表达非洲猪瘟病毒B602L-B646L蛋白的重组腺病毒及构建方法

表达非洲猪瘟病毒b602l-b646l蛋白的重组腺病毒及构建方法
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种表达非洲猪瘟病毒b602l-b646l蛋白的重组腺病毒及构建方法。


背景技术：

2.非洲猪瘟(african swine fever,asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，asfv)感染引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病。临床表现为发热、皮肤发绀、淋巴结、肾、胃肠黏膜明显出血等。
3.非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员，也是目前唯一的dna虫媒病毒，通常认为只有一个血清型，国际上根据asfv b646l基因末端一段478bp的核酸序列，将asfv分为24个基因型，我国多属于基因ⅱ型。非洲猪瘟病毒可通过家猪、野猪和软蜱进行传播，主要攻击猪单核、巨噬细胞。病毒粒子直径为175-215纳米，呈20面体对称，有囊膜，结构由内到外分别是类壳、核壳、内膜、衣壳和外囊膜。基因组为双股线状dna，大小170-193kb，有150-167个开放阅读框，编码50多种结构蛋白和100多种非结构蛋白。参与病毒粒子结构构成的物质主要包括结构蛋白、基因转录和rna修饰酶类。作为病毒粒子的主要成分，结构蛋白在asfv吸附、侵入和复制等感染过程中起着重要作用。编码的蛋白主要有p72、p49、p30、p54、b602l等。b602l作为分子伴侣参与p72核衣壳蛋白的折叠，位于病毒工厂之外，不是病毒颗粒的一部分，是一个晚期非结构蛋白，但是asfv的强免疫原性抗原。缺失b602l蛋白会产生异常的拉链状结构，无法形成二十面体病毒颗粒。p72是asfv主要的结构蛋白，由b646l基因编码，分子量约为73kda，在病毒感染晚期表达，是病毒二十面体衣壳的重要组成成分，存在于病毒衣壳的表面，具有良好的免疫原性和抗原性。p72参与病毒的吸附，针对p72的抗体可以阻断病毒与巨噬细胞的结合，但是在抗体介导的免疫保护中不起决定性作用。p72还参与了病毒装配过程中p220和p62的加工。p72编码基因的同源性较高，因此常用于asfv基因的分型，并作为靶蛋白用于asfv抗原的研究。目前还没有针对b602l-b646l的重组腺病毒以及制备该重组腺病毒的可行方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种表达非洲猪瘟病毒b602l-b646l蛋白的重组腺病毒及构建方法，以解决上述现有技术存在的问题，为研究非洲猪瘟候选疫苗奠定技术基础。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种表达非洲猪瘟病毒b602l-b646l蛋白的重组腺病毒载体，以pad-cmv-3
×
flag腺病毒载体为基础，引入b602l-b646l基因以构建重组腺病毒载体pad-cmv-egfp-b602l-b646l；所述b602l-b646l基因具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。
7.本发明还提供一种上述的表达非洲猪瘟病毒b602l-b646l蛋白的重组腺病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
8.(1)合成b602l-b646l基因，并在b602l-b646l基因的起始密码子前添加cacc四个碱基；
9.(2)将步骤(1)得到的b602l-b646l基因和pentre-egfp-topo载体进行topo克隆，得到pentr-egfp-asfv-b602l-b646l；
10.(3)将步骤(2)得到的pentr-egfp-asfv-b602l-b646l通过lr重组反应于腺病毒骨架载体pad-cmv-3
×
flag进行重组，得到重组腺病毒载体pad-cmv-egfp-b602l-b646l。
11.本发明还提供一种重组腺病毒包装方法，将上述的重组腺病毒载体pad-cmv-egfp-b602l-b646l用pacⅰ进行单酶切，线性化后的质粒用于转染；转染293t细胞，实现重组腺病毒包装。
12.进一步地，包括以下步骤：
13.(1)将重组腺病毒载体pad-cmv-egfp-b602l-b646l用限制性内切酶pacⅰ进行单酶切，线性化后的质粒用于转染ad293细胞；
14.(2)转染后至细胞脱落、变圆且间隙变大时，收集细胞及上清，即为p1代重组腺病毒；
15.(3)p1代重组腺病毒感染293t细胞，观察细胞状态。
16.进一步地，所述转染ad293细胞采用的转染试剂为ietprime kit转染试剂。
17.进一步地，在步骤(2)中，收集细胞及上清后，置于-80℃反复冻融3次，12000
×
g离心10min，收集上清。
18.本发明还提供上述的重组腺病毒包装方法制备得到的重组腺病毒，以及包含上述的重组腺病毒的疫苗。
19.本发明公开了以下技术效果：
20.本发明利用重组腺病毒穿梭载体pentre-egfp-topo，经过一系列中间过程，得到重组腺病毒载体pad-cmv-egfp-b602l-b646l；将其线性化后转染ad293细胞，根据腺病毒感染形成的细胞病变筛选重组病毒，实现腺病毒包装过程，获得表达非洲猪瘟病毒b602l-b646l蛋白的重组腺病毒，为构建表达非洲猪瘟病毒b602l-b646l蛋白的重组腺病毒疫苗奠定了基础。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为重组腺病毒载体pad-cmv-egfp-b602l-b646l包装图；
23.图2为过渡载体重组质粒pentr-egfp-asfv-b602l-b646l的质粒结构图；
24.图3为重组腺病毒载体pad-cmv-egfp-b602l-b646l的质粒结构图。
具体实施方式
25.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
26.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
27.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
28.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
29.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
30.下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(f.m.奥斯伯，r.e.金斯顿，j.g.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。
31.本发明提供了一种表达非洲猪瘟病毒b602l-b646l蛋白的重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：
32.(1)查询ncbi网站收录的b602l-b646l基因(geneid:59226936+59226937)，通过人工合成基因片段，并在起始密码子前添加cacc四个碱基，连接到过渡载体pentre-egfp-topo上，得到过渡载体重组质粒pentr-egfp-asfv-b602l-b646l，如图2所示。
33.(2)将步骤(1)得到的过渡载体重组质粒pentr-egfp-asfv-b602l-b646l利用lr重组反应与腺病毒骨架载体pad-cmv-3
×
flag进行重组，通过转化得到重组腺病毒载体pad-cmv-egfp-b602l-b646l，如图3所示。
34.(3)重组腺病毒载体pad-cmv-egfp-b602l-b646l经过pacⅰ酶切，线性化转染ad293细胞，获得重组腺病毒。
35.b602l-b646l基因的合成：
36.查询ncbi网站收录的b602l-b646l基因(geneid:59226936+59226937)，通过人工合成基因片段，并在起始密码子前添加cacc四个碱基，最终序列如seq id no.1所示。
37.seq id no.1：
38.atggcagaatttaatattgatgagcttctcaaaaacgtattggaggatccctctactgaaatatccgaagaaacgcttaaacagctttaccaaaggacgaacccttacaaacagttcaaaaatgatagcagggtggccttttgctcttttacaaatttgcgggagcagtatattcgacgtcttataatgactagctttattggatatgtcttcaaagctctgcaggaatggatgccttcctattcaaaacctacccacacgaccaaaactcttctcagtgagctaataacgttagttgatactttgaaacaggaaactaatgatgttccctctgaatcggtagtaaatacaattttatctatagcagatagctgcaaaacccagacgcagaaaagcaaggaagctaaaacaacgatcgatagctttttacgagaacattttgtgtttgatcctaatcttcatgctcaaagtgcgtatacttgtgcagataccaatgtagacacttgtgcaagcatgtgtgcagataccaat
gtagacacctgtgcaagcatgtgtgcagataccaatgtagatacctgtgcaagcacttgtacaagcacagaatacaccgatttagcagatcctgagcgcatccctttacacatcatgcaaaaaacattaaatgtgcctaatgagcttcaggccgatattgatgcaatcacccaaaccccacagggctatagggcagcagcccacatattacaaaatatagaacttcaccaaagcattaaacatatgcttgaaaatccgagggcgtttaaacccattctctttaacacaaaaattactagatatctttcgcagcatattccacctcaggatactttttataagtggaattattacattgaggataattacgaagagttgcgggccgctacggaaagcatctacccagaaaaacccgacctagagtttgccttcattatttatgatgtggtggatagcagcaaccaacaaaaggttgatgaattttattataaatataaagaccagattttctcagaggtttcatccattcaattaggcaactggacactcctgggaagctttaaggccaacagagagcgctacaattattttaatcaaaataatgaaataataaaacggattttggaccgtcatgaggaagacctaaagataggaaaagagattttacgaaatactatttaccacaaaaaagcaaaaaatatacaagaaactggcccggatgctccggggctctccatctataattcaacctttcacacggatagcgggattaagggactgctttcctttaaggagctaaaaaacctagaaaaagcatctggaaatatcaaaaaagctcgagagtatgattttatagacgactgcgaagaaaaaattaagcaactgcttagtaaagaaaatttaacccccgatgaagaaagcgagctgataaaaacaaaaaaacagttagataatgcgcttgaaatgctcaatgtgcctgatgatacgatacgggtagatatgtgggtcaacaataataataaactcgaaaaagaaattttatatacaaaagcagaattgggaggcggaagcggcggtggaggatcaatggcatcaggaggagctttttgtcttattgctaacgatgggaaggccgacaagattatattggcccaagacttgctgaatagcaggatctctaacattaaaaatgtgaacaaaagttatgggaaacccgatcccgaacccactttgagtcaaatcgaagaaacacatttggtgcattttaatgcgcattttaagccttatgttccagtagggtttgaatacaataaagtacgcccgcatacgggtacccccaccttgggaaacaagcttacctttggtattccccagtacggagactttttccatgatatggtgggccatcatatattgggtgcatgtcattcatcctggcaggatgctccgattcagggcacgtcccagatgggggcccatgggcagcttcaaacgtttcctcgcaacggatatgactgggacaaccaaacacccttagagggcgccgtttacacgcttgtagatccttttggaagacccattgtacccggcacaaagaatgcgtaccgaaacttggtttactactgcgaataccccggagaacgactttatgaaaacgtaagattcgatgtaaatggaaattccctagacgaatatagttcggatgtcacaacgcttgtgcgcaaattttgcatcccaggggataaaatgactggatataagcacttggttggccaggaggtatcggtggagggaaccagtggccctctcctatgcaacattcatgatttgcacaagccgcaccaaagcaaacctattcttaccgatgaaaatgatacgcagcgaacgtgtagccataccaacccgaaatttctttcacagcattttcccgagaactctcacaatatccaaacagcaggtaaacaagatattactcctatcacggacgcaacgtatctggacataagacgtaatgttcattacagctgtaatggacctcaaacccctaaatactatcagccccctcttgcgctctggattaagttgcgcttttggtttaatgagaacgtgaaccttgctattccctcagtatccattcccttcggcgagcgctttatcaccataaagcttgcatcgcaaaaggatttggtgaatgaatttcctggactttttgtacgccagtcacgttttatagctggacgccccagtagacgcaatatacgctttaaaccatggtttatcccaggagtcattaatgaaatctcgctcacgaataatgaactttacatcaataacctgtttgtaacccctgaaatacacaacctttttgtaaaacgcgttcgcttttcgctgatacgtgtccataaaacgcaggtgacccacaccaacaataaccaccacgatgaaaaactaatgtctgctcttaaatggcccattgaatatatgtttataggattaaaacctacctggaacatctccgatcaaaatcctcatcaacaccgagattggcacaagttcggacatgttgttaacgccattatgcagcccactcaccacgcagagataagctttcaggatagagatacagctcttccagacgcatgttcatctatatctgatattagccccgttacgtatccgatcacattacctattattaaaaacatttccgtaactgctcatggtatcaatcttatcgataaatttccatcaaagttctgcagctcttacatacccttccactacggaggcaatgcgattaaaacccccgatgatccgggtgcgatgatgattacctttgctttgaagccacgggaggaataccaacccagtggtcatattaacgtatccagagcaagagaattttatattagttgggacacggattacgtggggtctatcactacggctgatcttgtggtatcggcatctgctattaactttcttcttcttcagaacggttca
gctgtgctgcgttacagtacc
39.重组腺病毒载体pad-cmv-egfp-b602l-b646l的构建：
40.(1)将构建的过渡载体重组质粒pentr-egfp-asfv-b602l-b646l利用lr重组反应与腺病毒骨架载体pad-cmv-3
×
flag进行重组，lr重组反应体系如表1。
41.表1 lr重组反应体系
[0042][0043]
将4μl vorte
×
lr clonase
tm enzyme mix加入到以上组份中，涡旋混合；25℃孵育1h；加入2μl的2μg/μl的蛋白酶k溶液，37℃孵育10min；
[0044]
(2)dh5α大肠杆菌感受态细胞，氨苄霉素抗性lb平板筛选，挑取单克隆pcr鉴定，得到重组腺病毒载体pad-cmv-egfp-b602l-b646l。
[0045]
重组腺病毒的包装：
[0046]
(1)ad293细胞铺板：吸取2ml/孔的细胞液于6板中，置于37℃，5％co2培养箱中继续培养，待6板中的293t细胞培养至汇合度为70％-80％时，进行转染；
[0047]
(2)质粒准备：向200μl的buffer中加入2μg线性化的pad-cmv-egfp-b602l-b646l，涡旋混匀10s后瞬时离心至管底，加入4μlreagent，涡旋混匀1s后瞬时离心，室温静置10min；将混合液逐滴加入到培养基中，轻轻摇匀，37℃培养。
[0048]
(3)72h观察荧光表达，7d左右时观察ad293细胞状态及出毒效率，当观察到细胞脱落、变圆且间隙变大时(如图1)，将上清及细胞全部收集置于-80℃反复冻融3次，12000
×
g，离心10min收集上清；
[0049]
(4)将收集的重组腺病毒接种t25瓶中已长至单层的293t细胞，5-7d细胞脱落大致为50％时，收集上清及细胞置于-80℃反复冻融3次，12000xg，离心10min收集上清；
[0050]
(5)重复感染t25瓶，收毒；
[0051]
(6)浓缩纯化重组腺病毒。
[0052]
重组腺病毒的滴度测定
[0053]
将稀释10-6
倍的重组腺病毒接种293t细胞，利用adeno
‑×
rapid titer kit腺病毒滴度测定试剂盒测定重组腺病毒的滴度，选取阳性细胞数为5-50个的视野计数，计算重组腺病毒滴度，结果为10
10
pfu/ml。
[0054]
腺病毒表达验证
[0055]
1)细胞准备：吸取0.5ml/孔的细胞液于24孔板中，置于37℃，5％co2培养箱中继续培养，待24孔板中的293t细胞培养至汇合度为80％时，进行感染；
[0056]
2)取50μl上述的重组腺病毒上清感染细胞，72h观察荧光；
[0057]
3)wb标签蛋白检测，检测结果显示，在约130kd处出现了特异性条带，与预期结果一致，可知包装成功的重组腺病毒感染细胞，可表达b602l-b646l蛋白。
[0058]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。