基于定量PCR技术评价细菌接合转移效率的方法与流程

基于定量pcr技术评价细菌接合转移效率的方法
技术领域
1.本发明涉及细菌分子生物技术领域，具体涉及基于定量pcr技术评价细菌接合转移效率的方法。


背景技术：

2.水平基因转移(horizontal gene transfer，hgt)是区别于垂直基因转移的，种内或种间不同个体之间遗传物质的交流方式。原核生物中水平基因转移主要有转化、转导和接合转移3种形式。其中，细菌接合转移是水平基因转移最普遍的方式，其通过在供体细胞和受体细胞之间搭建接合桥，形成物理接触，从而使dna从供体转移到受体。
3.外源dna通过水平基因转移(horizontal gene transfer，hgt)进入受体细菌，这个过程使得遗传物质在不同物种个体之间迅速扩散，从而快速适应多变的生态环境。随着高通量测序技术的发展，研究者逐渐认识到水平基因转移是原核生物进化的最重要动力，并影响到原核生物的致病性、耐药性和代谢等方面的功能。如耐药基因可以通过质粒在菌株间、菌种间传递。另外，水体或动物中的耐药基因同样可水平传递到人体内和其他动物体内，而对人体和动物健康造成潜在的危害。通过水平基因转移，大量的毒力基因也可实现细胞之间的传播，并且这种传播甚至可以跨越种族、纲目界，从而扩大病原菌的宿主范围。研究发现，粘附素、毒素、侵染素、蛋白质分泌系统、铁吸收系统等致病因子均可由“毒力岛”(pathogenicity islands，pai)编码，并被水平传播到其他菌种、菌株。因此，研究细菌水平基因转移的调控机制，对于细菌致病性、耐药性的控制，病害的防控具有重要意义。
4.挖掘细菌水平基因转移的关键调控基因和影响因素是研究细菌水平基因转移调控机制的重要部分。外来遗传物质虽可水平传播，但是需要经过细胞壁、细胞膜，进而才能进入质核，这个过程将遇到多重屏障。细菌复杂的细胞壁结构通常是外来dna进入宿主的第一道屏障。作为第二道屏障，细菌细胞膜通常会对外来dna产生表面排斥作用(surface exclusion)。如受体细胞表面排斥蛋白trat和tras、保外蛋白ompa、脂多糖lps等均被证实影响基因的水平传播。若外源dna越过细胞壁，克服细胞膜的表面排斥作用，进入到受体细胞质核，会受到细菌自身的“免疫系统”抵御，如细菌的限制修饰(r-m)系统和crispr簇。
5.分析细菌水平基因转移效率是鉴定细菌水平基因转移的调控基因和影响因素的关键环节。以最普遍的水平基因转移方式——接合转移为例，传统的操作方法多使用escherichia coli宿主细菌携带可接合转移和自主复制的质粒，通过其与受体菌细胞的接合转移从而实现外源载体进入细胞内，并通过含有特定抗生素的筛选平板，分析接合子数量和评价接合效率。但是这种方法往往受到涂板不均匀、接合菌稀释倍数不合适等的影响，导致评价效果灵敏度弱、准确性低、重复性差。


技术实现要素：

6.本发明针对细菌传统平板筛选评价接合转移效率方法的灵敏度弱、准确性低、重复性差的难题，提出一种基于定量pcr技术评价细菌接合转移效率的方法，通过pcr扩增和
无缝克隆构建含有受体菌同源序列的自杀质粒；并通过转化方式将其导入供体菌大肠杆菌；接着通过供体菌与受体菌的接合作用，将自杀质粒送入受体菌内，并与受体菌染色体上的同源序列发生同源重组，自杀质粒整合进入受体细胞；根据同源重组后的染色体序列，设计上游引物序列在受体菌染色体上、下游引物序列在质粒上的特异性检测引物，定量pcr的方式定量接合子数量，同时设计相对于供体菌的受体菌(包括接合子和未接合的受体菌)的特异性引物，定量受体菌总数量；最后，通过公式：接合效率＝接合子数量
÷
受体菌总量，得到接合效率，其中受体菌总量＝接合子数量+未接合的受体菌数量。
7.具体地，包括以下步骤：
8.(1)确定受体菌同源序列以及自杀质粒插入位点，设计无缝克隆法重组子载体构建引物，得到受体菌同源序列扩增引物对hs-f/r，自杀质粒线性化引物对p-f/r，重组质粒检测引物对p-check-f/r；提取受体菌基因组为模板，基于引物对hs-f/r，利用pcr技术获取受体菌同源序列，琼脂糖电泳检测后切胶回收；提取自杀质粒为模板，基于引物对p-f/r，利用pcr技术获取线性化质粒片段p，琼脂糖电泳检测后切胶回收；利用商品化多片段无缝克隆试剂盒将同源序列与线性化质粒进行等温组装；
9.(2)将等温组装液转化入供体菌大肠杆菌e.coli感受态细胞，pcr检测后获得到携带重组子p-hs的大肠杆菌供体菌p-hs-e.coli，并以其作为接合供体菌；将供体菌划线于添加有抗生素以及营养物质的lb固体平板上，过夜培养活化；挑取单克隆菌落，接种于添加有抗生素以及营养物质的lb液体培养基中，培养至对数早期od600nm＝0.3～0.7，所述的抗生素以及营养物质是根据自杀质粒p的抗性和营养缺陷情况确定；
10.(3)受体菌划线于固体平板中，过夜培养活化；挑取单克隆菌落，接种于液体培养基中，培养至对数早期od600nm＝0.3～0.7；移液器移取培养好的受体菌至无菌离心管中，根据需要进行一定的应激处理，并与步骤(2)培养好的供体菌混匀、离心；去上清后，菌沉淀用液体培养基重悬，点种到含有供体菌营养缺陷成分的固体平板，培养过夜；
11.(4)用接菌环刮取过夜接合菌斑，重悬于液体培养基中，并用液体培养基洗涤，并涂布于添加有抗生素的固体平板中；纯化获得潜在的重组子p-hs与受体菌成功同源重组后的接合子，将接合子于添加抗生素的液体培养基中培养过夜，用细菌基因组提取试剂盒提取接合子基因组；
12.(5)根据同源重组后的染色体序列，设计上游引物序列在受体菌染色体上，而下游引物序列在质粒上的接合子检测引物对hs-check-f/r，并结合普通pcr和测序法鉴定接合子；普通pcr法鉴定检测引物的特异性，分别以检测成功的接合子基因组、供体菌基因组、受体菌基因组为模板扩增，琼脂糖凝胶电泳显示检测成功的接合子有特异性条带，而供体菌以及未接合的受体菌无特异性条带，则检测引物具有特异性，可用于定量pcr法定量接合子数量；
13.(6)设计相对于供体菌的受体菌的特异性引物对con-f/r，分别以检测成功的接合子基因组、供体菌基因组、未接合的受体菌基因组为模板扩增，琼脂糖凝胶电泳显示检测成功的接合子和未接合的受体菌有特异性条带，而供体菌无特异性条带，则引物具有特异性，可用于定量pcr法定量受体菌总数量；
14.(7)通过公式：接合效率＝接合子数量
÷
受体菌总量，得到接合效率，其中受体菌总量＝接合子数量+未接合的受体菌数量。
15.优选地，所述的受体菌同源序列，其长度为200～1000bp，且为基因间区，同源重组后不影响受体菌生长性能的任何染色体序列。
16.优选地，所述的自杀质粒为psw7848，为低拷贝质粒，携带氯霉素抗性，具有需要pir蛋白的r6k复制起始点，转移起始点orit，以及受阿拉伯糖诱导的毒性基因ccdb。
17.优选地，所述的受体菌同源序列扩增引物对hs-f/r、自杀质粒线性化引物对p-f/r、重组质粒检测引物对p-check-f/r序列如下：
18.p-f：gtctgattcgttaccaattatgacaac，
19.p-r：gaattcgatatcaagcttatcgatac，
20.p-check-f：tcactgtcccttattcgcacc，
21.p-check-r：ctgcttttgagcactacccg。
22.优选地，所述的供体菌大肠杆菌为escherichia coli geb883，该菌可编码pir蛋白，且为2,6-diaminopimelic acid(dap)营养缺陷型，并且可编码rp4，用于接合转移。
23.优选地，所述的添加有抗生素以及营养物质的lb固体平板上为添加有20μg/ml氯霉素和0.3mm dap(2,6-diaminopimelic acid)的lb固体平板，且lb固体平板含有酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl 10g/l、技术琼脂粉15g/l；
24.所述的添加有抗生素以及营养物质的lb液体培养基中含有酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl 10g/l、20μg/ml氯霉素以及0.3mm dap，其余为水；
25.所述的含有供体菌营养缺陷成分的固体平板中含有酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl30g/l、技术琼脂粉15g/l以及0.3mm dap。
26.优选地，步骤(2)中所述的过夜培养活化的条件是37℃，所述的培养至对数早期od600nm＝0.3～0.7的条件是37℃、200rpm。
27.优选地，步骤(3)中所述的过夜培养活化的条件是28℃，所述的培养至对数早期od600nm＝0.3～0.7的条件是28℃、200rpm。
28.优选地，步骤(3)中所述的进行应激处理是移取培养好的受体菌至无菌离心管中，于40℃热击15min；所述的混匀、离心是于6000rpm、室温离心3min。
29.优选地，所述的受体菌为哈维弧菌(vibrio harveyi)。
30.优选地，所述的受体菌同源序列扩增引物对hs-f/r的序列为：
31.hs-f：ataagcttgatatcgaattcactatttttcctttgctggatatgct，
32.hs-r：taattggtaacgaatcagacaatctatcctcttttaagcaatagtcttagc；或
33.hs-f：ataagcttgatatcgaattcctgaagatatcgcattaactatccatg
34.hs-r：taattggtaacgaatcagacccaacatgaaccggaacact；
35.所述的接合子检测引物的序列为：
36.hs-check-f：accacaatggacccagagacac或atcgcatctgactgtgcagac，hs-check-r：cgagtttcgtgccggttgt；
37.所述的相对于供体菌的受体菌的特异性引物序列为：
38.con-f：actgagcagaaacaggcagatacc，
39.con-r：ctgtacctgttgtcgttgttggt。
40.进一步地，所述的公式为：接合效率＝2-ct(接合子特异性检测引物)
÷
2-ct(受体菌特异性检测引物)
。
41.本发明的第二目的是提供一种哈维弧菌345基因敲除株345δcu052_28220，所述
基因的genbank号为awb03109.1。
42.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
43.(1)本发明基于定量pcr技术评价细菌接合转移效率的方法能够定量分析细菌接合效率，灵敏度强、准确性高、重复性好，对细菌水平基因转移调控机制的研究具有十分重要的意义；
44.(2)本发明提供的基因敲除株345δcu052_28220的接合转移效率约是哈维弧菌345野生株的7.30倍，表明cu052_28220可能参与负调控哈维弧菌345接合转移过程。
45.本发明的哈维弧菌(vibrio harveyi)345公开于张亚秋,邓益琴,冯娟,等.哈维弧菌vhh基因缺失株的构建及其相关生物学特性研究[j].南方水产科学,2020,16(2):11.，该菌株本技术人也持有，保证自申请日起20年内向公众发放。
附图说明
[0046]
图1为基于定量pcr法的细菌接合转移效率评价系统的构建流程；
[0047]
图2是基于哈维弧菌345中染色体1上1161031-1161687和1827872-1828471同源序列的定量pcr法的细菌接合转移效率评价系统的构建；其中：pcr扩增获得哈维弧菌345染色体1上1161031-1161687(hs1)和1827872-1828471(hs2)的同源序列(a)，psw7848线性化片段(b)，阳性重组子psw7848-hs1的pcr检测结果(c)，阳性重组子psw7848-hs2的pcr检测结果(d)，hs1的同源序列接合子检测引物特异性分析(e)，hs2的同源序列接合子检测引物特异性分析(f)，hs1的同源序列内参引物特异性分析(g)，hs2的同源序列内参引物特异性分析(h)，其中泳道m1为dnamarker dl2000，从上到下条带大小依次为2000、1000、750、500、250、100bp；m2为dnamarker dl5000，从上到下条带大小依次为5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp。
具体实施方式
[0048]
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
[0049]
生物材料来源：
[0050]
本发明所述自杀质粒psw7848来自法国国家科学研究院巴斯德研究所didier mazel教授馈赠，供体菌e.coli geb883来自巴黎十一大学annick jacq教授馈赠；同源序列及质粒线性化扩增所用dna聚合酶为takara公司的高保真酶max dnapolymerase，重组子检测、同源重组特异性检测和引物特异性分析用2
×
accurate taq master mix(dye plus)以及定量pcr用green premix pro taq hs qpcr购自艾科瑞生物科技有限公司；细菌基因组提取、质粒提取和胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；无缝克隆试剂盒clonexpress multis one step cloning kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
[0051]
(1)自杀质粒psw7848的来源参见文献:val,m-e.,skovgaard,o.,ducos-galand,m.,bland,m.j.,mazel,d.,2012.genome engineering in vibrio cholerae:a feasible approach to address biological issues.plos genet.8,e1002472.
[0052]
(2)e.coli geb883的来源参见文献:nguyen,a.n.,disconzi,e.,charri
è
re,
g.m.,destoumieux-garz
ó
n,d.,bouloc,p.,le roux,f.,jacq,a.,2018.csrb gene duplication drives the evolution of redundant regulatory pathways controlling expression of the major toxic secreted metalloproteases in vibrio tasmaniensis lgp32.msphere.3,e00582-00518.
[0053]
一般性说明：
[0054]
一、大肠杆菌e.coli geb883感受态细胞的制备
[0055]
(1)e.coli geb883划线至添加0.3mm dap的lb固体平板上，于37℃培养过夜；
[0056]
(2)挑取e.coli geb883单克隆至添加0.3mm dap的lb液体培养基中，于37℃、200rpm培养过夜；
[0057]
(3)1ml过夜菌液稀释至100ml添加0.3mm dap的lb液体培养基，于37℃、200rpm培养至od600nm＝0.6～0.8；
[0058]
(4)菌液置于冰上冷却10min，于4℃，4000rpm离心15min；
[0059]
(5)去上清，菌沉淀用50ml灭菌冷却的50mm的cacl2重悬，置于冰上20min；
[0060]
(6)菌液于4℃，4000rpm离心15min；
[0061]
(7)去上清，菌沉淀用2.5ml灭菌冷却的含有25％甘油的50mm的cacl2重悬；
[0062]
(8)重悬的细胞用灭菌的1.5ml离心管分装100μl/管，置于-80℃，待用。
[0063]
二、等温组装液转化入大肠杆菌e.coli geb883感受态细胞
[0064]
(1)取100μle.coli geb883感受态细胞于冰上融化；
[0065]
(2)5.0μl等温组装液加入到100μl感受态细胞中，轻柔混匀，冰上孵育20min；
[0066]
(3)42℃热击2min，立即置于冰上孵育2min；
[0067]
(4)加入1ml添加0.3mm dap的lb液体培养基，于37℃、150rpm振摇培养1h；
[0068]
(5)取100μl菌液涂布在添加有20μg/ml氯霉素和0.3mm dap的lb固体平板上，37℃倒置培养过夜，直至克隆长出；
[0069]
(6)用牙签挑取单克隆培养至添加有20μg/ml氯霉素和0.3mm dap的lb液体培养基中，待菌体长出后，pcr检测，并用灭菌的15％的甘油冻存阳性克隆在灭菌冻存管中，-80℃保存待用。
[0070]
实施例1
[0071]
分别以哈维弧菌345中染色体1上1161031-1161687和1827872-1828471同源序列为例说明定量pcr法的细菌接合转移效率评价系统的构建(图1)。
[0072]
哈维弧菌345中染色体1上1161031-1161687序列，长度657bp，位于cu052_05900基因和cu052_05905基因之间，属于基因间区；染色体1上1827872-1828471序列，长度600bp，包含cu052_092703’端128bp、cu052_09270基因和cu052_09275基因的基因间区以及cu052_092753’端151bp。
[0073]
本研究中基于哈维弧菌345中染色体1上1161031-1161687和1827872-1828471的同源序列的定量pcr法的细菌接合转移效率评价系统将为哈维弧菌水平基因转移关键调控基因和影响因素的鉴定提供技术支撑，有助于哈维弧菌的水平基因转移调控机制的研究，本实验步骤如下：
[0074]
(1)确定受体菌同源序列以及自杀质粒插入位点，受体菌同源序列为哈维弧菌345中染色体1上1161031-1161687(hs1)序列和1827872-1828471序列(hs2)；
[0075]
(2)设计无缝克隆法重组子载体构建引物，得到同源序列引物对hs1-f/r和hs2-f/r，自杀质粒线性化引物对psw7848-f/r，重组子质粒检测引物对psw7848-check-f/r；
[0076]
所述的pcr引物序列如下：
[0077]
hs1-f：ataagcttgatatcgaattcactatttttcctttgctggatatgct，
[0078]
hs1-r：taattggtaacgaatcagacaatctatcctcttttaagcaatagtcttagc，
[0079]
hs2-f：ataagcttgatatcgaattcctgaagatatcgcattaactatccatg，
[0080]
hs2-r：taattggtaacgaatcagacccaacatgaaccggaacact，
[0081]
psw7848-f：gtctgattcgttaccaattatgacaac，
[0082]
psw7848-r：gaattcgatatcaagcttatcgatac，
[0083]
psw7848-check-f：tcactgtcccttattcgcacc，
[0084]
psw7848-check-r：ctgcttttgagcactacccg；
[0085]
(3)提取受体菌哈维弧菌345基因组为模板，基于引物对hs1-f/r和hs2-f/r，利用pcr技术获取长度分别为657bp(seq id no.1)和600bp(seq id no.2)的同源序列，如图2a所示，泳道a-1为1161031-1161687同源序列，泳道a-2为1827872-1828471同源序列，琼脂糖电泳检测后切胶回收，回收产物-20℃保存，备用；
[0086]
所述的pcr扩增体系如下：
[0087]2×
primestar max premix 25.0μl，上游引物f(10μm)2.0μl，下游引物r(10μm)2.0μl，基因组模板(20ng/μl)2.0μl，用ddh2o补足50μl；
[0088]
所述的pcr扩增程序如下：
[0089]
98℃预变性30sec；98℃变性10sec，55℃5sec，72℃5sec，35个循环；72℃延伸7min；
[0090]
(4)提取自杀质粒psw7848为模板，基于引物对psw7848-f/r，利用pcr技术获取长度为3309bp的质粒线性化片段(如图2-b所示)，琼脂糖电泳检测后切胶回收，回收产物-20℃保存，备用；
[0091]
pcr扩增体系如下：
[0092]2×
primestar max premix 25.0μl，上游引物f(10μm)2.0μl，下游引物r(10μm)2.0μl，质粒模板(1ng/μl)2.0μl，用ddh2o补足50μl；
[0093]
pcr扩增程序如下：
[0094]
98℃预变性30sec；98℃变性10sec，53℃15sec，72℃17sec，35个循环；72℃延伸7min；
[0095]
(5)利用商品化多片段无缝克隆试剂盒将步骤(3)获得的同源序列与步骤(4)获得的线性化质粒进行等温组装；
[0096]
(6)将等温组装液转化入供体菌大肠杆菌e.coligeb883感受态细胞，基于引物对psw7848-check-f/r，利用pcr检测后获得阳性重组子psw7848-hs1(seq id no.3)和psw7848-hs2(seq id no.4)，琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，长度分别为942bp和885bp(图2-c，图2-d),pcr检测后得到携带重组子psw7848-hs1和psw7848-hs2的大肠杆菌供体菌psw7848-hs1-e.coligeb883和psw7848-hs2-e.coligeb883，并以其作为接合供体菌；
[0097]
pcr扩增体系如下：
[0098]2×
accurate taq master mix(dnapolymerase、buffer、dntp mixture)25.0μl，
上游引物f(10μm)1.0μl，下游引物r(10μm)1.0μl，菌液模板2.0μl，用ddh2o补足50μl；
[0099]
pcr扩增程序如下：
[0100]
94℃预变性30sec；98℃变性10sec，57℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min；
[0101]
(7)将供体菌psw7848-hs1-e.coligeb883和psw7848-hs2-e.coligeb883划线于添加有20μg/ml氯霉素和0.3mm dap(2,6-diaminopimelic acid)的lb固体平板上，于37℃过夜培养活化；
[0102]
(8)挑取(7)中活化菌体所形成的单克隆菌落，接种于添加有20μg/ml氯霉素和0.3mm dap的lb液体培养基中，37℃、200rpm培养至对数早期od600nm＝0.3～0.7；
[0103]
(9)配置lbs固体平板，对受体菌哈维弧菌345进行28℃下过夜培养活化；
[0104]
(10)挑取(9)中活化菌体所形成的单克隆菌落，接种于添加lbs液体培养基中，28℃、200rpm培养至对数早期od600nm＝0.3～0.7；
[0105]
(11)移液器移取0.5ml(10)中准备好的受体菌至1.5ml无菌离心管中，于40℃热击15min，并与(8)中准备好的0.5ml供体菌混匀，于6000rpm、室温离心3min；
[0106]
(12)去上清后，菌沉淀用50μl lbs液体培养基重悬，点种到lbs+0.3mm dap+0.2％d-glucose固体平板，于28℃培养过夜；
[0107]
(13)用接菌环刮取过夜接合菌斑，重悬于1ml lbs液体培养基中，并用新鲜的lbs液体培养基洗涤1次，将菌体用100μl lbs液体培养基重悬后涂布于lbs+34μg/ml氯霉素的lbs固体平板上；
[0108]
(14)纯化2次获得潜在重组子与受体菌成功同源重组后的接合子，将接合子于lbs+34μg/ml液体培养基中培养过夜，用细菌基因组提取试剂盒提取接合子基因组；
[0109]
(15)根据同源重组后的染色体序列，设计上游引物序列hs1-check-f和hs2-check-f在受体菌染色体上(同源序列的上游)，而下游引物序列在质粒上hs-check-r的特异性检测引物，并结合普通pcr和测序法鉴定接合子；
[0110]
引物如下：
[0111]
hs1-check-f：accacaatggacccagagacac，
[0112]
hs2-check-f：atcgcatctgactgtgcagac，
[0113]
hs-check-r：cgagtttcgtgccggttgt；
[0114]
pcr扩增体系如下：
[0115]2×
accurate taq master mix(dnapolymerase、buffer、dntp mixture)25.0μl，上游引物f(10μm)1.0μl，下游引物r(10μm)1.0μl，基因组模板2.0μl，用ddh2o补足50μl；
[0116]
pcr扩增程序如下：
[0117]
94℃预变性30sec；98℃变性10sec，60℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min；
[0118]
(16)普通pcr法鉴定检测步骤(15)中的引物hs1-check-f、hs2-check-f、hs-check-r的特异性，分别以检测成功的接合子基因组、供体菌大肠杆菌psw7848-hs1-e.coligeb883和psw7848-hs2-e.coligeb883、受体菌哈维弧菌345基因组为模板扩增，琼脂糖凝胶电泳显示检测成功的接合子有特异性条带，长度分别为891bp(seq id no.5)和817bp(seq id no.6)，分别如图2-e和图2-f所示，其中泳道e-1为受体菌哈维弧菌345检测
引物pcr扩增结果，泳道e-2为供体菌psw7848-hs1-e.coligeb883检测引物pcr扩增结果，泳道e-3为hs1同源序列的接合子检测引物pcr扩增结果；泳道f-1为受体菌哈维弧菌345检测引物pcr扩增结果，泳道f-2为供体菌psw7848-hs2-e.coligeb883检测引物pcr扩增结果，泳道f-3为hs2同源序列的接合子检测引物pcr扩增结果，而接合供体菌以及未接合的受体菌无特异性条带，则检测引物具有特异性，可用于定量pcr法定量接合子数量；
[0119]
(17)设计相对于供体菌psw7848-hs1-e.coligeb883和psw7848-hs2-e.coligeb883的受体菌哈维弧菌345和接合子的特异性检测引物con-f/r，分别以检测成功的接合子基因组、供体菌psw7848-hs1-e.coligeb883和psw7848-hs2-e.coligeb883、受体菌哈维弧菌345基因组为模板扩增，琼脂糖凝胶电泳显示检测成功的接合子和未接合的受体菌有特异性条带，长度为786bp(seq id no.7)，而供体菌无特异性条带，则检测引物具有特异性(图2-g，图2-h)，其中泳道g-1为受体菌哈维弧菌345内参引物pcr扩增结果，泳道g-2为供体菌psw7848-hs1-e.coligeb883内参引物pcr扩增结果，泳道g-3为hs1同源序列的内参引物pcr扩增结果；泳道h-1为受体菌哈维弧菌345内参引物pcr扩增结果，泳道h-2为供体菌psw7848-hs2-e.coligeb883内参引物pcr扩增结果，泳道h-3为hs2同源序列的内参引物pcr扩增结果，可用于定量pcr法定量受体菌总数量；
[0120]
引物如下：
[0121]
con-f：actgagcagaaacaggcagatacc，
[0122]
con-r：ctgtacctgttgtcgttgttggt；
[0123]
pcr扩增体系如下：
[0124]2×
accurate taq master mix(dnapolymerase、buffer、dntp mixture)25.0μl，上游引物f(10μm)1.0μl，下游引物r(10μm)1.0μl，基因组模板2.0μl，用ddh2o补足50μl；
[0125]
pcr扩增程序如下：
[0126]
94℃预变性30sec；98℃变性10sec，60℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min；
[0127]
(18)通过公式：接合效率＝接合子数量
÷
受体菌总量，得到接合效率，其中受体菌数量＝接合子数量+未接合的受体菌数量。
[0128]
实施例2
[0129]
以基于哈维弧菌345中染色体1上1827872-1828471同源序列的定量pcr法的细菌接合转移效率评价系统分析对数期哈维弧菌345及其基因敲除株345δcu052_28220(genbank号为awb03109.1)的接合转移效率。具体步骤如下：
[0130]
(1)将供体菌psw7848-hs2-e.coligeb883划线于添加有20μg/ml氯霉素和0.3mm dap(2,6-diaminopimelic acid)的lb固体平板上，于37℃过夜培养活化；
[0131]
(2)挑取(1)中活化菌体所形成的单克隆菌落3个，接种于添加有20μg/ml氯霉素和0.3mm dap的lb液体培养基中，37℃、200rpm培养至对数早期od600nm＝0.3～0.7；
[0132]
(3)配置lbs固体平板，对受体菌哈维弧菌345和345δcu052_28220进行28℃下过夜培养活化；
[0133]
(4)挑取(3)中活化菌体所形成的单克隆菌落3个，接种于添加lbs液体培养基中，28℃、200rpm培养至对数早期od600nm＝0.3～0.7；
[0134]
(5)将(4)中准备好的受体菌0.5ml/管分装于1.5ml无菌离心管中，于40℃热击
15min，并分别与(2)中准备好的0.5ml供体菌混匀，于6000rpm、室温离心3min；
[0135]
(6)去上清后，菌沉淀用50μl lbs液体培养基重悬，点种到lbs+0.3mm dap+0.2％d-glucose固体平板，于28℃培养过夜；
[0136]
(7)用接菌环刮取过夜接合菌斑，重悬于1ml lbs液体培养基中，用细菌基因组提取试剂盒提取接合菌斑基因组；
[0137]
(8)以接合菌斑基因组为模板，利用同源重组特异性检测引物hs2-check-f/hs-check-r定量pcr的方式定量接合子数量，同时利用受体菌(包括接合子和未接合的受体菌)的特异性检测引物con-f/r，定量受体菌总数量，最后通过公式：接合效率＝接合子数量
÷
受体菌总量＝2-ct(接合子特异性检测引物)
÷
2-ct(受体菌特异性检测引物)
，得到接合效率(表1)，其中受体菌总量＝接合子数量+未接合的受体菌数量，发现基因敲除株345δcu052_28220的接合转移效率约是哈维弧菌345野生株7.30倍，表明cu052_28220可能参与负调控哈维弧菌345接合转移过程。
[0138]
定量pcr扩增体系如下：
[0139]
green premix 5.0μl，上游引物f(10μm)0.2μl，下游引物r(10μm)0.2μl，菌斑基因组模板0.5μl，用ddh2o补足10μl；
[0140]
定量pcr扩增程序如下：
[0141]
95℃预变性5min；95℃变性5sec，60℃30sec，72℃1.5min，35个循环。
[0142]
表1哈维弧菌345及其基因敲除株345δcu052_28220的接合转移效率
[0143][0144]
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制。如可对任何种属且在一定条件下可与特定供体菌进行接合转移的受体菌，利用携带自杀质粒(自杀质粒含有受体菌200～1000bp同源序列，且受体菌同源序列应为基因间区，同源重组后不影响受体菌生长性能的任何染色体序列)的e.coli供体菌，通过其与受体菌接合转移，将自杀质粒送入受体细胞内，并与受体菌同源重组，自杀质粒整合进入受体细胞，通过设计上游序列在受体菌染色体上，而下游序列在质粒上的特异性检测引物，定量pcr的方式定量接合子数量，同时设计相对于供体菌的受体菌(包括接合子和未接合的受体菌)的特异性引物，定量受体菌数量，通过公式：接合效率＝接合子数量
÷
受体菌总量，得到接合效率，其中受体菌总量＝接合子数
量+未接合的受体菌数量。因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。