一种用于检测固执腐霉的LAMP引物组合物及其检测方法

一种用于检测固执腐霉的lamp引物组合物及其检测方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种快速检测固执腐霉的lamp引物组合物及其肉眼可观察检测方法。


背景技术：

2.固执腐霉(pythium recalcitrans)属于茸鞭生物界(straminipila)，卵菌门(oomycota)，卵菌纲(oomycetes)，霜霉目(peronosporales)，腐霉科(pythiaceae)，腐霉属(pythium)，能侵染烟草、大豆和胡萝卜，引起根腐，苗期腐烂等症状，在烟草、大豆和胡萝卜生产中造成较重的经济损失。目前对该病害还没有有效的防治措施，加强检疫、防止病原菌的传播扩散是控制该病的最有效措施。为此应加强疫情监测，建立快速检测方法，为病害的风险及研究决策提供依据，从而有利于降低固执腐霉引起的损失。
3.目前，针对固执腐霉的检测技术较少。传统的检测方法主要是应用平板分离法和诱饵法，依据固执腐霉的形态学进行鉴定。该方法耗时耗力，需要丰富和专业的病原菌鉴定经验，而且很难依据形态学特征将固执腐霉与相近种区分开，无法满足田间生产上的需求。随着分子生物学的发展，特别pcr技术的普及，越来越多的分子生物学技术被应用到固执腐霉的检测中。但是这些检测技术往往需要在具有专业仪器、试剂和严格环境条件的实验室中进行，仪器和试剂的价格昂贵且操作要求较高，过程复杂，检测时间仍然较长，不能满足快速检测的需求，不适宜在基层环境中使用推广。
4.环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，lamp)是近些年开发的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代普通 pcr的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，大量合成目标dna的同时伴随有副产物—白色的焦磷酸镁沉淀产生。在反应体系中加入sybr green、羟基萘酚蓝(hnb) 等显色染料，可通过肉眼观察颜色变化来判定。由于lamp扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。目前此技术已广泛应用于真菌、细菌、病毒和卵菌的快速检测，但在固执腐霉的检测国内外均未见报道。
5.本发明以its基因为检测的靶标序列，设计了固执腐霉的特异性的lamp引物组合物，在此基础上建立了固执腐霉的lamp快速检测方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有技术中固执腐霉的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及pcr检测技术需要热循环仪器，无法快速检测固执腐霉的问题，而提供了一种快速检测固执腐霉的lamp检测引物组合物及其分子检测方法，此方法检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。
7.本发明的目的可通过如下技术方案实现：
8.用于检测固执腐霉的lamp引物组合物，由如seq id n0.1所示的正向内引物fip，如seqid n0.2所示的反向内引物bip，如seq id no.3所示的正向外引物f3，如seq id n0.4所示的反向外引物b3，如seq id n0.5所示的正向环引物lf，如seq id n0.6所示的反向环引物lb。
9.本发明所述的引物组合物在检测固执腐霉中的应用，所述的检测为非疾病诊断为目的的检测。
10.本发明所述的引物组合物在制备固执腐霉的lamp检测试剂盒中的应用。
11.一种检测固执腐霉的lamp试剂盒，含有本发明所述的引物组合物。
12.作为本发明的一种优选，所述的检测固执腐霉的lamp试剂盒还包含10
×
thermopolbuffer，mgs04，dntps，甜菜碱，bst dna polymerase，羟基萘酚蓝。
13.本发明所述试剂盒在检测固执腐霉种的应用，所述的检测为非疾病诊断为目的的检测。
14.一种固执腐霉的lamp检测方法，其特征在于提取待检微生物dna，取dna溶液作为反应模板，以所述的引物组合物进行lamp反应，然后观察扩增产物的颜色变化，若呈天蓝色表示检测结果为阳性，存在固执腐霉，若呈紫色表示检测结果为阴性，不存在固执腐霉。
15.作为本发明的一种优选，所述的lamp反应体系：2.5μl 10
×
thermopol buffer， 8mmol
·
l-1
mgs04，1.2mmol
·
l-1
dntps，内引物fip和bip各1.6μmol
·
l-1
，外引物f3和b3各 0.4μmol
·
l-1
，环引物lf和lb各0.8μmol
·
l-1
，0.8μmol
·
l-1
甜菜碱，8u
·
μl-1
bst dna polymerase， 180mmol
·
l-1
羟基萘酚蓝，2μl模板dna，体系共计26μl。
16.作为本发明的一种优选，所述lamp反应的程序为：63℃反应扩增60min。
17.本发明的检测固执腐霉的方法，以提取的dna为模板，利用所述的lamp引物组合物进行lamp反应；hydroxylnaphthol blue(hnb)属于金属离子指示剂的一种。hnb是mg
2+
的滴定剂，其颜色随溶液ph变化而改变，因此可以通过监测lamp反应体系中mg
2+
浓度的变化及溶液ph而起到颜色指示剂的作用。反应前将hnb加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中mg
2+
与lamp反应的副产物结合产生大量沉淀，溶液中mg
2+
浓度降低，ph发生变化，从而使hnb的颜色由紫色变为天蓝色。因此，反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断固执腐霉的有无：天蓝色表示检测为阳性，存在固执腐霉；紫色表示检测结果为阴性，不存在固执腐霉。
18.本发明与现有技术相比,其优点和积极效果表现在:
19.(1)实用性好。普通pcr反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散,这是实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭(eb)有巨毒，可累积致癌；长期观察紫外灯也会对实验人员造成一定程度的伤害。而lamp反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过观察溶液颜色的变化，判断是否有目标菌株的存在，提高其在田间的应用价值。
20.(2)恒温扩增。不像pcr法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源lamp反应就可以发生，极大的扩展了lamp使用的范围，lamp之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在lamp反应液中添加了甜菜碱，使双链dna处于解链的动态平衡中，在 bst dna聚合酶的作用下实现扩增。
21.(3)准确性高：由于传统固执腐霉检测方法只是依据形态特征来进行鉴定，而固执腐霉的生长受温度影响形态不稳定，同时受到相近种的影响，很难准确鉴定出来。而本发明
根据固执腐霉的基因组序列，利用blast软件将固执腐霉的基因组序列与其它腐霉的基因组序列进行比较，选取了固执腐霉特有的一段序列并设计特异性的lamp引物。lamp反应通过4条引物(fip、bip、 f3、b3)特异性识别靶序列上的6个独立区域，其特异性比较高(表1)。此外，正向环引物lf 和反向环引物lb能够提高反应速率，和其它四条引物一起，在确保反应准确性的情况下，使本发明能快速的进行固执腐霉检测。lamp反应通过4条引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于pcr引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性和灵敏度都比较高。
22.(4)灵敏度高：本发明建立的固执腐霉的lamp检测方法，灵敏度非常高，可以达到 100fgdna，表明该检测方法足以在dna浓度较低情况下准确快速地检测出固执腐霉。
23.为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
24.图1为固执腐霉its基因核酸序列及引物位置。
25.图2使用本发明设计的引物对不同固执腐霉菌株及其他菌物菌株的dna样本进行lamp 扩增检测，结果显示：不同固执腐霉菌株均呈天蓝色阳性反应
26.图3使用本发明设计的引物对其他菌物菌株的dna样本进行lamp扩增检测
27.结果显示：其他参试菌物菌株的反应管中溶液均成紫色阴性反应(图3)。
28.图4lamp检测固执腐霉的灵敏度：
29.lamp扩增不同浓度基因组dna；26μl的反应体系中分别含有10ng、1ng、100pg、10pg、 lpg、100fg、l0fgdna的扩增结果(图4)。
具体实施方式
30.为了使本发明的目的、技术方案更清楚明白，本发明用具体实例做进一步的说明，并非只有这些实例。
31.实施例1：利用lamp检测固执腐霉
32.1、用于检测固执腐霉的lamp引物组合物：如seq id n0.1所示的正向内引物fip，如 seq id n0.2所示的反向内引物bip，如seq id no.3所示的正向外引物f3，如seq id n0.4 所示的反向外引物b3，如seq id n0.5所示的正向环引物lf，如seq id n0.6所示的反向环引物lb。
33.2、检测方法：提取待检微生物dna，取dna溶液作为反应模板，加入检测溶液进行lamp 反应，检测固执腐霉的lamp反应体系为：2.5μl 10
×
thermopol buffer，8mmol
·
l-1
mgs04，1.2 mmol
·
l-1
dntps，内引物fip和bip各1.6μmol
·
l-1
，外引物f3和b3各0.4μmol
·
l-1
，环引物 lf和lb各0.8μmol
·
l-1
，0.8μmol
·
l-1
甜菜碱，8u
·
μl-1
bst dna polymerase，180mmol
·
l-1
羟基萘酚蓝，2μl模板dna，体系共计26μl；所述lamp反应的程序为：63℃反应扩增60min，然后观察扩增产物的颜色变化，若呈天蓝色表示检测结果为阳性，存在固执腐霉，若呈紫色表示检测结果为阴性，不存在固执腐霉。
34.3、为了验证lamp方法的特异性，以7株不同固执腐霉菌株和其他22种真菌和卵菌菌株作为供试材料(表2)，lamp检测结果显示：只有以固执腐霉为模板的反应管溶液呈现天蓝色阳性反应(图2)，其他参试卵菌、真菌菌株和阴性对照均成紫色阴性反应(图3)。
35.表1
[0036][0037]
表2
[0038][0039]
实施例2：固执腐霉lamp检测的灵敏度
[0040]
为了确定lamp检测方法的灵敏度，将提取的固执腐霉的dna用分光光度计测定浓度，按照10倍梯度进行稀释，使其质量浓度依次为10ng
·
μl-1
、1ng
·
μl-1
、100pg
·
μl-1
、10pg
·
μl-1
、 1pg
·
μl-1
、100fg
·
μl-1
和10fg
·
μl-1
，分别取2μl作为模板进行lamp反应。反应程序为63℃， 60min。hnb显色结果表示：当固执腐霉的dna浓度达到100fg
·
μl-1
时反应管中的溶液就能变成天蓝色(图4)。
[0041]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护
范围。