑
脱氧腺苷]
[0643][0644]
向中间体38(150mg，0.110mmol)的四氢呋喃溶液(5ml)中加入四丁基氟化铵(34mg，0.132mmol)，所得混合液在25℃搅拌3小时。将反应混合液旋干后溶于冰醋酸(2ml)和水(0.5ml)的混合溶液，在25℃搅拌0.5小时。将反应混合液旋干，得到的粗产品用硅胶柱纯化，用乙酸乙酯∶甲醇(3∶1)洗脱，得到白色固体 (45mg)。ms-esi[m-h]-：647.0。
[0645]
中间体56的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
’‑
脱氧-2’，2
’‑
二氟胞苷]-(3’，5’)-[2
’‑
脱氧
ꢀ‑2’
，2
’‑
二氟胞苷]
[0646][0647]
向中间体39(350mg，0.421mmol)的四氢呋喃溶液(5ml)中加入四丁基氟化铵(329mg，1.26mmol)，所得混合液在25℃搅拌2小时。将反应混合液旋干，得到的粗产品用硅胶柱纯化，用乙酸乙酯∶甲醇(3∶1)洗脱，得到白色固体(130mg)。
[0648]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.77(d，j＝7.2hz，1h)，7.65(d，j＝7.6hz，1h)， 7.45-7.25(m，4h)，6.30(d，j＝6.4hz，1h)，6.20-6.05(m，2h)，5.89-5.70(m，2h)，5.13 (t，j＝6.0hz，1h)，4.90-4.75(m，1h)，4.20-4.00(m，2h)，4.00-3.60(m，5h)。
[0649]
中间体57的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-n4-(2-丙基戊酰基)-2
’‑
脱氧-2’，2
’‑
二氟胞苷]-(3’，5’)-[n4-(2-丙基戊酰基)-2
’‑
脱氧-2’，2
’‑
二氟胞苷]
[0650][0651]
中间体57是采用中间体56的路线、由中间体40得到。ms-esi[m+h]
+
：858.2， [(m+2h)/2]
+
：429.1。
[0652]
中间体58的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]-(3’，5’)
‑ꢀ
[n6-苯甲酰基-3
’‑
o-苯甲酰基-腺苷]
[0653][0654]
中间体58是采用中间体56的路线、由中间体41得到。ms-esi [m+h]
+
：857.0。
[0655]
中间体59的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧腺苷]-(3’，5’)-[n6-苯甲酰基
ꢀ‑3’‑
o-苯甲酰基-腺苷]
[0656][0657]
中间体59是采用中间体56的路线、由中间体42得到。ms-esi [m+h]
+
：839.0。
[0658]
中间体60的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]-(3’，5’)
‑ꢀ
[n6-苯甲酰基-2
’‑
o-苯甲酰基-腺苷]
[0659][0660]
向中间体43(250mg，0.23mmol)的四氢呋喃溶液(5ml)中加入三乙胺三氢氟酸盐(223mg，1.38mmol)，在30℃搅拌16小时。将反应混合液用三乙胺中和至 ph 7-8。将所得混合液旋干，得到的粗产品用硅胶柱纯化，乙酸乙酯∶甲醇(8∶2) 得到白色固体(160mg)。ms-esi[m+h]
+
：857.1。
[0661]
中间体61的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]-(3’，5’)
‑ꢀ
[n2-异丁酰基-3
’‑
o-苯甲酰基-鸟苷]
[0662][0663]
中间体61是采用中间体60的路线、由中间体44得到。
[0664]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.56(brs，1h)，12.11(brs，1h)，8.35-8.20(m，2h)， 8.10-8.00(m，2h)，7.91(brs，2h)，7.75-7.45(m，3h)，6.38-6.18(m，1h)，6.00-5.75(m， 2h)，5.70-5.21(m，2h)，5.16-4.90(m，2h)，4.50-4.36(m，1h)，4.28-4.00(m，2h)，3.90
‑ꢀ
3.58(m，2h)，3.00-2.82(m，1h)，1.36-1.05(m，6h)。ms-esi[m-h]-：837.0。
[0665]
中间体62的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧腺苷]-(3’，5’)-[n2-异丁酰基
ꢀ‑3’‑
o-苯甲酰基-鸟苷]
[0666][0667]
中间体62是采用中间体60的路线、由中间体45得到。
[0668]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.72(brs，1h)，12.13(brs，1h)，8.34(s，1h)，8.32 (s，1h)，8.03(d，j＝7.6hz，1h)，7.98-7.81(m，3h)，7.71-7.62(m，1h)，7.60-7.43(m， 1h)，6.38-6.20(m，1h)，5.99-5.70(m，2h)，5.70-5.57(m，1h)，5.40-5.28(m，1h)，5.18
‑ꢀ
4.93(m，2h)，4.42(s，1h)，4.32-4.00(m，3h)，3.75-3.52(m，2h)，2.93-2.81(m，1h)，2.80-2.62(m，1h)，1.20-1.05(m，6h)。ms-esi[m+h]
+
：821.2。
[0669]
中间体63的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
’‑
脱氧-2’，2
’‑
二氟胞苷]-(3’，5’)-[n2-异丁酰基-3
’‑
o-苯甲酰基-鸟苷]
[0670][0671]
中间体63是采用中间体60的路线、由中间体46得到。
[0672]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.42(brs，1h)，12.12(brs，1h)，8.35(s，1h)，8.08 (d，j＝7.6hz，2h)，7.80-7.53(m，4h)，7.48-7.34(m，2h)，6.24-6.12(m，1h)，5.97
‑ꢀ
5.87(m，1h)，5.86-5.76(m，1h)，5.57(d，j＝5.2hz，1h)，5.30-5.18(m，1h)，5.17
‑ꢀ
5.05(m，1h)，4.95-4.75(m，1h)，4.41(s，1h)，4.25-3.70(m，6h)，2.90-2.77(m，1h)， 1.20-1.05(m，6h)。
[0673]
中间体64的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-n4-(2-丙基戊酰基)-2
’‑
脱氧-2’，2
’‑
二
3.59(m，2h)。ms-esi[m+h]
+
：651.0。
[0686]
中间体68的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧腺苷]-(3’，5’)-[2
’‑
脱氧-2
’‑
氟腺苷]
[0687][0688]
中间体68是采用中间体56的路线、由中间体51得到。
[0689]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.50(s，1h)，8.34(s，1h)，8.15(s，1h)，7.84(brs， 2h)，7.31(brs，2h)，6.30-6.18(m，2h)，5.90(d，j＝5.6hz，1h)，5.45(dt，j＝52.0，3.6 hz，1h)，5.12-4.90(m，2h)，4.60-4.45(m，1h)，4.18-4.00(m，3h)，3.99-3.85(m，1h)， 3.65-3.50(m，2h)，2.70-2.55(m，1h)，2.50-2.40(m，1h)。
[0690]
中间体69的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]-(3’，5’)-[2
’‑ꢀ
脱氧-2
’‑
氟鸟苷]
[0691][0692]
中间体69是采用中间体60的路线、由中间体52得到。
[0693]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.64(s，1h)，8.24(s，1h)，8.00(s，1h)，7.88(brs，2h)，6.54(brs，2h)，6.28(dd，j＝18.0，3.6hz，1h)，6.02(dd，j＝16.0，3.6hz，1h)， 5.80(d，j＝5.4hz，1h)，5.44(d，j＝4.4hz，1h)，5.30(d，j＝7.6hz，1h)，5.04(d，j ＝6.0hz，1h)，4.95(t，j＝14.8hz，1h)，4.42(dt，j＝10.4，5.6hz，1h)，4.11-3.99(m， 3h)，3.98-3.89(m，1h)，3.77-3.60(m，2h)。ms-esi[m+h]
+
：667.2。
[0694]
中间体70的制备：[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧腺苷]-(3’，5’)-[2
’‑
脱氧-2
’‑
氟鸟苷]
[0695][0696]
中间体69是采用中间体60的路线、由中间体53得到。
[0697]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.67(brs，1h)，8.37(s，1h)，8.04(s，1h)，7.85(brs，
2h)，6.58(brs，2h)，6.26(t，j＝7.2hz，1h)，6.03(d，j＝15.6hz，1h)，5.85(d，j＝5.6 hz，1h)，5.38(d，j＝52.8hz，1h)，5.10(s，1h)，4.97(s，1h)，4.46(d，j＝14.8hz， 1h)，4.20-4.00(m，4h)，4.00-3.90(m，1h)，3.70-3.50(m，2h)，2.78-2.60(m，1h)。 ms-esi[m-h]-：647.2。
[0698]
中间体71的制备：(2’，3’)-环-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-n6-苯甲酰基-3
’‑
苯甲酰基-腺苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]
[0699][0700]
向中间体58(95mg，0.11mmol)和(-)-psi试剂(150mg，0.33mmol)的dmf溶液(10ml)中加入1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯(253mg，1.66mmol)，所得混合物在 25℃搅拌1小时。将反应混合液旋干后用乙酸乙酯(20ml)重沉淀，所得固体用乙酸乙酯(20ml)打浆、过滤干燥后得到粗产物(200mg)，直接用作下一步反应。 ms-esi[m+2+h]
+
：937.0。
[0701]
中间体72的制备：(2’，3’)-环-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-n6-苯甲酰基-3
’‑
o-苯甲酰基
‑ꢀ
腺苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧腺苷]
[0702][0703]
向中间体59(210mg，0.25mmol)和(-)-psi试剂(335mg，0.75mmol)的dmf 溶液(10ml)中加入1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯(570mg，3.75mmol)，所得混合物在25℃搅拌1小时。将反应混合液旋干后用乙酸乙酯(20ml)重沉淀，所得固体用乙酸乙酯(20ml)打浆、过滤干燥后得到粗产物。粗产品用制备液相色谱(10 mm碳酸氢铵作为添加剂)纯化，冻干后得到白色固体(15.8mg)，直接用作下一步反应。ms-esi[m+h]
+
：917.0。
[0704]
中间体73的制备：(3’，3’)-环-二-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-n6-苯甲酰基-2
’‑
o-苯甲酰基-腺苷]
[0705][0706]
中间体73是采用中间体71的路线、由中间体60和(-)-psi试剂得到。ms
‑ꢀ
esi[m-h]-：932.8。
[0707]
中间体74：(2’，3’)-环-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-3
’‑
o-苯甲酰基-鸟苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]-异构体1和中间体75：(2’，3’)-环-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-3
’‑
o-苯甲酰基-鸟苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta
‑ꢀ
腺苷]-异构体2的制备
[0708][0709]
中间体74和中间体75采用中间体72的路线、由中间体61和(-)-psi试剂得到。
[0710]
中间体74：ms-esi[m-h]-：844.8，保留时间：4.96min；
[0711]
中间体75：ms-esi[m-h]-：844.9，保留时间：5.20min。分析lcms：agilent1100+g1946d lcms，4.6x150mm waters xbridge c18 3.5μm分析柱，流动相 a为10mm nh4hco3水溶液，b为乙腈，流速1.0ml/min，214和254nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-0.1min，5％b；0.1-8min，5-95％b；8-15min， 95％b。
[0712]
中间体76：(2’，3’)-环-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-n2-异丁酰基-3
’‑
o-苯甲酰基-鸟苷]
‑ꢀ
[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-腺苷]-异构体1，和
[0713]
中间体77：(2’，3’)-环-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-n2-异丁酰基-3
’‑
o-苯甲酰基-鸟苷]
‑ꢀ
[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-腺苷]-异构体2的制备
[0714][0715]
中间体76和中间体77采用中间体72的路线、由中间体62和(-)-psi试剂得到。
[0716]
中间体76：ms-esi[m-h]-：897.2，保留时间：1.69min；
[0717]
中间体77：ms-esi[m-h]-：897.2，保留时间：1.74min。分析lcms：agilent1100+g1946d lcms，4.6x50mm waters xbridge c18 3.5μm分析柱，流动相a 为10mm nh4hco3水溶液，b为乙腈，流速1.8min/min，214和254nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-0.1min，5％b；0.1-2.5min，5-95％b；2.5-5min， 95％b。
[0718]
中间体78的制备：(2’，3’)-环-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-n2-异丁酰基-3
’‑
o-苯甲酰基
‑ꢀ
鸟苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
’‑
脱氧-2’，2
’‑
二氟胞苷]
[0719][0720]
中间体78采用中间体72的路线、由中间体63和(-)-psi试剂得到。中间体 78：ms-esi[(m-2h)/2]-：437.0。
[0721]
中间体79的制备：(2’，3’)-环-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-3
’‑
o-苯甲酰基-鸟苷]-[3
’‑o‑ꢀ
硫代磷酸二酯-n4-(2-丙基戊酰基)-2
’‑
脱氧-2’，2
’‑
二氟胞苷]
[0722][0723]
中间体79是采用中间体72的路线、由中间体64和(-)-psi试剂得到。ms
‑ꢀ
esi[m-h]-：931.0。
[0724]
中间体80：(3’，3’)-环-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-n2-异丁酰基-2
’‑
苯甲酰基-鸟苷]-[3
’‑ꢀ
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]-异构体1，和
[0725]
中间体81：(3’，3’)-环-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-n2-异丁酰基-2
’‑
苯甲酰基-鸟苷]-[3
’‑ꢀ
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]-异构体2
[0726][0727]
中间体80和81是采用中间体72的路线，由中间体65和(-)-psi试剂得到。中间体80：ms-esi[m-h]-：915.0，保留时间：1.50min；
[0728]
中间体81：ms-esi[m-h]-：915.0，保留时间：1.53min。分析lcms：agilent1100+g1946d lcms，4.6x50mm waters xbridge c18 3.5μm分析柱，流动相a 为10mm nh4hco3水溶液，b为乙腈，流速1.8ml/min，214和254nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-0.2min，5％b；0.2-1.5min，5-95％b；1.5-3min， 95％b。
[0729]
中间体82的制备：(3’，3’)-环-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-n2-异丁酰基-2
’‑
苯甲酰基-鸟苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-腺苷]
[0730][0731]
中间体82采用中间体72的路线，由中间体66和(-)-psi试剂得到。ms-esi [m-h]-：896.8。
[0732]
中间体83的制备：2-氯-5
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-3
’‑
o-苯甲酰基-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟
ꢀ‑
beta-腺苷
[0733][0734]
中间体83是采用中间体20的路线、由中间体1得到。
[0735]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.21(d，j＝2.4hz，1h)，8.08(d，j＝7.2hz，2h)， 7.95(brs，2h)，7.72(t，j＝7.6hz，1h)，7.58(t，j＝7.6hz，2h)，6.50(dd，j＝16.6，4.0 hz，1h)，5.80-5.77(m，1h)，5.75-5.66(m，1h)，4.32(q，j＝4.8hz，1h)，3.97(d，j＝ 4.4hz，2h)，0.86(s，9h)，0.06(s，6h)。
[0736]
中间体84的制备：2-氯-3
’‑
o-苯甲酰基-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷
[0737][0738]
中间体84是采用中间体60的路线、由中间体83得到。
[0739]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.40(d，j＝2.4hz，1h)，8.12(d，j＝7.6hz，2h)， 7.99(brs，2h)，7.74(t，j＝7.2hz，1h)，7.60(t，j＝7.6hz，2h)，6.55(dd，j＝18.2，3.6 hz，1h)，5.81-5.78(m，1h)，5.77-5.66(m，1h)，4.35(q，j＝4.4hz，1h)，3.89-3.80(m， 2h)。
[0740]
中间体85的制备：n-(9-((2r，3r，4r，5r)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-3-((2s，3ar，6s，7ar)-3a-甲基-6-(丙-1-烯-2-基)-2
‑ꢀ
硫代六氢苯并[d][1，3，2]氧硫磷杂环戊烷-2-基)氧基)四氢呋喃-2-基)-6-氧基-6，9-二氢-1h-嘌呤-2-基)异丁酰胺
[0741]
[0742]
中间体85是采用中间体2的路线、由n2-异丁酰基-5
’‑
o-双(4-甲氧基苯基) 苯甲基-3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷和(+)-psi试剂得到。
[0743]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.11(s，1h)，11.62(s，1h)，8.14(s，1h)，7.38(d，j ＝8.0hz，2h)，7.31-7.22(m，7h)，6.86(d，j＝8.4hz，4h)，6.00(d，j＝6.8hz，1h)， 5.67-5.59(m，1h)，4.89(s，1h)，4.75(s，1h)，4.42(d，j＝4.0hz，1h)，4.22(d，j＝12.0 hz，1h)，4.06-4.02(m，1h)，3.73(s，6h)，3.41-3.35(m，2h)，3.24(dd，j＝12.0hz， 1h)，2.82-2.73(m，1h)，2.07(d，j＝12.0hz，1h)，1.93-1.83(m，2h)，1.76-1.65(mf， 6h)，1.54(s，3h)，1.12(d，j＝6.8hz，6h)，0.83(s，9h)，0.08(s，3h)，0.04(s，3h)。
[0744]
中间体86的制备：[2
’‑
o-rp-硫代磷酸二酯-n2-异丁酰基-5
’‑
o-双(4-甲氧基苯基) 苯甲基-3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷]-(2’，5’)-[2-氯-3
’‑
o-苯甲酰基-2
’‑
脱氧-2
’‑ꢀ
氟-beta-腺苷]
[0745][0746]
中间体86是采用中间体37的路线、由中间体84和中间体85在dmf溶液中得到。
[0747]
ms-esi[m+h]
+
：1255.0。
[0748]
中间体87的制备：[2
’‑
o-rp-硫代磷酸二酯-n2-异丁酰基-5
’‑
o-双(4-甲氧基苯基) 苯甲基-3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷]-(2’，5’)-[2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]
[0749][0750]
将中间体86(1.0g，0.8mmol)加入到四氢呋喃/水/甲醇为8∶4∶1的混合溶液 (10ml)中，冷却至0℃，加入氢氧化锂一水合物(54mg，1.6mmol)，所得混合物在0℃搅拌20min。将反应混合液倒入水(50ml)中，用乙酸乙酯萃取两次(每次50ml)。合并有机相，饱和食盐水洗涤两次(每次100ml)后用无水硫酸钠干燥。浓缩得到的粗产品用硅胶柱纯化，乙酸乙酯∶甲醇(10∶1)洗脱，得到白色固体(733 mg)。
[0751]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.02(s，1h)，11.67(s，1h)，8.21(t，j＝5.2hz，1h)， 8.14(s，1h)，7.84(s，2h)，7.37(d，j＝7.6hz，2h)，7.29-7.14(m，7h)，6.87-6.77(m， 4h)，6.23(dd，j＝13.9，4.5hz，1h)，6.08-5.98(m，2h)，5.49-5.38(m，1h)，5.23-5.04 (m，1h)，4.66-4.59(m，1h)，4.35-4.24(m，1h)，3.99-3.95(m，1h)，3.77-3.71(m，2h)， 3.71-3.63(m，7h)，3.22-3.00(m，2h)，2.79-2.68(m，1h)，1.12-1.07(m，6h)，0.82(s， 9h)，0.13(d，j＝
13.4hz，6h)。
[0752]
中间体88的制备：o-((2r，3r，4s，5r)-5-(6-氨基-2-氯-9h-嘌呤-9-基)-4-氟-3
‑ꢀ
((2r，3as，6r，7as)-3a-甲基-6-(丙-1-烯-2-基)-2-硫代六氢苯并[d][1，3，2]氧硫磷杂环戊烷-2-基)甲基)-o-((2r，3r，4r，5r)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4
‑ꢀ
((叔丁基二甲基硅基)氧基)-2-(2-异丁胺基-6-氧基-1，6-二氢-9h-嘌呤-9-基)四氢呋喃-3-基)-(r)-硫代磷酸二酯
[0753][0754]
中间体88是采用中间体2的路线、由中间体87和(-)-psi试剂在四氢呋喃中制得粗品，直接用于下一步反应。ms-esi[m+h-dmtr]
+
：1095.0。
[0755]
中间体89的制备：o-((2r，3r，4s，5r)-5-(6-氨基-2-氯-9h-嘌呤-9-基)-4-氟-3
‑ꢀ
((2r，3as，6r，7as)-3a-甲基-6-(丙-1-烯-2-基)-2-硫代六氢苯并[d][1，3，2]氧硫磷杂环戊烷-2-基)甲基)-o-((2r，3r，4r，5r)-4-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-2-(2-异丁胺基
‑ꢀ
6-氧基-1，6-二氢-9h-嘌呤-9-基)四氢呋喃-3-基)-(r)-硫代磷酸二酯
[0756][0757]
中间体89是采用中间体25的路线、由中间体88得到。
[0758]
ms-esi[m+h]
+
：1095.0。
[0759]
中间体90的制备：(2’，3’)-环-(rp，sp)-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-n2-异丁酰基-3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]
[0760][0761]
将中间体89(90mg，0.082mmol)溶于无水dmf(7ml)中，加入4a分子筛 (90mg)，室温(28℃)氮气保护下搅拌干燥0.5小时。然后用注射器加入dbu(75.0 mg，0.492mmol)，室温(28℃)搅拌0.5小时后，加硅藻土过滤，滤液旋干得到粗产物中间体90(100mg，粗品)直接用于下一步反应。
[0762]
ms-esi[m+h]
+
：926.8。
[0763]
中间体91的制备：(2r，3r，4s，5r)-5-(6-氨基-2-氯-9h-嘌呤-9-基)-2
‑ꢀ
(((((((2r，3r，4r，5r)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-2-(2-异丁胺基-6-氧基-1，6-二氢-9h-嘌呤-9-基)四氢呋喃-3-基)氧基)(2-氰基乙氧基)磷酰基)氧基)甲基)-4-氟四氢呋喃-3-基苯甲酸酯
[0764][0765]
将中间体84(500mg，1.23mmol)和(2r，3r，4r，5r)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-2-(2-异丁胺基-6-氧基-1，6-二氢
‑ꢀ
9h-嘌呤-9-基)四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基磷酰胺(1.78g，1.84mmol)溶于乙腈/四氢呋喃(8ml/8ml)的混合溶液中，加入4a分子筛(500mg)，室温(28℃) 氮气保护下搅拌0.5小时。然后用注射器加入四氮唑的乙腈溶液(8.17ml，0.45 m)；室温(28℃)搅拌2小时后，加入70％的过氧化叔丁醇(520.9mg，4.05mmol， 0.544ml)，室温(28℃)搅拌20min后，用50％的五水硫代硫酸钠水溶液(5ml)淬灭；加硅藻土过滤，滤液用乙酸乙酯(30ml)稀释，并用水洗涤(20ml，两次)，有机相用无水硫酸钠干燥。浓缩得到的粗产品用硅胶柱纯化，用石油醚∶乙酸乙酯(10∶1-1∶10)洗脱，得到混合物(1.9g)直接用于下一步。
[0766]
ms-esi[m+h]
+
：1296.0。
[0767]
中间体92的制备：[2
’‑
o-磷酸二酯-5
’‑
o-双(4-甲氧基苯基)苯甲基-3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷]-(2’，5’)-[2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]
[0768][0769]
向中间体91(1g，0.775mmol)加入33％的甲胺乙醇溶液(8ml)，并在室温下搅拌3小时。将反应液旋干后用c18反相柱纯化，用水(含0.1％碳酸氢铵)∶乙腈 (3∶2)洗脱，冻干后得到粉色固体(550mg)。
[0770]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.65(s，1h)，8.18(d，j＝2.0hz，1h)，7.93-7.77 (m，2h)，7.38-7.15(m，10h)，7.13-6.92(m，2h)，6.90-6.77(m，4h)，6.49-6.20(m，4h)，5.92(d，j＝5.6hz，1h)，5.26-5.09(m，2h)，4.61-4.24(m，3h)，3.98-3.82(m，3h)， 3.79-3.67(m，7h)，0.79(s，9h)，0.14-0.02(m，6h)。ms-esi[m+h]
+
：1064.8。
[0771]
中间体93的制备：[2
’‑
o-磷酸二酯-5
’‑
o-双(4-甲氧基苯基)苯甲基-3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷]-(2’，5’)-[2-氯-3
’‑
o-亚磷酸单酯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]
[0772][0773]
将亚磷酸二苯酯(137mg，0.47mmol)在0℃，氮气保护下加入中间体92(250 mg，0.235mmol)，dbu(143mg，0.94mmol)和4a分子筛的吡啶(8ml)溶液，所得混合物在室温下搅拌2小时。将反应液过滤后旋干，直接用作下一步反应。
[0774]
ms-esi[m+h]
+
：1129.8。
[0775]
中间体94的制备：[2
’‑
o-磷酸二酯-3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷]-(2’，5’)-[2
‑ꢀ
氯-3
’‑
o-亚磷酸单酯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]
[0776][0777]
中间体94是采用中间体25的路线、由中间体93得到。
[0778]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.26(s，1h)，7.99(s，1h)，7.88(s，2h)，6.55(s，2h)， 6.27(dd，j＝17.2，4.0hz，1h)，6.00-5.70(m，3h)，5.44-5.21(m，1h)，5.09-4.98(m， 1h)，4.87-4.71(m，1h)，4.47(d，j＝4.0hz，1h)，4.07-3.97(m，1h)，3.91-3.73(m，3h)， 3.56-3.49(m，5h)，0.89(s，9h)，0.14(s，6h)。
31
p nmr(162mhz，dmso-d6)δ1.72，
ꢀ‑
1.58。ms-esi[m+h]
+
：826.8。
[0779]
中间体95的制备：(2’，3’)-环-[2
’‑
o-磷酸二酯-3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷]
‑ꢀ
[3
’‑
o-磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]
[0780][0781]
在0℃下，向中间体94(55mg，0.067mmol)的吡啶溶液(15ml)中加入特戊酰氯(48mg，0.40mmol)，所得反应液在室温下搅拌3小时。然后向其中加入碘单质(26mg，0.10mmol)的乙腈(0.5ml)和水(0.1ml)的混合溶液，所得反应液在室温下搅拌16小时。将反应液用10％的硫代硫酸钠水溶液(5ml)淬灭后旋干，用 c18反相柱纯化，用水(含0.1％碳酸氢铵)∶乙腈(4∶1)洗脱，冻干后得到白色固体 (20mg)。ms-esi[m+h]
+
：825.0。
[0782]
中间体96的制备：(2’，3’)-环-[2
’‑
o-rp-硫代磷酸二酯-n2-异丁酰基-3
’‑
o-叔丁
基二甲基硅烷基-鸟苷]-[3
’‑
o-磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]
[0783][0784]
中间体96是采用中间体95的路线、由[2
’‑
o-磷酸二酯-n2-异丁酰基-3
’‑o‑ꢀ
叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷]-(2’，5’)-[n6-苯甲酰基-2-氯-3
’‑
o-亚磷酸单酯-2
’‑
脱氧
ꢀ‑2’‑
氟-beta-腺苷]得到。
[0785]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.92(s，1h)，12.12(s，1h)，11.54(s，1h)，8.55(d， j＝2.0hz，1h)，8.23(s，1h)，8.06(d，j＝7.2hz，2h)，7.71-7.61(m，1h)，7.59-7.51 (m，3h)，6.47(dd，j＝21.6，2.4hz，1h)，5.97-5.74(m，2h)，5.60-5.40(m，1h)，5.12
‑ꢀ
5.00(m，1h)，4.41(d，j＝3.2hz，1h)，4.27-4.15(m，1h)，4.13-3.94(m，5h)，2.97
‑ꢀ
2.84(m，1h)，1.65-1.54(m，1h)，1.09(d，j＝7.2hz，3h)，0.98(d，j＝6.8hz，3h)， 0.93(s，9h)，0.20(d，j＝8.6hz，6h)。
[0786]
中间体97的制备：(2’，3’)-环-[2
’‑
o-磷酸二酯-3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷]
‑ꢀ
[3
’‑
o-rp-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]
[0787][0788]
中间体97是采用中间体95的合成路线，由中间体92和(+)-psi试剂反应，经脱保护和环化反应，用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm watersxbridge c18 10μm制备柱，流动相a为10mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速25ml/min，214和254nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-2min，20％b； 2-14min，20-40％b；14-14.2min，40-95％b；14.2-18min，95％b。该化合物保留时间12.5min)纯化得到。
[0789]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.59(s，1h)，8.18(d，j＝2.4hz，1h)，8.11(s，1h)， 7.45-6.98(m，5h)，6.33-6.23(m，1h)，5.82(d，j＝8.6hz，1h)，5.42(s，1h)，5.32
‑ꢀ
5.23(m，2h)，4.33(d，j＝4.0hz，1h)，4.19-3.70(m，9h)，0.91(s，9h)，0.15(s，6h)。
19
f nmr(376mhz，dmso)δ-196.51(s)。
31
p nmr(162mhz，dmso)δ53.76(s)，
ꢀ‑
0.49(s)。ms-esi[m+h]
+
：841.0。
[0790]
中间体98的制备：(2’，3’)-环-(rp，rp)-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-n2-异丁酰基-3
’‑
o-叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]
[0791][0792]
中间体98是采用中间体90的合成路线，由中间体87和(+)-psi试剂反应，经脱保护和环化反应得到。
[0793]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.41(brs，1h)，11.90(s，1h)，11.31(s，1h)，8.35 (d，j＝2.0hz，1h)，8.03(s，1h)，7.85(d，j＝7.2hz，2h)，7.45(t，j＝7.2hz，1h)，7.35 (t，j＝7.6hz，2h)，6.88(t，j＝48hz，6h)，6.25(dd，j＝20.0，4.0hz，1h)，5.65(d，j ＝8.4hz，1h)，5.59-5.46(m，1h)，5.32(d，j＝50.0hz，1h)，5.02(t，j＝11.2hz，1h)， 4.15(d，j＝4.0hz，1h)，4.07-4.01(m，1h)，3.97-3.64(m，5h)，2.74-2.62(m，1h)，0.86 (d，j＝6.4hz，3h)，0.81-0.66(m，12h)，-0.01(d，j＝9.6hz，6h)。ms+esi
‑‑
[m+h]： 1030.8。
[0794]
实施例1：(3’，3’)-环-(rp，rp)-二-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]1.5-铵-0.5-1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯-盐
[0795][0796]
向中间体54(120mg，0.150mmol)和(-)-psi试剂(201mg，0.450mmol)的dmf 溶液(8ml)中加入1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯(342mg，2.25mmol)，所得混合物在25℃搅拌1小时。将反应混合液旋干后用乙酸乙酯(20ml)重沉淀。收集固体，得到的粗产品用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm welch 10μm 制备柱，流动相a为10mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速25ml/min，214 和254nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-3min，0-3％b；3-14min，3-30％b； 14-14.3min，30-95％b；14.3-20min，95％b。该化合物保留时间为13.5min)纯化，冻干后得到白色固体(20mg)。
[0797]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.37(s，1h)，8.22(s，1h)，7.90(brs，4h)，7.12(brs， 6h)，6.33-6.20(m，2h)，5.56-5.30(m，2h)，5.20-5.00(m，2h)，4.22-3.85(m，6h)，3.55
‑ꢀ
3.40(m，2h)，3.35-3.15(m，1h)，2.70-2.55(m，1h)，1.96-1.85(m，1h)，1.73-1.52(m， 3h)。
31
p nmr(162mhz，dmso-d6)δ53.47。ms-esi[m-h]-：760.9。
[0798]
实施例2：(3’，3’)-环-(rp，rp)-二-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧腺苷]
[0799][0800]
实施例2是采用实施例1的路线、由中间体55和(-)-psi试剂反应后，用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm welch 10μm制备柱，流动相a 为0.05％甲酸水溶液，b为0.05％甲酸的乙腈溶液，流速25ml/min，214和254 nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-3min，0-5％b；3-14min，5-50％b；14
‑ꢀ
14.3min，50-95％b；14.3-20min，95％b。该化合物保留时间为12min)纯化得到。
[0801]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.53(s，1h)，8.38(s，1h)，7.84(brs，4h)，6.33-6.18 (m，2h)，5.20-4.75(m，2h)，4.30-3.75(m，6h)，3.00-2.70(m，2h)，2.70-2.50(m，2h). 31
p nmr(162mhz，dmso-d6)δ53.68，52.69。ms-esi[m-h]-：724.9。
[0802]
实施例3：(3’，3’)-环-(rp，rp)-二-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
’‑
脱氧-2’，2
’‑
二氟胞苷]
[0803][0804]
实施例3是采用实施例1的路线、由中间体56和(-)-psi试剂反应后，用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm welch 10μm制备柱，流动相a 为0.05％甲酸水溶液，b为0.05％甲酸的乙腈溶液，流速25ml/min，214和254 nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-3min，0-5％b；3-14min，5-30％b；14
‑ꢀ
14.3min，30-95％b；14.3-20min，95％b。该化合物保留时间为18min)纯化得到。
[0805]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ9.20-8.80(m，2h)，8.31(d，j＝6.4hz，1h)，8.28
‑ꢀ
8.00(m，2h)，7.90(d，j＝6.0hz，1h)，6.20-6.05(m，3h)，6.00(d，j＝6.4hz，1h)， 4.95-4.68(m，2h)，4.30-4.05(m，4h)，3.90-3.70(m，2h)。
31
p nmr(162mhz，dmso
‑ꢀ
d6)δ53.27，52.67。ms-esi[m+h]
+
：683.0。
[0806]
实施例4：(3’，3’)-环-(rp，rp)-二-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-n4-(2-丙基戊酰基)-2
’‑
脱氧
ꢀ‑2’
，2
’‑
二氟胞苷]二铵盐
[0807][0808]
实施例4是采用实施例1的路线、由中间体57和(-)-psi试剂反应后，用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm welch 10μm制备柱，流动相a 为10mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速25ml/min，214和254nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-3min，0-35％b；3-14min，35-70％b；14-14.3min， 70-95％b；14.3-20min，95％b。该化合物保留时间为14min。)纯化得到。
[0809]
1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ11.05(s，1h)，11.00(s，1h)，8.39(d，j＝7.6hz， 1h)，8.16(d，j＝7.6hz，1h)，7.40(d，j＝7.6hz，1h)，7.34(d，j＝7.6hz，1h)，7.12 (t，j＝52.0hz，8h)，6.30-6.18(m，2h)，5.02-4.75(m，2h)，4.35-4.10(m，4h)，3.83(t， j＝11.2hz，2h)，2.70-2.52(m，2h)，1.62-1.45(m，4h)，1.40-1.17(m，12h)，0.85(t，j ＝7.2hz，12h)。31p nmr(162mhz，dmso)δ54.54，53.29。ms-esi[m+h]
+
： 935.1。
[0810]
实施例5：(2’，3’)-环-(rp，rp)-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-腺苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
‑ꢀ
氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]二铵盐
[0811][0812]
向中间体71(200mg，0.214mmol)中加入7m的氨甲醇溶液(2ml)，所得混合物在25℃搅拌6小时。将反应混合液旋干后得到粗产品。所得粗产品用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm welch 10μm制备柱，流动相a为 0.05％甲酸水溶液，b为0.05％甲酸的乙腈溶液，流速25ml/min，214和254nm 双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-3min，0-5％b；3-14min，5-30％b；14-14.3 min，30-95％b；14.3-20min，95％b。该化合物保留时间为14min)纯化，冻干后得到白色固体(4.0mg)。
[0813]1h nmr(500mhz，dmso-d6)δ8.63(s，1h)，8.23(s，1h)，8.17(s，1h)，7.92(brs， 2h)，7.29(brs，2h)，6.33-6.28(m，1h)，6.12(d，j＝8.5hz，1h)，5.40-5.15(m，2h)， 5.05-4.95(m，1h)，4.55(t，j＝3.5hz，1h)，4.36-4.24(m，2h)，4.19(s，1h)，4.10-3.95 (m，2h)，3.90-3.78(m，1h)，3.72(d，j＝12.0hz，1h)。
31
p nmr(162mhz，dmso
‑ꢀ
d6)δ53.08，48.81。ms-esi[m-h]-：724.8。
[0814]
实施例6：(2’，3’)-环-(rp，rp)-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-腺苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
‑ꢀ
氯-2
’‑
脱氧腺苷]二铵盐
[0815][0816]
实施例6是采用实施例5的路线、由中间体72和28％氨水反应后，用制备液相色谱(10mm碳酸氢铵作为添加剂)纯化得到。分析lcms：agilent1100+g1946d lcms，4.6x50mm waters xbridge c18 3.5μm分析柱，流动相a 为10mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速1.8ml/min，214和254nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-1.5min，5-95％b；1.5-3min，95％b。该化合物保留时间为0.35min。
[0817]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.61(s，1h)，8.40(s，1h)，8.17(s，1h)，7.86(brs， 2h)，7.41-7.06(m，10h)，6.30-6.18(m，1h)，6.09(d，j＝8.4hz，1h)，5.42-5.30(m， 2h)，5.30-5.20(m，1h)，4.27(d，j＝4.4hz，1h)，4.20-4.05(m，2h)，4.04-3.90(m，2h)， 3.72-3.62(m，2h)，2.85-2.55(m，2h)。31p nmr(162mhz，dmso-d6)δ56.62， 53.65。ms-esi[m-h]-：707.0。
[0818]
实施例7：(3’，3’)-环-(rp，rp)-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-腺苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
‑ꢀ
氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]二铵盐
[0819][0820]
实施例7是采用实施例5的路线、由中间体73和28％氨水反应后，用制备液相色谱(10mm碳酸氢铵作为添加剂)纯化得到。分析lcms：agilent1100+g1946d lcms，4.6x150mm waters xbridge c18 3.5μm分析柱，流动相a 为10mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速1ml/min，214和254nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-8min，5-95％b；8-15min，95％b。该化合物保留时间为4.1min。
[0821]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.62(s，1h)，8.23(s，1h)，8.19(s，1h)，7.95(brs， 2h)，7.65(brs，2h)，7.14(t，j＝52.0hz，8h)，6.30-6.22(m，1h)，6.12(d，j＝8.4hz， 1h)，5.50-5.32(m，2h)，5.30-5.15(m，1h)，5.08-4.92(m，1h)，4.30-4.00(m，5h)，3.95
‑ꢀ
3.86(m，1h)，3.68(d，j＝12.0hz，1h)。
31
p nmr(162mhz，dmso-d6)δ57.14，54.13。ms-esi[(m-2h)/2]-：362.0。
[0822]
实施例8：(2’，3’)-环-(sp，rp)-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-鸟苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
‑ꢀ
氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]二铵盐，和
[0823]
实施例9：(2’，3’)-环-(sp，sp)-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-鸟苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
‑ꢀ
氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]二铵盐
[0824]
实施例8和实施例9是采用实施例5的路线、由中间体74和28％氨水反应后，用制备
液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm welch 10μm制备柱，流动相a为10mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速25ml/min，214和254nm 双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-3min，0-2％b；3-14min，2-37％b；14-14.3 min，37-95％b；14.3-20min，95％b。化合物8保留时间为13min，化合物9保留时间为15min)纯化得到。
[0825]
实施例8：
[0826][0827]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.62(brs，1h)，8.19(s，1h)，8.11(s，1h)，7.94(brs， 2h)，7.10(t，j＝50.8hz，8h)，6.63(brs，2h)，6.25(dd，j＝24.0，2.8hz，1h)，5.85(d， j＝8.8hz，1h)，5.50-5.15(m，4h)，4.30-4.13(m，2h)，4.12-3.92(m，4h)，3.72(d，j＝ 12.0hz，1h)。
31
p nmr(162mhz，dmso-d6)δ56.84，54.05。ms-esi[m-h]-：741.0。
[0828]
实施例9：
[0829][0830]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.67(brs，1h)，8.23(s，1h)，8.08(s，1h)，7.93(brs， 2h)，7.10(t，j＝51.2hz，8h)，6.67(brs，2h)，6.30(dd，j＝18.8，3.6hz，1h)，5.77(d， j＝8.0hz，1h)，5.58-5.38(m，1h)，5.02-4.92(m，1h)，4.86-4.78(m，1h)，4.69-4.60 (m，1h)，4.33-3.75(m，7h)。
31
p nmr(162mhz，dmso-d6)δ59.03，54.74。ms-esi [m-h]-：740.9。
[0831]
实施例10：(2’，3’)-环-(rp，rp)-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-鸟苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
‑ꢀ
氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]二铵盐
[0832][0833]
实施例10是采用实施例5的路线、由中间体75和28％氨水反应后，用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm welch 10μm制备柱，流动相a 为10mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速25ml/min，214和254nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-3min，0-3％b；3-14min，3-38％b；14-14.3min， 38-95％b；14.3-20min，95％b。该化合物保留时间为13min)
纯化得到。实施例 10还采用实施例25的路线、经中间体98脱保护后，用制备液相色谱纯化得到。两条不同的合成路线得到完全相同的产物。
[0834]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.63(brs，1h)，8.22(s，1h)，8.18(s，1h)，7.93(brs， 2h)，7.12(t，j＝51.2hz，8h)，6.69(brs，2h)，6.28(dd，j＝24.0，2.4hz，1h)，5.88(d， j＝8.4hz，1h)，5.42-4.80(m，4h)，4.45(d，j＝4.0hz，1h)，4.39-4.10(m，3h)，4.08
‑ꢀ
3.94(m，1h)，3.93-3.70(m，2h)。
31
p nmr(162mhz，dmso-d6)δ54.07，50.13。 ms-esi[m-h]-：741.0。
[0835]
实施例11：(2’，3’)-环-(sp，rp)-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-鸟苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
‑ꢀ
氯-2
’‑
脱氧-腺苷]二铵盐
[0836][0837]
实施例11是采用实施例5的路线、由中间体76和7m的氨甲醇溶液反应后，用制备液相色谱(10mm碳酸氢铵作为添加剂)纯化得到。分析lcns：agilent1100+g1946d lcms，4.6x150mm waters xbridge c18 3.5μm分析柱，流动相a 为10mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速1ml/min，214和254nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-8min，5-95％b；8-15min，95％b。该化合物保留时间为3.3min。
[0838]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.63(brs，1h)，8.39(s，1h)，8.21(s，1h)，7.83(brs， 2h)，7.10(t，j＝50.8hz，8h)，6.67(brs，2h)，6.30-6.18(m，1h)，5.87(d，j＝8.4hz， 1h)，5.35-5.20(m，2h)，4.28(d，j＝4.0hz，1h)，4.21-3.92(m，4h)，3.80-3.60(m，2h)， 2.92-2.70(m，1h)，2.69-2.55(m，1h)。
31
p nmr(162mhz，dmso-d6)δ56.96，54.34。 ms-esi[m-h]-：722.9。
[0839]
实施例12：(2’，3’)-环-(rp，rp)-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-鸟苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
‑ꢀ
氯-2
’‑
脱氧-腺苷]二铵盐
[0840][0841]
实施例12是采用实施例5的路线、由中间体77和7m的氨甲醇溶液反应后，用制备液相色谱(10mm碳酸氢铵作为添加剂)纯化得到。分析lcms：agilent1100+g1946d lcms，4.6x150mm waters xbridge c18 3.5μm分析柱，流动相a 为10mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速1ml/min，214和254nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-8min，5-95％b；8-15min，95％b。该化合物保留时间为3.3min。
[0842]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.61(brs，1h)，8.39(s，1h)，8.20(s，1h)，7.82(brs，
2h)，7.11(t，j＝51.2hz，8h)，6.70(brs，2h)，6.30-6.18(m，1h)，5.87(d，j＝8.4hz， 1h)，5.25-5.13(m，2h)，4.96(s，1h)，4.50(d，j＝4.4hz，1h)，4.31-3.71(m，6h)，3.03
‑ꢀ
2.82(m，1h)，2.65-2.50(m，1h)。
31
p nmr(162mhz，dmso-d6)δ54.26，49.51。 ms-esi[m-h]-：722.8。
[0843]
实施例13：(2’，3’)-环-(rp，rp)-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-鸟苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯
‑ꢀ2’‑
脱氧-2’，2
’‑
二氟胞苷]二铵盐
[0844][0845]
实施例13是采用实施例5的路线、由中间体78和28％氨水反应后，用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm welch 10μm制备柱，流动相a 为10mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速25ml/min，214和254nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-3min，0-3％b；3-14min，3-25％b；14-14.3min， 25-95％b；14.3-20min，95％b。该化合物保留时间为2min)纯化得到。
[0846]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.16(s，1h)，7.60-6.70(m，11h)，6.58(brs，2h)， 6.35-6.20(m，1h)，5.90-5.70(m，2h)，5.22-5.10(m，1h)，5.00-4.80(m，2h)，4.52(s， 1h)，4.32-4.15(m，2h)，4.11(s，1h)，4.00-3.82(m，2h)，3.78-3.65(m，1h)。
31
p nmr (162mhz，dmso-d6)δ53.24，48.05。ms-esi[(m-2h)/2]-：350.0。
[0847]
实施例14：(2’，3’)-环-(rp，rp)-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-鸟苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯
‑ꢀ
n4-(2-丙基戊酰基)-2
’‑
脱氧-2’，2
’‑
二氟胞苷]二铵盐
[0848][0849]
实施例14和是采用实施例5的路线、由中间体79和7m的氨甲醇溶液反应后，用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm welch 10μm制备柱，流动相a为10mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速25ml/min，214和254nm 双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-3min，0-10％b；3-14min，10-55％b；14
‑ꢀ
14.3min，55-95％b；14.3-20min，95％b。该化合物保留时间为11min)纯化得到。
[0850]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ11.07(brs，1h)，10.62(s，1h)，8.68-7.97(m，2h)， 7.40-6.97(m，9h)，6.59(brs，2h)，6.34-6.20(m，1h)，5.90-5.70(m，1h)，5.47-5.09(m， 2h)，5.05-4.74(m，1h)，4.29(d，j＝4.4hz，1h)，4.20(d，j＝9.6hz，1h)，4.13-3.99 (m，2h)，3.95-3.80(m，lh)，3.85-3.65(m，1h)，2.70-2.55(m，1h)，1.60-1.46(m，2h)， 1.45-1.10(m，6h)，0.86(t，j＝7.2hz，6h)。
31
p nmr(162mhz，dmso-d6)δ56.16， 53.39。ms-esi[m-h]-：
827.0。
[0851]
实施例15：(3’，3’)-环-(sp，rp)-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-鸟苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
‑ꢀ
氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]二铵盐
[0852][0853]
实施例15是采用实施例5的路线、由中间体80和7m的氨甲醇溶液反应后，用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm welch 10μm制备柱，流动相a为10mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速25ml/min，214和254nm 双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-3min，0-3％b；3-14min，3-33％b；14-14.3 min，33-95％b；14.3-20min，95％b。该化合物保留时间为11min)纯化得到。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.20(d，j＝2.8hz，1h)，8.04(s，1h)，8.03-6.87(m， 10h)，6.60(brs，2h)，6.22(dd，j＝24.0，2.0hz，1h)，5.85(d，j＝8.8hz，1h)，5.51
‑ꢀ
5.15(m，3h)，4.35-3.89(m，6h)，3.72(d，j＝12.4hz，1h)。
31
p nmr(162mhz， dmso-d6)δ56.65，54.03。ms-esi[m-h]-：741.0。
[0854]
实施例16：(3’，3’)-环-(rp，rp)-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-鸟苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
‑ꢀ
氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]二铵盐
[0855][0856]
实施例16是采用实施例5的路线、由中间体81和7m的氨甲醇溶液反应后，用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm welch 10μm制备柱，流动相a为10mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速25ml/min，214和254nm 双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-3min，0-3％b；3-14min，3-33％b；14-14.3 min，33-95％b；14.3-20min，95％b。该化合物保留时间为13min)纯化得到。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.63(brs，1h)，8.22(s，1h)，8.09(s，1h)，7.94(brs， 2h)，7.38-6.94(m，8h)，6.65(brs，2h)，6.28(dd，j＝24.0，2.4hz，1h)，5.87(d，j＝8.8 hz，1h)，5.42-5.11(m，3h)，5.00(s，1h)，4.56-4.42(m，1h)，4.39-4.21(m，2h)，4.13 (s，1h)，4.05-3.94(m，1h)，3.89-3.71(m，2h)。
31
p nmr(162mhz，dmso-d6)δ 53.97，49.08。ms-esi[m-h]-：740.9。
[0857]
实施例17：(3’，3’)-环-(rp，rp)-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-鸟苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
‑ꢀ
氯-2
’‑
脱氧-腺苷]二铵盐
[0858][0859]
实施例17采用实施例5的路线，由中间体82和7m的氨甲醇溶液反应后，用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm welch 10μm制备柱，流动相a为l 0mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速25ml/min，214和254nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-3min，0-3％b；3-14min，3-33％b；14-14.3min， 33-95％b；14.3-20min，95％b。该化合物保留时间为11min)纯化得到。
[0860]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.59(brs，1h)，8.41(s，1h)，8.11(s，1h)，7.85(brs， 2h)，7.15(brs，8h)，6.66(brs，2h)，6.25(dd，j＝12.8，6.0hz，1h)，5.85(d，j＝8.8hz， 1h)，5.35-5.11(m，2h)，4.91(s，1h)，4.59-4.50(m，1h)，4.31-3.71(m，6h)，3.03-2.87 (m，1h)。
31
p nmr(162mhz，dmso-d6)δ53.46，47.84。ms-esi[m-h]-：740.9。
[0861]
实施例18：(3’，3’)-环-(rp，rp)-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟腺苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta腺苷]-0.5-铵-1.5-1，8-二氮杂二环十一碳-7
‑ꢀ
烯-盐
[0862][0863]
实施例18是采用实施例1的路线、由中间体67和(-)-psi试剂反应后，用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm welch 10μm制备柱，流动相 a为10mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速25ml/min，214和254nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-3min，0-5％b；3-14min，5-33％b；14-14.3min，33-95％b；14.3-20min，95％b。该化合物保留时间为11min)纯化得到。
[0864]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ9.62(brs，2h)，8.39(s，1h)，8.26(d，j＝2.0hz，1h)， 8.18(s，1h)，7.36(brs，2h)，7.15(t，j＝52.0hz，2h)，6.31-6.20(m，2h)，5.46-5.25(m， 2h)，5.15-5.00(m，1h)，4.95-4.83(m，1h)，4.42-4.25(m，1h)，4.10-3.98(m，2h)，3.80
‑ꢀ
3.60(m，2h)，3.60-3.40(m，6h)，3.30-3.20(m，3h)，2.70-2.55(m，3h)，1.96-1.85(m， 3h)，1.73-1.50(m，9h)。
31
p nmr(162mhz，dmso-d6)δ53.37，52.10。ms-esi [m+h]
+
：729.0。
[0865]
实施例19：(3’，3’)-环-(rp，rp)-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟腺苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧腺苷]0.5-1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯-盐
[0866][0867]
实施例19是采用实施例1的路线、由中间体68和(-)-psi试剂反应后，用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm welch 10μm制备柱，流动相 a为0.05％甲酸水溶液，b为0.05％甲酸的乙腈溶液，流速25ml/min，214和254nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-3min，0-10％b；3-14min，10-50％b； 14-14.3min，50-95％b；14.3-20min，95％b。该化合物保留时间为10min)纯化得到。
[0868]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ9.56(s，1h)，8.60(s，1h)，8.50-8.35(m，1h)，8.28 (s，1h)，7.85(brs，2h)，6.40-6.20(m，2h)，5.70-5.40(m，1h)，5.18-4.80(m，2h)，4.60
‑ꢀ
3.95(m，6h)，3.65-3.45(m，2h)，3.30-3.20(m，1h)，2.85-2.71(m，1h)，2.70-2.55(m， 2h)，1.96-1.85(m，1h)，1.73-1.50(m，3h)。
31
p nmr(162mhz，dmso-d6)δ54.78， 54.00。ms-esi[m+h]
+
：710.8。
[0869]
实施例20：(3’，3’)-环-(rp，rp)-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟鸟苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta腺苷]二铵盐
[0870][0871]
实施例20是采用实施例1的路线、由中间体69和(-)-psi试剂反应后，用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm waters xbridge c18 10μm制备柱，流动相a为10mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速25ml/min，214和 254nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-2min，5％b；2-9min，5-15％b；9
‑ꢀ
19min，15-25％b；19-19.5min，25-95％b；19.5-22.5min，95％b。该化合物保留时间9min)纯化得到。
[0872]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.69(brs，1h)，8.26(s，1h)，7.98(s，1h)，7.92(brs， 2h)，7.15(t，j＝52.0hz，6h)，6.64(brs，2h)，6.26(dd，j＝17.2，3.6hz，1h)，6.08(d，j＝16.8hz，1h)，5.43-5.35(m，1h)，5.31-5.22(m，1h)，5.18-5.02(m，1h)，4.99-4.85 (m，1h)，4.42-4.30(m，1h)，4.26(d，j＝8.8hz，1h)，4.15-4.00(m，2h)，3.90-3.70(m， 2h)。
31
p nmr(162mhz，dmso-d6)δ54.20，53.14。ms-esi[m-h]-：743.2。
[0873]
实施例21：(3’，3’)-环-(rp，rp)-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟鸟苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧腺苷]二铵盐
[0874][0875]
实施例21是采用实施例1的路线、由中间体70和(-)-psi试剂反应后，用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm waters xbridge c18 10μm制备柱，流动相a为10mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速25ml/min，214和 254nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-2min，5％b；2-10min，5-20％b； 10-10.6min，20-95％b；10.6-12.6min，95％b。该化合物保留时间7.3min)纯化得到。
[0876]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.67(brs，1h)，8.49(s，1h)，7.92(s，1h)，7.82(brs， 2h)，7.14(t，j＝52.0hz，6h)，6.62(s，2h)，6.25(dd，j＝6.4，4.8hz，1h)，6.05(d，j＝ 16.8hz，1h)，5.44(dd，j＝52.0，4.0hz，1h)，5.05-4.85(m，2h)，4.33(d，j＝12.4hz，1h)，4.23(d，j＝9.2hz，1h)，4.10-3.92(m，2h)，3.98-3.50(m，2h)，2.78-2.54(m， 2h)。
31
p nmr(162mhz，dmso-d6)δ52.56，52.51。ms-esi[m-h]-：725.2。
[0877]
实施例22：(2’，3’)-环-[2
’‑
o-磷酸二酯-鸟苷]-[3
’‑
o-磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟
‑ꢀ
beta-腺苷]
[0878][0879]
实施例22是采用实施例9的路线、由中间体95和氟化铵在甲醇溶液中反应后，用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm waters xbridge c1810μm制备柱，流动相a为10mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速25ml/min， 214和254nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-2min，5％b；2-15.6min，5
‑ꢀ
20％b；15.6-15.8min，20-95％b；15.8-18min，95％b。该化合物保留时间6.6min) 纯化得到。
[0880]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.77(s，1h)，8.20(d，j＝2.8hz，1h)，7.99(s，1h)， 7.93(brs，2h)，6.71(brs，2h)，6.33(dd，j＝24.0，2.4hz，1h)，5.90(d，j＝8.0hz，1h)， 5.40(d，j＝49.6hz，1h)，5.20-5.00(m，2h)，4.42-4.30(m，2h)，4.20-3.80(m，6h)。
31
p nmr(162mhz，dmso-d6)δ1.61，-0.07。ms-esi[m+h]
+
：710.9。
[0881]
实施例23：(2’，3’)-环-[2
’‑
o-rp-硫代磷酸二酯-鸟苷]-[3
’‑
o-磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]二铵盐
[0882][0883]
向中间体96(75mg，0.074mmol)加入33％的甲胺乙醇溶液(3ml)，并在室温下搅拌3小时。将反应液旋干后加入氟化铵(82mg，2.2mmol)和甲醇(3ml)在 60℃搅拌16小时。用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm watersxbridge c18 10μm制备柱，流动相a为10mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速25ml/min，214和254nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-2min，5％b； 2-18.9min，5-15％b；18.9-19.4min，15-95％b；19.4-22.4min，95％b。该化合物保留时间8.5min)纯化，冻干后得到白色固体(30.3mg)。
[0884]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.60(s，1h)，8.21(d，j＝2.8hz，1h)，8.01(s，1h)， 7.91(s，2h)，7.35-6.94(m，6h)，6.63(s，2h)，6.29(dd，j＝24.4，1.6hz，1h)，5.86(d，j ＝8.0hz，1h)，5.42-5.17(m，2h)，5.09-4.90(m，2h)，4.48(d，j＝4.0hz，1h)，4.36 (dd，j＝10.8，5.2hz，1h)，4.28-4.17(m，1h)，4.09(s，1h)，3.98-3.73(m，3h)。
31
pnmr(162mhz，dmso-d6)δ48.92，-2.42。ms-esi[m+h]
+
：726.8。
[0885]
实施例24：(2’，3’)-环-[2
’‑
o-磷酸二酯-鸟苷]-[3
’‑
o-rp-硫代磷酸二酯-2-氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]
[0886][0887]
实施例24是采用实施例9的路线、由中间体97和氟化铵在甲醇溶液中反应后，用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm waters xbridge c1810μm制备柱，流动相a为10mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速25ml/min， 214和254mm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-2min，20％b；2-14min，20
‑ꢀ
40％b；14-14.2min，40-95％b；14.2-18min，95％b。该化合物保留时间2min) 纯化得到。
[0888]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.58(s，1h)，8.19(d，j＝2.8hz，1h)，8.04-7.82 (m，2h)，7.37-7.00(m，4h)，6.73-6.53(m，1h)，6.27(dd，j＝24.0，2.4hz，1h)，5.83 (d，j＝8.3hz，1h)，5.44-5.19(m，2h)，5.18-5.06(m，1h)，5.04-4.95(m，1h)，4.36
ꢀ‑
4.27(m，2h)，4.12(s，1h)，4.09-3.96(m，2h)，3.79-3.65(m，2h).
31
p nmr(162 mhz，dmso-d6)δ53.89(s)，-1.20(s)。19f nmr(376mhz，dmso-d6)δ-195.45 (s)。ms-esi[m+h]
+
：726。
[0889]
实施例25：(2’，3’)-环-(rp，sp)-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-鸟苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
‑ꢀ
氯-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]二铵盐
[0890][0891]
将中间体90(100mg，粗品)溶于7m的氨甲醇溶液(3ml)中，室温(28℃)搅拌4小时后旋干。所得残留物溶于甲醇(1ml)，加入氟化铵(60.5mg，1.63mmol)，加热(60℃)搅拌20小时，lcms和hplc监测反应完全后，反应液用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm waters xbridge c18 10μm制备柱，流动相a为10mm碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速25ml/min，214和254nm 双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-2min，5％b；2-18.9min，5-15％b；18.9-19.4 min，15-95％b；19.4-22.4min，95％b。该化合物保留时间10min)纯化，冻干后得到白色固体(21mg)。
[0892]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.71(s，1h)，8.44(s，1h)，8.23(s，1h)，7.92(s，2h)， 7.11(t，j＝52hz，6h)，6.56(s，2h)，6.29(d，j＝28hz，1h)，5.95(d，j＝8.4hz，1h)， 5.35(d，j＝50.4hz，1h)，5.20(t，j＝11.8hz，1h)，5.11-5.05(m，1h)，4.48(d，j＝3.6 hz，1h)，4.39-4.28(m，2h)，4.14(s，1h)，4.02-3.96(m，1h)，3.88-3.83(m，1h)，3.81
‑ꢀ
3.76(m，1h)。
31
p nmr(162mhz，dmso-d6)δ53.30，50.07。
19
f nmr(376mhz， dmso-d6)δ-196.87。ms-esi[m+h]
+
：742.8。
[0893]
实施例26：(2’，3’)-环-(rp，rp)-[2
’‑
o-硫代磷酸二酯-鸟苷]-[3
’‑
o-硫代磷酸二酯-2
‑ꢀ
甲胺基-2
’‑
脱氧-2
’‑
氟-beta-腺苷]二铵盐
[0894][0895]
实施例26是采用实施例25的路线、由中间体98与甲胺的乙醇溶液进行脱保护反应产生的副产物，用制备液相色谱反应液用制备液相色谱(gilson 281制备hplc，19x250mm waters xbridge c18 10μm制备柱，流动相a为10mm 碳酸氢铵水溶液，b为乙腈，流速25ml/min，214和254nm双波长紫外吸收监测，梯度洗脱：0-2min，5％b；2-15.6min，5-15％b；15.6-15.8min，15-95％b； 15.8-18min，95％b。该化合物保留时间14.1min)纯化，冻干后得到白色固体。
[0896]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.69(brs，1h)，8.27(s，1h)，8.02(s，1h)，7.34-6.97 (m，3h)，6.31(brs，1h)，6.28(d，j＝2.4hz，1h)，5.90(d，j＝0.8hz，1h)，5.44-5.15 (m，3h)，4.44(d，j＝0.4hz，1h)，4.35-4.27(m，1h)，4.24-4.12(m，2h)，4.03-3.94(m， 1h)，3.93-3.79(m，2h)，2.85(s，3h)。
31
p nmr(162mhz，dmso-d6)δ54.02，51.06。 ms+esi-.[m+h]：738.0。
[0897]
活性实施例
[0898]
实施例1：本发明化合物对thp-1细胞分泌ifn-β的激活作用
[0899]
thp-1细胞是一种人单核细胞白血病细胞系，其sting表型为haq型，即r71h-g230a-r293q。本实验使用r&d公司的human ifn-beta duoset elisa 试剂盒(r&d公司，货号#dy814-05)和duoset elisa ancillary reagent kit 2 (r&d公司，货号#dy008)评估代表性本发明化合物对thp-1细胞分泌ifn-β的激活作用。
[0900]
复苏thp-1细胞(atcc#tib-202)时，细胞冻存管于37℃水浴中快速摇动使其在1min内融解。取融解后的细胞悬液与含10％fbs(lifetechnology公司，货号#10099-141)的rpmi1640培养基(hyclone公司，货号#sh30027.01)混匀， 1000转/min离心5min，弃上清。取5ml完全培养基(含10％fbs的rpmi1640 培养基)重悬细胞沉淀，置于底面积25cm2的细胞培养瓶中，放入37℃、5％co2、 95％湿度的细胞培养箱中培养。细胞汇合率达到80％左右时进行细胞传代。细胞传代时，将培养瓶内所有细胞转至15ml离心管中，1000转/min离心5min，弃上清。加入5ml新的完全培养基重悬细胞沉淀，取1ml置于底面积25cm2的细胞培养瓶中，补入4ml新鲜的完全培养基继续培养。细胞汇合率再次达到 80％左右时进行铺板。铺板时参照细胞传代方法，保留1/5细胞悬液继续培养，将剩余4/5细胞悬液置于15ml离心管中。离心，弃去旧培养基，使用rpmi1640 培养基(不添加血清)洗涤细胞一次，离心去上清。用rpmi1640培养基(不添加血清)重悬细胞。台盼蓝排斥法检测细胞活率，确保细胞活率95％以上时铺板。使用rpmi1640培养基(不添加血清)配制密度为1.1
×
106个活细胞/ml的细胞悬液，添加180μl细胞悬液至96孔细胞培养板孔(nunc公司，货号#167008)中，使得培养板中细胞密度为2
×
105个活细胞/孔。
[0901]
首先使用dmso(sigma公司，货号#d2650)连续稀释10mm化合物的dmso 储备液，稀释倍数为3.16倍，稀释至第5个浓度，并设置第6个浓度不合化合物的dmso对照。然后使用pbs稀释含不同浓度化合物的dmso溶液，稀释倍数为10倍，使各浓度化合物溶液中dmso含量为10％。最后加20μl上述溶液至对应的细胞培养板中，使化合物起始浓度为100μm，相邻浓度稀释倍数为3.16倍，细胞培养板中dmso含量为1％。细胞板置于细胞培养箱中继续培养24小时。
[0902]
elisa检测过程参照r&d system，cat#dy814-05说明书进行。
[0903]
elisa板包被：使用pbs(r&d system cat#dy006)稀释捕获抗体(小鼠抗人ifn-β捕获抗体part#844508)配制成工作浓度，加100μl捕获抗体工作液至96孔elisa板中，封板并放置在室温孵育过夜。弃去捕获抗体工作液，使用洗涤缓冲液(0.05％tween-20的pbs溶液ph 7.2-7.4，r&d system cat#wa126) 洗涤细胞板3次，每孔使用400μl洗涤缓冲液，每次洗涤充分移除洗涤缓冲液，最后一次洗涤在干净的纸上倒置拍板以完全移除洗涤缓冲液。每孔加入300μl 封闭缓冲液(1％bsa的pbs溶液ph 7.2-7.4，r&d system cat#dy995)，放置在室温孵育1～2小时。重复以上洗涤步骤，准备各板以用于样品添加。
[0904]
样品检测：每孔加入100μl样品或者标准品(重组人ifn-β标准品， part#844510)，封板并放置室温孵育2小时，并重复以上板包被方法的洗涤步骤。然后，每孔加入100μl检测抗体(生物素化鼠抗人ifn-β检测抗体， part#844509)，封板并放置在室温孵育2小时，并重复以上板包被方法的洗涤步骤。随后，每孔加入100μl streptavidin-hrp(part#893975)工作液，封板并放置在室温孵育20min，此过程避光，重复以上板包被方法的洗涤步骤。然后，每孔加入100μl底物溶液(colar reagenta(h2o2)和color reagent b(四甲基联苯胺) 的1∶
1混合物，r&d system cat#dy999)，封板并放置在室温孵育20min，此过程避光。最后，每孔加入50μl终止溶液(2n h2so4，r&d system cat#dy994)，轻敲细胞板以确保充分混匀。
[0905]
使用多功能酶标仪(molecular devices公司，spectramax m3)测定每孔的 od450。如果波长校准功能可用，设置为540nm或570nm。如果波长校准功能不可用，使用od450减去od540或者od570。此过程在加入终止溶液后30min 内完成。
[0906]
使用2
′3′‑
cgamp(invivogen公司，货号#tlrl-nacga23)作为阳性对照化合物，使用adu-s100(mce，货号#hy12885a)作为对比化合物：
[0907][0908]
使用graphpad prism 7.0软件分析数据，利用双对数作图求得elisa ifn-β含量的标准曲线。将各样品孔检测所得od值代入标准曲线方程中求出相应ifn
‑ꢀ
β浓度。以非线性s曲线回归拟合数据得出ifn-β浓度与化合物浓度的剂量-效应曲线，计算ec50值。
[0909]
表1-代表性实施例化合物对thp-1细胞ifn-β分泌的激活作用(ec50，μm)
[0910]
实施例thp-1活性实施例thp-1活性5b16a8b17a9b18b10a19b11b21b12a2
′
，3
′‑
cgampb13badu-s100a15b26a
[0911]
其中：a：ec50 1～10μm；b：ec50 10.1～100μm
[0912]
实验结果表明，实施例化合物对thp-1细胞ifn-β的分泌具有激活的作用。由表1和图1可知，实施例10、12、16、17和26化合物尤其具有显著的sting 激动剂活性：它们的ec50强于2
′
，3
′‑
cgamp，都和adu-s100相当；其中，实施例10、16和17化合物刺激thp-1细胞分泌ifn-β的最高浓度均高于adu
‑ꢀ
s100。
[0913]
实施例2：本发明化合物对ct26细胞增殖的抑制活性
[0914]
ct26细胞是一种小鼠结直肠癌细胞系。本实验使用promega公司的 celltiter-glo luminescence cell viability assay试剂盒评估化合物对ct26细胞增殖的抑制活性。
[0915]
复苏ct26细胞(atcc#crl-2638)时，细胞冻存管于37℃水浴中快速摇动使其在1min内融解。取融解后的细胞悬液与含10％fbs(gibco，货号#10099
‑ꢀ
141)的dmem培养基(ge公司，货号#sh30243.01)混匀，1000转/min离心5 min，弃上清。取5ml完全培养基(含
10％fbs的dmem培养基)重悬细胞沉淀，置于底面积25cm2的细胞培养瓶中，放入37℃、5％co2、95％湿度的细胞培养箱中培养。细胞汇合率达到70％～80％时进行细胞传代。细胞传代时，将培养瓶内所有细胞转至15ml离心管中，1000转/min离心5min，弃上清。加入5 ml新的完全培养基重悬细胞沉淀，取1ml置于底面积25cm2的细胞培养瓶中，补入4ml新鲜的完全培养基继续培养。细胞汇合率再次达到70％～80％时进行铺板。铺板时参照细胞传代方法，保留1/5细胞悬液继续培养，将剩余4/5 细胞悬液置于15ml离心管中。离心，弃去旧培养基，使用dmem培养基(不添加血清)洗涤细胞一次，离心去上清。用dmem培养基(不添加血清)重悬细胞。台盼蓝排斥法检测细胞活率，确保细胞活率95％以上时铺板。使用dmem培养基(不添加血清)配制密度为1.1
×
104个活细胞/ml的细胞悬液，加90μl细胞悬液至96孔透明平底黑壁细胞培养板孔(coming，货号#3603)中，使得培养板中细胞密度为1000个活细胞/孔。设置不含细胞、不含化合物、仅含完全培养基的对照组(即培养液对照)，并设置不含化合物、含细胞的对照组(即细胞对照)。细胞板置于细胞培养箱中培养过夜。
[0916]
首先使用dmso(sigma公司，货号#d2650)连续稀释10mm化合物dmso 储备液，稀释倍数为3.16倍，稀释至第9个浓度，并设置第10个浓度不合化合物的dmso对照。然后使用pbs(solarbio公司，货号#p1020)稀释含不同浓度化合物的dmso溶液，稀释倍数为10倍，使各浓度化合物溶液中dmso含量为 10％。最后加10μl上述溶液至对应的细胞培养板中，使化合物起始浓度为100 μm，相邻浓度稀释倍数为3.16倍，细胞培养板中dmso含量为1％。细胞板置于细胞培养箱中继续培养120小时。
[0917]
120小时后，融化celltiter-glo试剂(promega，货号#g7572)并将细胞板移至室温平衡30min，加100ul的celltiter-glo至细胞板每个孔中，在定轨摇床上振动5min使细胞充分裂解，将细胞板放置于室温20min以稳定冷光信号，用多功能酶标仪(molecular devices公司，spectramax m3)全波长扫描各孔的冷光值。
[0918]
采用以下化合物和adu-s100(mce，货号#hy12885a)作为对照：氯法拉滨 (clofarabine；芜湖华仁科技，货号#hr-00701002)、克拉屈滨(cladribine； csnpharm，货号#csn10004)、盐酸吉西他滨(gemcitabine hydrochloride；韶远，货号#sy014538)、吉西他滨前药ly2334737(自制，中间体7)。
[0919]
使用下列公式计算各浓度化合物作用下的细胞存活率：
[0920]
细胞存活率(％)＝(lum
待测药-lum
培养液对照
)/(lum
细胞对照-lum
培养液对照
)
×
100％。
[0921]
使用graphpad prism 7.0软件分析数据，利用非线性s曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算ic50值。
[0922]
表2实施例对ct26细胞增殖的抑制作用(ec50，μm)
[0923]
[0924][0925]
其中：a：ic50＜1μm；b：ic501～10μm；na：ic50＞10μm
[0926]
实验结果表明，代表性实施例化合物能够抑制ct26肿瘤细胞的体外生长；其中，实施例3、10和13化合物的抑制能力尤其显著，而adu-s100无明显的肿瘤细胞抑制能力。结合活性实施例1的结果，该结果表明了实施例化合物具有多功能抗肿瘤属性，即sting激动剂的肿瘤免疫活性和抗代谢抗癌药的细胞毒性作用。
[0927]
实施例3：本发明化合物在ct26同基因小鼠双侧移植瘤模型中的抗肿瘤活性
[0928]
将6～8周balb/c小鼠(购自上海灵畅生物科技有限公司)分别于左右后侧背部皮下接种5
×
105个ct26细胞(太仓泽鑫生物科技有限公司提供，atcc#crl
‑ꢀ
2638)，接种体积为0.1ml/侧。当肿瘤生长至平均体积100mm3时，根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组并开始给药。第一次给药当天为第0天。共给药两次，在第0、第4天，右侧瘤内注射给药50ug化合物/鼠(即2.5mg/kg)，以同体积 pbs(hyclone公司，货号#sh30258.01)作为对照。左侧肿瘤不做任何处理。给药 13天后处死对照组小鼠，21天后处死治疗组小鼠。实验期间，每周3次测量左、右测肿瘤体积和体重，肿瘤体积计算公式为v＝d
×d×
d/2(其中d表示肿瘤长径， d表示肿瘤短径)。
[0929]
给药后第13天的数据表明，所测试的本发明实施例化合物均能够明显抑制双侧肿瘤生长。右侧给药组效果更为显著，大部分肿瘤消褪(图2-a)。其中，adu
‑ꢀ
s100治疗组的肿瘤生长抑制率为99.1％，实施例17为99.5％，其余各组肿瘤 100％抑制，未触摸到肿瘤。同时，未经治疗的左侧肿瘤生长减缓(图2-b)。在给药后第13天，左侧肿瘤各组生长抑制率分别为：adu-s100，64.2％；实施例10， 91.2％；实施例12，75.3％；实施例16，71.7％；实施例17，67.4％。另外，本实验中观察到给药后个别小鼠体重下降，在15％以内，停止给药后体重恢复(图2
‑ꢀ
c)。以上结果表明，本发明的化合物在ct26同基因双侧瘤模型中均表现出了相当或优于adu-s100的肿瘤抑制能力。
[0930]
实施例4：本发明化合物在ct26裸鼠移植瘤模型中的抗肿瘤活性
[0931]
将6～8周balb/c裸鼠(购自上海灵畅生物科技有限公司)分别于右后侧背部皮下接种5
×
105个ct26细胞(由太仓泽鑫生物科技有限公司提供，atcc#crl
‑ꢀ
2638)，接种体积为0.1ml。当肿瘤生长至平均体积100mm3时，根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组进行给药。第一次给药当天为第0天。共给药两次，在第0 天和第4天，右侧瘤内注射50ug化合物/鼠(即2.5mg/kg)，以同体积pbs(hyclone 公司，货号#sh30258.01)作为对照。给药9天后处死对照组小鼠，14天、16天后相继处死adu-s100和实施例10化合物治疗组小鼠。实验期间，每周3次测量肿瘤体积和体重，肿瘤体积计算公式为v＝d
×d×
d/2(同上)。
[0932]
给药后第9天的数据表明，所测试的本发明实施例10化合物在t细胞免疫缺陷的裸鼠中能够明显抑制肿瘤生长，抑制率为94.4％。与之相比，adu-s100 仅表现出部分肿瘤抑制能力，其抑制率为61.4％，可能由于其残存的免疫活性或其他未知原因。而无论是实施例10还是adu-s100，它们对免疫健全鼠的肿瘤生长抑制效果均比裸鼠更好(图2d)。该实验验
01；杜氏磷酸盐缓冲液，1.5ml，invitrogen公司，货号#14200-075；glutamax，500μl，invitrogen公司，货号#35050061；hepes， 750μl，invitrogen公司，货号#15630106；胎牛血清，2.5ml，invitrogen公司，货号#10091130；重组人胰岛素，50μl，invitrogen公司，货号#12585014；地塞米松(配成10mm dmso溶液)，5μl，sigma公司，货号#d1756)中，轻轻混匀，以500转/分离心3min。离心后，小心吸走上清液(不要干扰细胞沉淀)，添加10
×
体积的预热khb缓冲液(krebs-henseleit缓冲液，sigma，cat#k3753-10x1l)和 5.6g/l hepes，重悬细胞沉淀，轻轻混匀，以500转/分离心3min。吸弃上清液，勿触及细胞沉淀，测定细胞活力和数量。计数肝细胞，然后将细胞悬浮液 khb缓冲液稀释至适当密度(活细胞密度＝2
×
106个细胞/ml)。把肝细胞溶液放在冰上直到使用。
[0941]
在预热的khb(1％二甲基亚砜)中制备2
×
加药溶液，在5594g下离心15 min(thermo multifuge
×
3r)，其中，200μm加标溶液：在980μl二甲基亚砜中加入20μl化合物储存液(10mm，dmso溶液)；2
×
加药溶液：在990μl khb 中加入10μl 200μm加标溶液(稀释后2μm)。
[0942]
向指定的不同时间点的孔中添加50μl预热的2
×
加药溶液。将50μl预热的肝细胞溶液(2
×
106个细胞/ml)加入指定的孔中，用于15min、30min、60min 和120min检测，然后开始计时，将反应板置于37℃培养箱中。
[0943]
将100μl含is(柳胺酚或丙咪嗪)的乙腈(merck，cat.#cn34854-4l)加入设计为0min的孔中，轻轻混合，然后添加50μl预热的肝细胞溶液(2
×
106个细胞 /ml)，封闭孔板。在15min、30min、60min和120min，分别向孔中添加100 μl含is的乙腈，然后封闭。淬火后，在振动器(ika，mts 2/4)上摇动平板10 min(600rpm)。将板超声处理2min，然后在5594g下离心15min(thermomultifuge
×
3r)。将每孔50μl上清液转移到含有50μl超纯水(milipore， zmqs50f01)的96孔样品板中，用于lc/ms分析。
[0944]
将t0时间点待测化合物浓度(c0)作为100％，其他孵育时间点的浓度转换为百分剩余量，将各时间点的百分剩余量的自然对数对孵育时间作线性回归，得斜率k，然后按照下面公式计算肝细胞清除速率(ci
int
)和体外半衰期(t1/2)：
[0945]
t1/2＝1n2/k＝0.693/k
[0946]
cl
int
＝(0.693/t1/2)
×
(1/肝细胞密度)
×
比例因子
[0947]
其中，肝细胞密度为本次实验孵育体系中肝细胞的终浓度：1
×
106个/ml。比例因子＝肝细胞数
×
肝重(对于5个物种的肝细胞，分别为：小鼠11812.5
×
106个 /kg，大鼠4680
×
106个/kg，狗6880
×
106个/kg，猴3900
×
106个/kg，人2544.3
×
106个/kg)。
[0948]
由图4a可知，本发明化合物如实施例10化合物在5个物种的肝细胞中均表现出了较好的代谢稳定性；它具有较长的代谢半衰期和低的清除速率。
[0949]
实施例7：本发明化合物的代谢产物的发现与鉴定
[0950]
根据本领域常规的体外代谢稳定性研究的标准方法，例如(kerns，edward h. and di li(2008).drug-like properties：concepts，structure design and methods：from adme to toxicity optimization.san diego：academic press；di，li等人， optimization of a higher throughput microsomal stability screening assay forprofiling drug discovery candidates，j biomol.screen.2003，8(4)，453.)中所述的方法，类似地鉴定本发明化合物在5个物种(小鼠、大鼠、狗、猴、人)肝细胞的主要代谢产物。
[0951]
实验所用肝细胞为：人肝细胞(shqy，cat.#bqhpch10，lot.#hep190006
‑ꢀ
ta05)；狗肝细胞(bioivt，cat.#m00205，lot.#zmb)；猴肝细胞(xenotech，cat. #ppch2000，lot.#2010022)；大鼠肝细胞(shqy，cat.#bqr1000
·
h15，lot.# hep134049)；小鼠肝细胞(bioivt，cat.#m005052，lot.#meo)。
[0952]
预热hi肝细胞维持培养基(bioivt，cat.#z99009；lot.#c02060c)至37℃。从液氮罐中取出冷冻保存的冻存管肝细胞，并立即置于37
±
1℃的振荡水浴中2 min
±
15秒。将肝细胞转移至50ml的hi培养基中，轻轻混匀，以500转/分离心3min。离心后，小心吸走上清液(不要干扰细胞沉淀)。加入10
×
体积的预热 hi培养基，重悬细胞沉淀，轻轻混匀，以500转/分离心3min。吸弃上清液，勿触及细胞沉淀。计数肝细胞，然后将细胞悬浮液用hi培养基稀释至适当密度 (活细胞密度＝2
×
106个细胞/ml)，把肝细胞溶液放在冰上直到使用。
[0953]
在预热hi培养基中制备2
×
加药溶液。如下配制2
×
加药溶液(20μm)：向 3992μlhi培养基中加入8μl10mm化合物储存液(20μm，即稀释后的0.2％二甲基亚砜)。
[0954]
预热肝细胞溶液和2
×
加药溶液，向指定用于t
240
和t
240-w/o
的孔中添加200 μl预热的2
×
加药溶液。对于t0，向孔中添加1200μl乙腈(merck，cat.#cn34854
‑ꢀ
4l)和200μl肝细胞溶液(2
×
106个细胞/ml)，然后添加200μl预热的2
×
加药溶液，封闭孔板。将200μl预热的肝细胞溶液(2
×
106个细胞/ml)添加到指定用于 t
240
的孔中；向指定用于t
240-w/o
的孔中添加200μl预热的hi培养基，并开始计时；将反应板置于37℃的co2培养箱中。
[0955]
240min时，分别向指定的孔中添加1200μl乙腈，然后封闭孔板。淬火后，对板进行超声波处理2min，然后在1400转/分下离心5min。在氮气流下蒸发 1200μl的上清液，直至干燥。然后用200μl乙腈∶水(1∶3v/v)将干燥的提取物重新溶解，涡旋振荡2min，在14000转/分下离心5min。将2/5μl上清液注入 lc-uv-ms进行分析。
[0956]
由图4-b可知，本发明化合物如实施例10化合物在5个物种的肝细胞中均可以检测到其分解生成的细胞毒性小分子氯法拉滨(clofarabine)，并且这是实施例10化合物的主要代谢产物。结合活性实施例6的结果，在进入体内一段时间内，极有可能同时存在具有sting激动活性的cdn分子和细胞毒性的小分子，从而实现分子水平的联用，提供一种增强、甚至协同的抗肿瘤效果。该结果也从机理上解释了其在小鼠抑瘤实验中效果良好的原因。
[0957]
实施例8：本发明化合物与单纯的cdn sting激动剂和细胞毒性药联用在ct26同基因小鼠双侧移植瘤模型中的抗肿瘤活性的药效对比
[0958]
将6～8周balb/c小鼠(购自上海灵畅生物科技有限公司)分别于左右后侧背部皮下接种5
×
105个ct26细胞(太仓泽鑫生物科技有限公司提供，atcc#crl
‑ꢀ
2638)，接种体积为0.1ml/侧。当肿瘤生长至平均体积100mm3时，根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组(本发明化合物组；单纯的cdn sting激动剂单药组；细胞毒性药单药组；单纯的cdn sting激动剂和细胞毒性药联用组)并开始给药。第一次给药当天为第0天。共给药三次，在第0、第4、第7天，右侧瘤内注射给药，以同体积pbs(hyclone公司，货号#sh30258.01)作为对照。左侧肿瘤不做任何处理。给药13天后处死对照组小鼠，21天后处死治疗组小鼠。实验期间，每周3次测量左、右测肿瘤体积和体重，肿瘤体积计算公式为v＝d
×d×
d/2(同上)。
[0959]
实验结果显示，本发明化合物组的肿瘤生长抑制率，显著高于cdn sting 单药组和细胞毒性药单药组的抑制率，其活性与后两者的活性加合相当，甚至更高，产生了提高的、甚至是协同的抑制肿瘤活性。
[0960]
本发明的各种枚举的实施方式中指定特征的一般或优选定义可以与其它指定特征的一般或优选组合，得到本发明另外的实施方式。就如同在本文中具体地且逐一地列出了这些相互组合而得到的方案一样，除非上下文清楚地显示并非如此。
[0961]
在本说明书中，引用了若干在先出版物。这些出版物，不被认为与本发明的可专利性相关，但以引用方式将其全部内容结合于本文。本说明书中对任何在先出版物(或从其衍生出的信息)的引用不是、也不应当被视为确认或承认或任何形式的启示，即相应的先前出版物(或从其衍生出的信息)构成本说明书涉及的技术领域中的公知常识。