技术特征：
1.一种基于定量pcr技术评价细菌接合转移效率的方法，其特征在于，将含有受体菌同源序列的自杀质粒导入供体菌中；接着通过供体菌与受体菌的接合作用，将自杀质粒送入受体菌内，并与受体菌染色体上的同源序列发生同源重组，自杀质粒整合进入受体菌；根据同源重组后的染色体序列，设计上游引物序列在受体菌染色体上、下游引物序列在自杀质粒上的特异性检测引物，定量pcr的方式定量接合子数量，同时设计相对于供体菌的受体菌的特异性引物，定量受体菌总数量；最后，通过公式：接合效率＝接合子数量
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受体菌总量，得到接合效率，其中受体菌总量＝接合子数量+未接合的受体菌数量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)确定受体菌同源序列以及自杀质粒插入位点，设计无缝克隆法重组子载体构建引物，得到受体菌同源序列扩增引物对hs-f/r，自杀质粒线性化引物对p-f/r，重组质粒检测引物对p-check-f/r；提取受体菌基因组为模板，基于引物对hs-f/r，利用pcr技术获取受体菌同源序列，琼脂糖电泳检测后切胶回收；提取自杀质粒为模板，基于引物对p-f/r，利用pcr技术获取线性化质粒片段p，琼脂糖电泳检测后切胶回收；利用商品化多片段无缝克隆试剂盒将同源序列与线性化质粒进行等温组装；(2)将等温组装液转化入供体菌大肠杆菌e.coli感受态细胞，pcr检测后获得到携带重组子p-hs的大肠杆菌供体菌p-hs-e.coli，并以其作为接合供体菌；将供体菌划线于添加有抗生素以及营养物质的lb固体平板上，过夜培养活化；挑取单克隆菌落，接种于添加有抗生素以及营养物质的lb液体培养基中，培养至对数早期od600nm＝0.3～0.7，所述的抗生素以及营养物质是根据自杀质粒p的抗性和营养缺陷情况确定；(3)受体菌划线于固体平板中，过夜培养活化；挑取单克隆菌落，接种于液体培养基中，培养至对数早期od600nm＝0.3～0.7；移液器移取培养好的受体菌至无菌离心管中，根据需要，进行一定的应激处理，并与步骤(2)培养好的供体菌混匀、离心；去上清后，菌沉淀用液体培养基重悬，点种到含有供体菌营养缺陷成分的固体平板，培养过夜；(4)用接菌环刮取过夜接合菌斑，重悬于液体培养基中，并用液体培养基洗涤，并涂布于添加有抗生素的固体平板中；纯化获得潜在的重组子p-hs与受体菌成功同源重组后的接合子，将接合子于添加抗生素的液体培养基中培养过夜，用细菌基因组提取试剂盒提取接合子基因组；(5)根据同源重组后的染色体序列，设计上游引物序列在受体菌染色体上，而下游引物序列在质粒上的接合子检测引物对hs-check-f/r，并结合普通pcr和测序法鉴定接合子；普通pcr法鉴定检测引物的特异性，分别以检测成功的接合子基因组、供体菌基因组、未接合的受体菌基因组为模板扩增，琼脂糖凝胶电泳显示检测成功的接合子有特异性条带，而供体菌以及未接合的受体菌无特异性条带，则检测引物具有特异性，可用于定量pcr法定量接合子数量；(6)设计相对于供体菌的受体菌的特异性引物对con-f/r，分别以检测成功的接合子基因组、供体菌基因组、未接合的受体菌基因组为模板扩增，琼脂糖凝胶电泳显示检测成功的接合子和未接合的受体菌有特异性条带，而供体菌无特异性条带，则引物具有特异性，可用于定量pcr法定量受体菌总数量；(7)通过公式：接合效率＝接合子数量
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受体菌总量，得到接合效率，其中受体菌总量＝接合子数量+未接合的受体菌数量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的受体菌同源序列，其长度为200～1000bp，且为基因间区，同源重组后不影响受体菌生长性能的任何染色体序列。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的自杀质粒为psw7848，为低拷贝质粒，携带氯霉素抗性，具有需要pir蛋白的r6k复制起始点，转移起始点orit，以及受阿拉伯糖诱导的毒性基因ccdb；所述的自杀质粒线性化引物对p-f/r、重组质粒检测引物对p-check-f/r序列如下：p-f：gtctgattcgttaccaattatgacaac，p-r：gaattcgatatcaagcttatcgatac，p-check-f：tcactgtcccttattcgcacc，p-check-r：ctgcttttgagcactacccg。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的供体菌大肠杆菌为escherichia coli geb883，该菌可编码pir蛋白，且为2,6-diaminopimelic acid(dap)营养缺陷型，并且可编码rp4，用于接合转移。6.根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于，所述的添加有抗生素以及营养物质的lb固体平板上为添加有20μg/ml氯霉素和0.3mm dap的lb固体平板，且lb固体平板含有酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl 10g/l、技术琼脂粉15g/l；所述的添加有抗生素以及营养物质的lb液体培养基中含有酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl 10g/l、20μg/ml氯霉素以及0.3mm dap，其余为水；所述的含有供体菌营养缺陷成分的固体平板中含有酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl30g/l、技术琼脂粉15g/l以及0.3mm dap。7.根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的过夜培养活化的条件是37℃，所述的培养至对数早期od600nm＝0.3～0.7的条件是37℃、200rpm。8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的受体菌为哈维弧菌(vibrio harveyi)。9.根据权利要求2或8所述的方法，其特征在于，所述的受体菌同源序列扩增引物对hs-f/r的序列为：hs-f：ataagcttgatatcgaattcactatttttcctttgctggatatgct，hs-r：taattggtaacgaatcagacaatctatcctcttttaagcaatagtcttagc；或hs-f：ataagcttgatatcgaattcctgaagatatcgcattaactatccatg，hs-r：taattggtaacgaatcagacccaacatgaaccggaacact；所述的接合子检测引物的序列为：hs-check-f：accacaatggacccagagacac或atcgcatctgactgtgcagac，hs-check-r：cgagtttcgtgccggttgt；所述的相对于供体菌的受体菌的特异性引物序列为：con-f：actgagcagaaacaggcagatacc，con-r：ctgtacctgttgtcgttgttggt。10.一种哈维弧菌(vibrio harveyi)345基因敲除株345δcu052_28220，其特征在于，所述基因的genbank号为awb03109.1。
技术总结
本发明公开了基于定量PCR技术评价细菌接合转移效率的方法，属于细菌分子生物技术领域。本发明通过PCR扩增和无缝克隆构建含有受体菌同源序列的自杀质粒；并通过转化方式将其导入供体菌大肠杆菌；接着通过供体菌与受体菌的接合作用，将自杀质粒送入受体菌内，并与受体菌染色体上的同源序列发生同源重组，自杀质粒整合进入受体细胞；根据同源重组后的染色体序列，设计上游引物序列在受体菌染色体上、下游引物序列在质粒上的特异性检测引物，定量PCR的方式定量接合子数量，同时设计相对于供体菌的受体菌的特异性引物，定量受体菌总数量；最后，通过公式：接合效率＝接合子数量
技术研发人员：邓益琴 司徒洁金 冯娟 陈皓祥
受保护的技术使用者：中国水产科学研究院南海水产研究所
技术研发日：2021.11.17
技术公布日：2022/3/21