一组检测非洲猪瘟病毒的引物、探针、免提取试剂盒及应用的制作方法

1.本发明涉及基因检测领域，具体是指一组检测非洲猪瘟病毒的引物、探针、免提取 核酸的试剂盒及应用。


背景技术：

2.非洲猪瘟(african swine fever,asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus, asfv)引起的烈性传染病，发病率和死亡率极高，难以扑灭，严重危害养猪业的健康 发展。该病oie法定报告动物疫病，被我国列为一类动物传染病。
3.asf疫情导致养猪业产能下降，造成巨大的经济损失。
4.asfv复杂多样的传播方式。猪科哺乳动物是asfv宿主，包括非洲疣猪、非洲 林猪、非洲红河猪、非洲巨林猪、野猪、野化猪以及家猪等。钝缘蜱是asfv的另一 类宿主，是其重要的储存宿主。asfv在钝缘蜱肠道上皮细胞中复制是通过叮咬传播 asfv的关键，而asfv也可以经卵传递。
5.asf的防控和净化对我国养猪业生猪产能复苏和健康可持续发展至关重要。建立 一种特异、简便、灵敏的asf检测方法，对临床不同样品进行快速诊断及明确asfv 在不同规模养殖场生态环境中的分布、生物媒介携带病原情况等，对构建养殖场立体 生物安全防控策略具有重要的指导意义
6.建立一种简便、快速、特异的检测方法，对临床上不同样品的诊断以及明确asfv 在不同规模养殖场生态环境中的分布、生物媒介携带病原情况等具有重要的支撑作用。 本发明提供了一种检测asfv的引物、探针，建立了asfv荧光pcr检测方法并组装 了asfv免提取核酸的检测试剂盒，为asf防控提供了有效的技术支撑。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题是提供一种能够特异的、灵敏的检测非洲猪瘟病毒的 引物、探针以及一种非洲猪瘟病毒特异性的免提取核酸的荧光pcr检测试剂盒和应用 方法。
8.具体的，本发明的技术方案为：一组检测非洲猪瘟病毒的引物、探针，根据非洲 猪瘟病毒p72基因的保守序列区域设计，探针5’端标记荧光基团，探针3’端标记淬灭 基团，所述的引物序列分别为seq id no.1、seq id no.2所示的核苷酸序列，所述 的探针为seq id no.3所示的核苷酸序列。
9.优选的是，所述的引物及探针序列分别为seq id no.1、seq id no.2、seq id no. 3所述核苷酸序列中的至少一个核苷酸经过缺失和/或替代和/或移位所构成的核苷酸 序列。
10.上述任一方案中优选的是，所述荧光基团选自fam、joe、vic、hex、rox、 cy3、cy5任意一种。
11.上述任一方案中优选的是，所述荧光基团为fam。
12.上述任一方案中优选的是，所述淬灭荧光基团为tamra。
13.本发明还公司一种采用上述任一项所述的引物、探针在制备检测或诊断非洲猪瘟 病毒的试剂中的用途。
14.本发明还公司一种检测非洲猪瘟病毒的荧光定量pcr试剂盒，采用含有上述任一 项所述的引物、探针。
15.优选的是，还包括样品裂解液、荧光pcr反应缓冲液、阳性标准品、阴性对照以 及无rna酶水。
16.上述任一方案中优选的是，所述阳性标准品为含有p72基因部分序列的质粒，其中 非洲猪瘟病毒p72基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
17.本发明提供一种荧光pcr方法检测非洲猪瘟病毒的引物及探针，所述引物包括荧 光pcr扩增的上游引物和下游引物，其序列分别如seq id no.1、seq id no.2，所 述探针5’端标记fam荧光基团，3’端标记tamra淬灭基团，所述探针序列如seq idno.3。所述引物及探针位于非洲猪瘟病毒p72保守序列区域内。
18.本发明同时提供一种检测非洲猪瘟病毒的免提取核酸荧光pcr试剂盒，该试剂盒 内包含样品裂解液、荧光pcr反应液、阴性对照样品、阳性对照样品、无，所述荧光 pcr反应液包含权利要求1中的引物及探针。
19.进一步，试剂盒荧光pcr反应液中引物浓度为0.24μmol/l，探针浓度为0.16μ mol/l。
20.进一步，试剂盒扩增反应体系共25μl，具体包括：
[0021][0022]
进一步，所述的阳性对照样品为含目的基因片段的质粒，阴性对照为无酶水。
[0023]
进一步，所述试剂盒的检测应用包括以下步骤：
[0024]
步骤(1)样品处理；
[0025]
取样本5～10μl放入离心管中，加入50μl裂解液，漩涡振荡，室温或95℃处理 3min；裂解完成后，向离心管中加入稳定缓冲液，漩涡混匀，最后低速瞬时离心；
[0026]
步骤(2)取5μl样品处理上清液加入至20μl荧光pcr反应液中，同时向另外 2个pcr反应管中分别加入阴性对照和阳性对照样品各5μl；
[0027]
步骤(3)荧光pcr扩增，反应条件包括但不限于：预变性95℃5min，95℃30s， 59℃30s，40个循环，59℃时收集荧光；
[0028]
本发明提供的引物、探针可应用在非洲猪瘟病毒检测中。
[0029]
本发明提供的试剂盒可应用在非洲猪瘟病毒检测中。
[0030]
本发明提供一组用于非洲猪瘟病毒检测的引物、探针、免提取试剂盒及其应用，属 于分子生物学诊断技术研发领域。本发明所述的引物、探针位于非洲猪瘟病毒p72基 因的保守序列区域内，本发明采用所述的引物、探针，建立了一种检测非洲猪瘟病毒 的荧光定
量pcr方法，该方法具有简单快速、特异性强、灵敏度高等特点。同时，本 发明采用所述的引物、探针及建立的方法，组建了免提取核酸的非洲猪瘟病毒检测试 剂盒，适用于临床上非洲猪瘟病毒的检测。本发明为非洲猪瘟的快速、准确的检测及 其防控提供了有效的技术手段。
[0031]
本发明的有益效果具体如下：
[0032]
本发明的检测非洲猪瘟病毒的引物、探针、免提取核酸的试剂盒，具备以下有益 效果：
[0033]
(1)高特异性：所述引物、探针具有高特异性，可识别非洲猪瘟病毒p72基因， 保证了荧光pcr的特异性，与其他猪常见的病毒无交叉反应，特异性检测结果见图1。
[0034]
(2)高敏感性：本发明检测灵敏性高，验证结果显示本发明的荧光pcr方法最 低可检测到10拷贝/μl标准品，检测方法敏感性结果如图2。
[0035]
(3)操作简便：本发明提供的试剂盒，样品处理简单，检测过程简化，将5μl 加入荧光pcr反应液中即可。
[0036]
(4)所需设备简单：操作过程中仅需金属浴、小型离心机等简单设备即可，检测 中可适用便携荧光pcr仪，也适用实验室较大型的荧光pcr仪，能够较好地满足非洲 猪瘟病毒现场检测需求或实验室检测需求。
附图说明
[0037]
图1为荧光pcr特异性试验结果；
[0038]
图2为荧光pcr敏感性试验结果。
具体实施方式
[0039]
本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解为本发明的保护范围并不受具 体实施方式的限制。
[0040]
本发明所阐述的方法，应理解为不限于本发明所述的具体方法和实验条件，因为 该方法和条件可作适当改变。进一步，本文使用的术语仅是用于描述具体实施方案， 而不是用来限制。
[0041]
本发明在实践或测试过程中可使用与本文类似或相同的材料和方法，但本文所述 为优选的材料和方法。
[0042]
本发明所使用的材料和材料的质量控制均为本领域专业技术人员一般性认可的。
[0043]
检测非洲猪瘟病毒的引物、探针、免提取核酸的试剂盒具体的制备方法为：
[0044]
1材料与方法
[0045]
1.1病毒与核酸
[0046]
猪伪狂犬病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪流行性腹 泻病毒等病毒由实验室分离鉴定并保存。非洲猪瘟病毒dna由实验室保存非洲猪瘟标 准品提取。
[0047]
1.2主要仪器
[0048]
abi 7300荧光定量pcr仪、高速冷冻离心机为thermo fisher scientfic公司产品； pcr仪为bio-rad产品；nano drop 2000超微量分光光度计为life产品。
[0049]
1.3主要材料与试剂
[0050]
室温样品裂解液(roomtemp sample lysis kit)、探针法荧光pcr预混液(acequniversal u
+
probe master mix v2)为南京诺唯赞生物科技有限公司产品；胶回收试剂 盒(gel extraction kit)、质粒小提试剂盒(plasmid extraction mini kit)为omega产 品；pmd18-t载体为大连takara产品。
[0051]
1.4引物
[0052]
从genbank上检索并下载非洲猪瘟病毒p72基因全基因序列，利用megalign软 件进行比对分析，筛选p72基因的保守序列区域并利用生物学软件在保守序列区域设 计引物和探针，序列分别如seq id no1、seq id no2、seq id no3。
[0053]
seq id no1：ataaagcgctcgccgaa，
[0054]
seq id no2：ccttttgcgatgcaagcttt，
[0055]
seq id no3：fam-tgctattccctcggtatccatt-tamra。
[0056]
seq id no4序列见序列表。
[0057]
1.5标准样品的制备
[0058]
利用标准样品制备引物，以非洲猪瘟病毒dna为模板，pcr扩增p72基因标准样 品的dna。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延 伸1min，共计35个循环；72℃延伸10min。参照omega胶回收试剂盒说明书对目 的片段进行胶回收，并连接于载体，构建重组质粒。利用紫外分光光度计测定其质量 浓度，按照公式copies/μl＝(6.02
×
10
23
copies/mol)
×
(浓度g/ml)
×
10-3
/(分子质量 g/mol)计算拷贝数。
[0059]
1.6荧光pcr反应条件的优化
[0060]
荧光pcr反应体系固定为25μl。以标准样品为模板，对荧光定量pcr方法的 退火温度(55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃)进行优化，并利用 矩阵法对引物(10μm/l)及探针(10μm/l)使用量(0.2μl、0.4μl、0.6μl、 0.8μl、1.0μl)依次进行优化。
[0061]
1.7特异性试验
[0062]
以非洲猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒、猪 瘟病毒、猪流行性腹泻病毒等病毒dna或cdna为模板，通过荧光定量pcr检测评 价荧光pcr方法的特异性。
[0063]
1.8敏感性试验以1
×
107拷贝/μl-1
×
100拷贝/μl标准样品为模板进行荧光定 量pcr检测评估荧光pcr方法的最低检测限。
[0064]
1.9重复性试验以1
×
105拷贝/μl-1
×
104拷贝/μl、1
×
103拷贝/μl标准样品为模板 进行3批重复试验，每批次重复3次以检验其批内重复效果。在不同时间对该试验进 行3次重复试验以检验该方法批间重复效果。
[0065]
1.10比较试验
[0066]
以实验室保存的非洲猪瘟标准样品开展比较试验，比较提取核酸和免提取核酸后， 荧光pcr方法的检测符合率。标准样品4份，每份包含5个样品，共包含阳性样品12 个，阴性样品8个。利用核酸提取试剂盒提取20份样品核酸，同时用样品裂解液对样 品进行裂解处理，随后进行荧光pcr检测，通过比较检测结果的符合率，对两种检测 方式以及组装的免提取试剂盒进行评估。
[0067]
2结果
[0068]
2.1标准品样品的制备利用标准样品制备引物进行pcr扩增，经琼脂糖凝胶电 泳检测，成功扩增出标准样品的目的片段。pcr产物胶回收后，连接于t载体并进行 转化、筛选及测序鉴定，成功构建了重组标准品质粒。获得的重组质粒测定质量浓度 后计算拷贝数，作为标准样品对荧光pcr进行评价。
[0069]
2.2荧光定量pcr方法条件优化反应体系为25μl，经过优化最终确定为qpcrmix 10μl，探针(10μm/l)0.4μl，上/下游引物(10μm/l)0.6μl，模板5μl，ddh2o 补至25μl。经过对反应条件的优化，最终确定该方法最佳的反应条件为：95℃预变 性3min；95℃变性30s，59℃退火30s(收集荧光)，共计45个循环。
[0070]
2.3特异性检验以非洲猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒、猪呼吸与繁殖 综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒等病毒dna或cdna为模板进行检测。结 果表明，该方法仅与非洲猪瘟病毒核酸存在特异性反应，与其他病毒不存在交叉反应， 这表明其特异性良好，如图1所示。
[0071]
2.4敏感性试验以1
×
107拷贝/μl-1
×
100拷贝/μl标准样品作为模板进行荧 光定量pcr检测，检测结果显示，所建立的荧光定量pcr方法最小检出下限为10拷 贝。荧光pcr敏感性试验结果如图2所示。
[0072]
2.5重复性检验以1
×
105copies/μl、1
×
104copies/μl、1
×
103copies/μl标准 样品为模板进行批内、批间重复性试验。结果表明，批内变异系数和批间变异系数均 小于5％，说明该方法重复性良好，荧光pcr重复性试验结果如下表1所示：
[0073]
表1荧光pcr重复性试验
[0074][0075]
2.6比较试验
[0076]
分别对20份样品进行核酸提取和免提取裂解处理，然后利用本发明的非洲猪瘟病 毒荧光pcr方法分别进行检测，结果发现，两种检测方式的符合率达90％以上，本申 请的检出率高达95％。核酸免提取方式检出率较高。在临床大批量样品检测中，核酸 免提取处理方式提供一种简便的处理方式，可以提高检测效率。
[0077]
本发明不限于上述实施例的细节，在不背离本发明的精神或基本特征的情况下， 能够以其他的具体形式实现本发明。因此，上述的实施例具有示范性的，但非限制性 的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的 等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图 标记视为限制所涉及的权利要求。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以 描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅 是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案 也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
[0078]
[0079]