一种单细胞内RNA全转录组标记和测序的方法

本技术涉及测序领域。具体涉及一种单细胞内rna全转录组标记的方法。进一步的，涉及一种单细胞内rna全转录组测序的方法，以及一种单细胞内rna m6a修饰组的测序方法和一种单细胞内rna结合蛋白结合位点的测序方法。

背景技术：

1、表观遗传学是经典遗传学的重要补充，在不改变dna序列的情况下，核酸、蛋白质等生物大分子时刻处于时空特异、双向可逆的动态修饰之中，可遗传的调控着基因表达的变化。随着人类基因组计划的完成和测序技术的进步，核酸修饰逐渐成为了新的研究热点。在核酸表观遗传领域中，rna修饰引发的表观转录组学在近些年受到大量的关注。rna中除了常规的四种组成碱基之外，在碱基和糖环上还存在着一些化学修饰。目前，研究人员已经在rna分子上发现了170多种化学修饰，这些修饰广泛存在于各种rna类型中，包括转运rna(trna)、核糖体rna(rrna)、信使rna(mrna)、长链非编码rna(lncrna)、核内小rna(snrna)和核仁小rna(snorna)等。在rna修饰的早期发展阶段，相关研究主要集中在含量丰富的非编码rna上，例如trna、rrna和snrna等。随着rna化学修饰在全转录组水平上的发现与鉴定，rna修饰相关酶和识别蛋白的发现，以及潜在生物医学功能的揭示，引发了“表观转录组学”的研究热潮。

2、目前，在真核生物的mrna上已经发现了包括端帽结构处的7-甲基鸟嘌呤(m7g)，n6,2’-o-二甲基腺嘌呤(m6am)，2-氧甲基化(nm)，还包括内部的n6-甲基腺嘌呤(m6a)、次黄嘌呤(i)、n1-甲基腺嘌呤(m1a)、5-甲基胞嘧啶(m5c)、假尿嘧啶(ψ)和n4-乙酰胞嘧啶(ac4c)。其中，m6a修饰是mrna上含量最丰富且研究最广泛的一种甲基化修饰。目前发现m6a可以影响rna的剪接、稳定性和翻译等代谢过程，进而调控组织分化、记忆形成、肿瘤发生、病毒感染等重要的生理和病理过程。

3、对于rna m6a修饰来说，目前基于抗体、酶和化学分子开发了多种各具特色的全转录组检测方法(hartstock k.,et al.2019,chemistry)，但是目前仍然没有能在单细胞中检测m6a修饰的测序方法。

4、为开发单细胞rna m6a修饰的检测方法，需要开发一种能够实现单细胞内全转录组标记的测序的方法。

技术实现思路

1、本技术的发明人在研究过程中注意到，在单细胞测序过程中，现有技术普遍利用随机引物或者混合的随机引物和多聚t的引物，但是这些方法逆转录都会造成polya尾巴rna较多的系统偏差。而且由于二代测序的读长限制，这些方法建立的rna文库不能覆盖完整的转录组，只能对转录本的一侧进行测序。所以本技术的发明人对rna片段进行打断，以多轮rna连接标记rna分子，保证测序的均一性，并设计了独特的接头组(第一接头组至第四接头组)。例如，在第一接头组的第一链中的第一个碱基设置为任意的随机碱基(序列表中用n表示)，这是为了排除碱基的差异所带来的连接效率的差别。本发明的标记方法实现了标记链和rna链在同一链，这种标记不会受到高温加热导致解链的影响。

2、进一步的，本技术的方法与现有技术的主要区别在于本技术使用了连接法标记细胞而不是基于碱基配对和逆转录，而且标记信息链和rna处于同一链，实现稳定的标记，有利于后续提取rna和抗体富集等操作。现有技术在标记过程中使用了rna逆转录酶会导致rna以dna:rna杂合链的形式存在，造成rna修饰信息的识别困难，也可能造成rna的降解。本发明保证了rna完整的单链状态。在标记rna的同时不影响rna的状态。

3、因此，在第一方面，本技术提供了一种单细胞内rna全转录组标记的方法，所述方法包括：

4、(1)提供含有细胞的样品，对所述细胞进行固定和通透；

5、(2)将细胞内rna打断，并进行3’末端修复，获得多个rna片段；

6、(3)对所述rna片段进行标记，具体步骤如下：

7、(a)提供第一接头组，所述第一接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第一链，以及第二链，

8、其中，所述第一链包含连接序列以及模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第一链含有不同的连接序列以及相同的模板序列；所述第二链包含第一模板序列和第二模板序列，且第二链的第一模板序列与第一链的模板序列互补，

9、将腺苷酰化酶(adenylase)和第一链接触，在允许核酸杂交或退火的条件下，将所述第一接头组与所述rna片段接触，以使得所述第一接头组的第一链与rna片段的3’末端连接；

10、(b)提供第二接头组，所述第二接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第三链，

11、其中，所述第三链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第三链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列；所述第三链的第一模板序列与所述第一接头组中的第二链的第二模板序列互补，

12、在允许核酸杂交或退火的条件下，将所述第二接头组与步骤(a)的产物接触，以使得所述第二接头组与第一接头组的第一链的3’末端连接；

13、任选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，将第一中和引物(例如，第二链)与上述退火后获得的产物接触，所述第一中和引物(例如，第二链)与第三链的第一模板序列、第二模板序列或它们的部分序列互补；

14、(c)提供第三接头组，所述第三接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第四链，以及第五链，

15、其中，所述第四链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第四链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列，

16、所述第五链包含第一模板序列和第二模板序列，其中，第五链的第一模板序列与第三链的第二模板序列互补，第五链的第二模板序列与第四链的第一模板序列互补，

17、在允许核酸杂交或退火的条件下，将所述第三接头组与步骤(b)的产物接触，以使得所述第三接头组的第四链与第二接头组的3’末端连接；

18、任选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，将第二中和引物(例如，第五链)与上述退火后获得的产物接触，所述第二中和引物(例如，第五链)与第三接头组中的第四链的第一模板序列、第二模板序列或它们的部分序列互补；

19、(d)提供第四接头组，所述第四接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第六链，以及第七链，

20、其中，所述第六链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为14至20个(例如，14个，15个，16个，17个，18个，19个，20个)碱基的随机排列，且每一条第六链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列，

21、所述第七链包含第一模板序列和第二模板序列，其中，第七链的第一模板序列与第四链的第二模板序列互补，第七链的第二模板序列与第六链的第一模板序列互补，

22、在允许核酸杂交或退火的条件下，将所述第四接头组与步骤(c)的产物接触，以使得所述第四接头组的第六链与第三接头组的第四链的3’末端连接；

23、任选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，将第三中和引物(例如，第七链)与上述退火后获得的产物接触，所述第三中和引物(例如，第七链)与第四接头组中的第六链的第一模板序列、第二模板序列或它们的部分序列互补；

24、(e)提供第五接头组，所述第五接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第八链，

25、其中，所述第八链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第八链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列；所述第八链的第一模板序列与第六链的第二模板序列互补，

26、在允许核酸杂交或退火的条件下，将所述第五接头组与步骤(d)的产物接触，以使得所述第五接头组与第四接头组的第六链的3’末端连接；

27、(f)在允许核酸连接的条件下，将dna聚合酶与步骤(g)获得的产物接触；

28、(4)分选单细胞，即获得rna全转录组标记的单细胞。

29、在某些实施方案中，每一轮的接头组的第一链、第三链、第四链或第六链的序列中都带有特定的6-12个碱基序列，称为连接序列。连接序列设计的原则是特异。在某些实施方案中，连接序列是8个碱基的任意排列组合。在某些实施方案中，任意变动2个以下的碱基，连接序列的序列都不会相同。这是为了防止测序错误导致的误差。在某些实施方案中，连接序列(即，含有连接序列的第一链、第三链、第四链或第六链)的数量跟实验的单细胞的数量是对应的，连接序列(即，含有连接序列的第一链、第三链、第四链或第六链)的数量必须大于一次测序所检测的细胞数。数量越大越好，但是相应的操作工作量也变大，所以数量一般在10倍的细胞数为宜。

30、在某些实施方案中，每一轮的接头组中的第一链、第二链、第三链、第四链、第五链、第六链、第七链和第八链的序列中都含有模板序列，目的是为了能够和其余链互补。例如，在某些实施方案中，第二链的第一模板序列与第一链的模板序列互补。在此类实施方案中，只要能够实现上述互补功能的所述第一模板序列和所述模板序列，都在本技术意欲保护的范围内，并不局限于实施例所具体使用的序列。而设计能够互补的所述第一模板序列和所述模板序列的方法，对于本领域技术人员来说是已知的。

31、在某些实施方案中，第一接头组中的第一链进行腺苷酰化反应。在某些实施方案中，第一接头组中的第一链通过腺苷酰化酶(adenylase)进行腺苷酰化反应。

32、在某些实施方案中，第一链、第三链、第四链和第六链均进行磷酸化反应。在某些实施方案中，第一链、第三链、第四链和第六链的5’末端均带有磷酸化修饰。

33、在某些实施方案中，第六链的第二模板序列与用于测序的引物互补。

34、在第二方面，本技术提供了一种单细胞内rna全转录组测序的方法，所述方法包括：

35、(1)通过如前所述的方法对单细胞内rna全转录组标记；

36、(2)富集如前所述的方法中步骤(4)获得的单细胞中的rna；

37、(3)对所述rna进行测序，即实现单细胞内rna全转录组测序。

38、在某些实施方案中，全转录组包含了全部rna的信息，例如，mrna，rrna，trna。

39、在第三方面，本技术提供了一种单细胞内rna m6a修饰组测序的方法，所述方法包括：

40、(1)通过如前所述的方法对单细胞内rna全转录组标记；

41、(2)富集如前所述的方法中步骤(4)获得的单细胞中的rna；

42、(3)对所述rna进行测序，即实现单细胞内rna m6a修饰组测序；

43、任选地，对上述步骤(2)的产物进行醇沉以及rrna去除。

44、在第四方面，本技术提供了一种单细胞内rna结合蛋白结合位点的测序方法，所述方法包括：

45、(1)通过如前所述的方法对单细胞内rna全转录组标记；

46、(2)富集步骤(1)获得的单细胞中的rna；

47、(3)对步骤(5)获得的产物进行洗脱，获得rna-蛋白质复合物；

48、(4)将步骤(3)获得的rna-蛋白质复合物进行凝胶电泳并转膜，选择目标蛋白上方区域的rna-蛋白质复合物产物进行切胶回收；

49、(5)提取步骤(4)获得的产物中的rna，并建立rna文库；

50、(6)对步骤(5)获得的产物进行醇沉以及rrna去除；

51、(7)对步骤(6)获得的rna进行测序，即实现单细胞内rna结合蛋白结合位点的测序。

52、在某些实施方案中，在步骤(2)中，富集具体包括如下步骤：

53、(i)对步骤(4)获得的单细胞进行醇沉；

54、(ii)去除步骤(i)获得的产物中的dna；

55、(iii)利用步骤(ii)获得的产物建立rna文库。

56、在某些实施方案中，在步骤(2)中，富集具体包括如下步骤：

57、(i)对步骤(4)获得的单细胞进行rna提取纯化和醇沉；

58、(ii)对步骤(i)获得的产物进行免疫沉淀(例如，充分洗涤并用m6a核苷类似物进行竞争洗脱释放含有m6a修饰的rna)；

59、(iii)对步骤(ii)获得的产物进行洗脱。

60、在某些实施方案中，对(iii)获得的产物进行醇沉以及去除rrna。

61、在某些实施方案中，所述建立rna文库的方法包括：

62、(a)对(ii)获得的产物中的rna进行反转录；

63、(b)对步骤(a)获得的产物进行pcr扩增；

64、(c)对步骤(b)获得的产物进行t7-rna聚合酶扩增；

65、(d)去除步骤(c)获得的产物中的rrna；

66、(e)对步骤(d)获得的产物进行反转录以及pcr扩增。

67、在某些实施方案中，所述醇沉的步骤包括：将sds、蛋白酶k和triton x-100溶液与细胞接触；然后提取rna；然后加入乙醇、醋酸钠以及糖原。

68、在某些实施方案中，步骤(a)中，所述连接序列为9个碱基的随机排列。

69、在某些实施方案中，步骤(b)和(c)中，所述连接序列为8个碱基的随机排列。

70、在某些实施方案中，步骤(d)中，所述连接序列为16个碱基的随机排列。

71、在某些实施方案中，步骤(e)中，所述连接序列为8个碱基的随机排列。

72、在某些实施方案中，所述第一链的模板序列的长度为16-22个碱基(例如，19个碱基)。

73、在某些实施方案中，所述第二链的第一模板序列的长度16-22个碱基(例如，19个碱基)。

74、在某些实施方案中，所述第二链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。

75、在某些实施方案中，所述第三链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。

76、在某些实施方案中，所述第三链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。

77、在某些实施方案中，所述第四链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。

78、在某些实施方案中，所述第四链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。

79、在某些实施方案中，所述第五链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。

80、在某些实施方案中，所述第五链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。

81、在某些实施方案中，所述第六链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。

82、在某些实施方案中，所述第七链的第二模板序列的长度为18-22个碱基(例如，20个碱基)。

83、在某些实施方案中，所述第八链的第一模板序列的长度为20-24个碱基(例如，22个碱基)。

84、在某些实施方案中，所述第八链的第二模板序列的长度为30-36个碱基(例如，33个碱基)。

85、在某些实施方案中，所述第一接头组包含96条第一链，所述第一链具有如seq idno:1至seq id no:96所示的序列；或者，所述第一接头组包含70条第一链，所述第一链具有如seq id no:1至seq id no:70所示的序列。

86、在某些实施方案中，第二链具有如seq id no:97所示的序列。

87、在某些实施方案中，所述第二接头组包含96条第三链，所述第三链具有如seq idno:98至seq id no:193所示的序列；或者，所述第二接头组包含70条第三链，所述第三链具有如seq id no:98至seq id no:167所示的序列。

88、在某些实施方案中，所述第三接头组包含96条第四链，所述第四链具有如seq idno:195至seq id no:290所示的序列；或者，所述第三接头组包含70条第四链，所述第四链具有如seq id no:195至seq id no:264所示的序列。

89、在某些实施方案中，第五链具有如seq id no:291所示的序列。

90、在某些实施方案中，所述第四接头组包含96条第六链，所述第六链具有如seq idno:293至seq id no:388所示的序列；或者，所述第四接头组包含70条第六链，所述第六链具有如seq id no:293至seq id no:362所示的序列。

91、在某些实施方案中，所述第七链具有如seq id no:389所示的序列。

92、在某些实施方案中，在步骤(b)至步骤(d)中，提供dna聚合酶(例如，dna连接酶，例如，t4 dna连接酶)。

93、在某些实施方案中，在步骤(1)中，使1％-5％(例如，1％，2％，3％，4％，5％)甲醛与细胞接触，冰上放置10min-30min(例如，15min)，加入5％digitonin，评估细胞通透的情况。

94、在某些实施方案中，在步骤(1)中，取个106细胞，使其与dpbs接触，然后与10ml4％甲醛接触，在冰上固定20分钟。使其与10μl 5％digitonin，30μl rna酶抑制剂接触，冰上放置5分钟。

95、在某些实施方案中，在步骤(2)中，细胞内rna打断的方法为通过离子和高温加热方法或rna酶切方法。

96、在某些实施方案中，离子和高温加热方法的具体步骤为：在金属离子(例如，镁离子或锌离子)的存在下，25℃-42℃(例如，25℃，28℃，30℃，32℃，35℃，37℃，40℃，42℃)水浴30min-120min(例如，30min，60min，90min，120min)。

97、在某些实施方案中，离子和高温加热方法的具体步骤为：在锌离子的存在下，37℃水浴90min。然后，加入edta与缓冲液(例如，dpbs中加入500μl 10mm tris-hcl(ph 8.0)和20μl 5％triton x-100)。

98、在某些实施方案中，在步骤(2)中，3’末端修复的方法为：使打断的rna与核酸聚合酶(例如，t4 pnk酶)接触。

99、在某些实施方案中，在步骤(4)中，通过流式细胞术分选单细胞。

100、在本技术的另一方面，提供了一种试剂盒，其包含：

101、(a)第一接头组，所述第一接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第一链，以及第二链，

102、其中，所述第一链包含连接序列以及模板序列，所述连接序列为6至12个碱基(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)的随机排列，且每一条第一链含有不同的连接序列以及相同的模板序列；所述第二链包含第一模板序列和第二模板序列，且第二链的第一模板序列与第一链的模板序列互补；

103、(b)第二接头组，所述第二接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第三链，

104、其中，所述第三链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第三链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列；所述第三链的第一模板序列与所述第一接头组中的第二链的第二模板序列互补；

105、(c)第三接头组，所述第三接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第四链，以及第五链，

106、其中，所述第四链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第四链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列，

107、所述第五链包含第一模板序列和第二模板序列，其中，第五链的第一模板序列与第三链的第二模板序列互补，第五链的第二模板序列与第四链的第一模板序列互补；

108、(d)第四接头组，所述第四接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第六链，以及第七链，

109、其中，所述第六链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为14至20个(例如，14个，15个，16个，17个，18个，19个，20个)碱基的随机排列，且每一条第六链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列，

110、所述第七链包含第一模板序列和第二模板序列，其中，第七链的第一模板序列与第四链的第二模板序列互补，第七链的第二模板序列与第六链的第一模板序列互补；

111、(e)第五接头组，所述第五接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第八链，

112、其中，所述第八链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第八链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列；所述第八链的第一模板序列与第六链的第二模板序列互补；

113、任选地，所述试剂盒还包含：用于腺苷酰化的试剂(例如，腺苷酰化酶(adenylase))，用于磷酸化的试剂(例如，t4多聚核苷酸激酶(t4polynucleotidekinase))，dna聚合酶(例如，t4 dna连接酶)，金属离子(例如，锌离子，镁离子)，用于细胞固定和通透的试剂(例如，甲醛，甲醇，digitonin，tritonx-100，tween-20)，用于打断rna的试剂(例如，核糖核酸酶(rnase i)，微球菌核酸酶(mnase))，用于rna测序的试剂，用于rna 3’末端修复的试剂，用于分选单细胞的试剂，或其任意组合。

114、在某些实施方案中，所述第一链的连接序列为9个碱基的随机排列。

115、在某些实施方案中，所述第三链和第四链的连接序列为8个碱基的随机排列。

116、在某些实施方案中，所述第六链的连接序列为16个碱基的随机排列。

117、在某些实施方案中，所述第八链的连接序列为8个碱基的随机排列。

118、在某些实施方案中，所述第一链的模板序列的长度为16-22个碱基(例如，19个碱基)。

119、在某些实施方案中，所述第二链的第一模板序列的长度为16-22个碱基(例如，19个碱基)。

120、在某些实施方案中，所述第二链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。

121、在某些实施方案中，所述第三链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。

122、在某些实施方案中，所述第三链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。

123、在某些实施方案中，所述第四链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。

124、在某些实施方案中，所述第四链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。

125、在某些实施方案中，所述第五链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。

126、在某些实施方案中，所述第五链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。

127、在某些实施方案中，所述第六链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。

128、在某些实施方案中，所述第七链的第二模板序列的长度为18-22个碱基(例如，20个碱基)。

129、在某些实施方案中，所述第八链的第一模板序列的长度为20-24个碱基(例如，22个碱基)。

130、在某些实施方案中，所述第八链的第二模板序列的长度为30-36个碱基(例如，33个碱基)。

131、在某些实施方案中，所述第一接头组包含96条第一链，所述第一链具有如seq idno:1至seq id no:96所示的序列；或者，所述第一接头组包含70条第一链，所述第一链具有如seq id no:1至seq id no:70所示的序列。

132、在某些实施方案中，第二链具有如seq id no:97所示的序列。

133、在某些实施方案中，所述第二接头组包含96条第三链，所述第三链具有如seq idno:98至seq id no:193所示的序列；或者，所述第二接头组包含70条第三链，所述第三链具有如seq id no:98至seq id no:167所示的序列。

134、在某些实施方案中，所述第三接头组包含96条第四链，所述第四链具有如seq idno:195至seq id no:290所示的序列；或者，所述第三接头组包含70条第四链，所述第四链具有如seq id no:195至seq id no:264所示的序列。

135、在某些实施方案中，第五链具有如seq id no:291所示的序列。

136、在某些实施方案中，所述第四接头组包含96条第六链，所述第六链具有如seq idno:293至seq id no:388所示的序列；或者，所述第四接头组包含70条第六链，所述第六链具有如seq id no:293至seq id no:362所示的序列。

137、在某些实施方案中，所述第七链具有如seq id no:389所示的序列。

138、如前所述的试剂盒在单细胞内rna全转录组标记中的用途；或在单细胞内rna全转录组测序中的用途；或在单细胞内rna m6a修饰组测序中的用途；或用于单细胞内rna结合蛋白结合位点的测序中的用途。

139、术语定义

140、在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组dna等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

141、如本文所使用的，术语“转录组(transcriptome)”与“全转录组”表示相同的含义，可互换使用。其是指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合。通常，转录组包括信使rna、核糖体rna、转运rna及非编码rna。转录组测序包括了组织或细胞中所有的mrna，无论mrna是否会进行翻译。

142、如本文所使用的，术语“腺苷酰化”是指以5’端磷酸化的单链dna为底物，利用腺苷酰化酶将atp分解成amp和ppi，amp转移到单链dna的5’磷酸基团上，形成腺苷酰化单链dna，从而制备出腺苷酰化接头。

143、如本文所使用的，术语“磷酸化”是指磷酸化是将磷酸基团加在中间代谢产物上或加在蛋白质(protein)上的过程。

144、如本文所使用的，术语“n6-甲基腺嘌呤(m6a)修饰”是指在腺苷6位的n原子上插入一个甲基取代基。

145、如本文所使用的，术语“rna结合蛋白(rna binding protein，rbp)”是指一类伴随rna的调控代谢过程与rna结合的蛋白质的总称。rna结合蛋白是细胞中一类重要的蛋白质，它们通过识别特殊的rna结合域与rna互作，广泛参与到rna剪切、转运、序列编辑、胞内定位及翻译控制等多个转录后调控过程中。

146、如本文所使用的，术语“免疫沉淀”是指利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白及其结合的核酸底物的一种方法。通常来说，免疫沉淀首先通过抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合，再与蛋白a/g(proteina/g)或二抗偶联的珠子(agarose或sepharose)孵育，通过离心得到珠子-蛋白a/g或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，可用于沉淀产物的纯化提取，包括蛋白质，dna或者rna。

147、如本文所使用的，术语“醇沉(alcohol precipitation)”是指一种除去杂质保留目的有效成分的方法。本文中是指利用乙醇沉淀rna，该方法利用核酸是多聚阴离子的水溶性化合物，可以与许多1价、2价离子结合形成盐类，后者在有机溶剂中不溶解也不变性，在较低温度下形成沉淀，从而去除其他杂质的方法。

148、如本文所使用的，术语“中和引物”是指能够与接头组互补的引物，即能够实现中和接头组的功能的全部引物。在本技术的方法中，为了保证接头组的正确连接，在混样之前需要提前将多余的接头组用中和引物进行提前饱和配对消耗。本领域技术人员可以理解，本技术的中和引物并不局限于实施例所实际使用的具体序列的中和引物，只要能够实现中和接头组功能的引物均属于本技术所意欲保护的范围。因此，在某些实施方案中，第一中和引物是能够与第三链的第一模板序列、第二模板序列或它们的部分序列互补的引物。在某些实施方案中，第一中和引物是第二链。在某些实施方案中，第二中和引物是能够与第三接头组中的第四链的第一模板序列、第二模板序列或它们的部分序列互补的引物。在某些实施方案中，第二中和引物是第五链。在某些实施方案中，第三中和引物是能够与第四接头组中的第六链的第一模板序列、第二模板序列或它们的部分序列互补的引物。在某些实施方案中，第三中和引物是第七链。

149、发明的有益效果

150、与现有技术相比，本技术的方法实现了单细胞水平的rna标记，能够对细胞内所有的rna片段进行无偏差标记，而现有技术存在普遍的mrna偏好性。申请的方法与现有技术的主要区别在于本技术使用了连接法标记细胞而不是碱基配对，标记信息链和rna处于同一链，实现稳定的标记，有利于后续提取rna和抗体富集等操作。本技术的方法保证了rna完整的单链状态。在标记rna的同时不影响rna的状态。

151、另外，目前尚无可实现高通量单细胞m6a检测的方法，而本技术提供了高通量单细胞rna m6a标记及测序的方法，填补了这一领域的空白。

152、下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。