一种蝗虫消化道菌群鉴定方法
1.（一）技术领域本发明属于微生物学技术领域，特别涉及一种蝗虫消化道菌群鉴定方法。
2.（二）
背景技术：
昆虫进化历史悠久、分布环境广、食性杂，与生存环境之间建立了密切的关系，其中昆虫与其共生物的关系十分复杂，与昆虫的生命活动关系密切。对于虫菌之间关系的研究，以往多集中于昆虫病原微生物及其应用的研究，而以微生态学理论为指导开展的昆虫肠道环境微生物的研究较少。昆虫肠道系统是伴随取食、消化、排泄等活动而多变的环境，其中寄居的微生物与昆虫的营养生理活动发生着密切的关系,从而影响到昆虫的生命活动。
3.昆虫同其他动物一样，其消化系统为各种微生物提供适宜的生活环境，反过来，肠道微生物对宿主动物产生两方面的作用：一是助消化，为动物提供各种营养物质；二是起到益生素的作用，调控肠道微生物区系本身之间的平衡，保证动物的健康。昆虫肠道微生物对宿主具有营养、免疫、生物刺激、生物拮抗等作用，是机体的生理组成部分。通过研究昆虫肠道环境微生态状况并加以调节，可以实现害虫的生物防治,更重要的是可以促进微生态制剂的研制及其在昆虫生产学中的应用。
4.（三）
技术实现要素：
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种蝗虫消化道菌群鉴定方法，提高了东亚飞蝗对肠炎病的防控能力，在雨季肠炎病泛滥时，使东亚飞蝗的产量提高50%左右。
5.本发明是通过如下技术方案实现的：一种蝗虫消化道菌群鉴定方法，其特征是：包括以下步骤：（1）、选取死亡的东亚飞蝗成虫若干只，放入70%-80%的酒精中浸泡8s-12s；（2）、在无菌操作下取出虫体并置于0.1%升汞液中消毒1.5-2.5min；（3）、将消毒后的虫体移入灭菌水中清洗，然后进行无菌解剖；（4）、取出虫体的消化道，在灭菌研钵中研磨；（5）、将研磨液用灭菌水稀释至1
×
10-1-1
×
10-8
；（6）、用平板稀释法或涂抹法进行分离；（7）、分别置于25℃-30℃的智能光照培养箱和厌氧培养箱中培养70-74h；（8）、挑取表征各异的菌落在na平板上划线、纯化、培养；（9）、将纯化后菌落再分别移植斜面培养，并依次编号；（10）、将分离纯化的各类细菌菌株进行菌体形态染色，观察培养形状并测试生理生化指标，进行鉴定。
6.优选的，在步骤（1）中，将东亚飞蝗成虫放入75%的酒精中浸泡10s。
7.优选的，在步骤（2）中，对虫体消毒2min。
8.优选的，在步骤（3）中，在蜡盘中进行无菌解剖。
9.优选的，在步骤（5）中，分别稀释至1
×
10-6
、1
×
10-7
和1
×
10-8
三个稀释度。
10.优选的，在步骤（7）中，在培养箱中培养72h。
11.本发明的有益效果是：对菌群进行分离纯化，通过形态学分析和分子生物学鉴定，确定获得的有益菌株分别为类芽孢杆菌属、米勒氏菌属和肠杆菌属；其次，测定了其对东亚飞蝗肠炎病的防控能力，可以在雨季肠炎病泛滥时，使东亚飞蝗的产量提高50%左右。
12.（四）具体实施方式实施例1：选取死亡的东亚飞蝗成虫10只，分别放入70%的酒精中浸泡8s,在无菌操作下取出虫体并置于0.1%升汞液中消毒1.5min，移入灭菌水中清洗，然后在蜡盘中进行无菌解剖。分别取出其消化道，在灭菌研钵中研磨。将研磨液用灭菌水稀释至1
×
10-6
、1
×
10-7
和1
×
10-8
三个稀释度用平板稀释法和涂抹法进行分离，各稀释度重复3次，分别置于25℃的智能光照培养箱和厌氧培养箱中培养70h，挑取表征各异的菌落在na平板上划线、纯化、培养。将纯化后菌落再分别移植斜面培养，并依次编号。将东亚飞蝗成虫肠道内中分离纯化的各类细菌菌株的进行菌体形态染色，观察培养形状并测试生理生化指标，进行鉴定。
13.实施例2：选取死亡的东亚飞蝗成虫12只，分别放入75%的酒精中浸泡10s,在无菌操作下取出虫体并置于0.1%升汞液中消毒2min，移入灭菌水中清洗，然后在蜡盘中进行无菌解剖。分别取出其消化道，在灭菌研钵中研磨。将研磨液用灭菌水稀释至1
×
10-6
、1
×
10-7
和1
×
10-8
三个稀释度用平板稀释法和涂抹法进行分离，各稀释度重复3次，分别置于30℃的智能光照培养箱和厌氧培养箱中培养72h，挑取表征各异的菌落在na平板上划线、纯化、培养。将纯化后菌落再分别移植斜面培养，并依次编号。将东亚飞蝗成虫肠道内中分离纯化的各类细菌菌株的进行菌体形态染色，观察培养形状并测试生理生化指标，进行鉴定。
14.实施例3：选取死亡的东亚飞蝗成虫14只，分别放入80%的酒精中浸泡12s,在无菌操作下取出虫体并置于0.1%升汞液中消毒2.5min，移入灭菌水中清洗，然后在蜡盘中进行无菌解剖。分别取出其消化道，在灭菌研钵中研磨。将研磨液用灭菌水稀释至1
×
10-6
、1
×
10-7
和1
×
10-8
三个稀释度用平板稀释法和涂抹法进行分离，各稀释度重复3次，分别置于30℃的智能光照培养箱和厌氧培养箱中培养74h，挑取表征各异的菌落在na平板上划线、纯化、培养。将纯化后菌落再分别移植斜面培养，并依次编号。将东亚飞蝗成虫肠道内中分离纯化的各类细菌菌株的进行菌体形态染色，观察培养形状并测试生理生化指标，进行鉴定。
15.通过对东亚飞蝗肠道环境细菌的分离纯化，共获得16个细菌菌株，并对16个细菌菌株进行鉴定试验。供试菌株在na培养基上培养24h,按照革兰氏染色法和3%koh简易法，区别16个细菌菌株，有12个细菌菌株呈革兰氏阴性反应，4个细菌菌株呈革兰氏阳性反应。经油镜观察和按照磷钨酸复染法电镜观察，15个菌株为杆状，1个菌株为球状。将分离纯化的供试菌在na和nb培养基上，28℃培养48h后观察记载，16个细菌菌株在两种培养基各呈不同的表现，如下：
状，扁平，湿润，透明，灰白色。菌膜沉淀，混浊。
[0016]9ꢀꢀ
杆状
ꢀꢀ
g+
ꢀꢀ
无
ꢀꢀ
好氧
ꢀꢀ
圆形，整齐，凸起，透明，湿润，有光泽，淡乳黄色。菌膜沉淀。
[0017]
10
ꢀꢀ
杆状
ꢀꢀg‑ꢀꢀ
无
ꢀꢀ
兼性厌氧
ꢀꢀ
小，圆形,整齐，凸起，半透明，湿润，光滑，灰白色。菌膜，沉淀。
[0018]
11
ꢀꢀ
杆状
ꢀꢀg‑ꢀꢀ
无
ꢀꢀ
兼性厌氧
ꢀꢀ
圆形，整齐，凸起,半透明，湿润,光滑，淡黄乳色。菌膜沉淀，轻微的混浊。
[0019]
12
ꢀꢀ
杆状
ꢀꢀg‑ꢀꢀ
无
ꢀꢀ
兼性厌氧
ꢀꢀ
圆形,整齐，稍凸起，湿润,有光泽，透明，淡黄色。菌膜,沉淀。
[0020]
13
ꢀꢀ
杆状
ꢀꢀg‑ꢀꢀ
周生
ꢀꢀ
兼性厌氧
ꢀꢀ
圆形，整齐，凸起，透明，湿润，光滑，有光泽，灰白色。菌膜，浑浊。
[0021]
14
ꢀꢀ
球形
ꢀꢀg‑ꢀꢀ
无
ꢀꢀ
兼性厌氧
ꢀꢀ
同形，略起，湿润,光滑，不透明，白色。菌膜,沉淀，浑浊。
[0022]
15
ꢀꢀ
杆形
ꢀꢀg‑ꢀꢀ
周生
ꢀꢀ
兼性厌氧
ꢀꢀ
不规则,波状扩展,半湿润,透明，灰白色。菌
环，浑浊,沉淀。
[0023]
16
ꢀꢀ
杆形
ꢀꢀg‑ꢀꢀ
无
ꢀꢀ
兼性厌氧
ꢀꢀ
小点圆形，凸起，整齐，湿润，透明，淡白色。菌膜，沉淀。
[0024]
经对应检查菌体形态、染色反应、培养性状、生理生化反应等各项指标鉴定，结果如下：