一种肿瘤组织匀浆液代血清微组织块个体化药敏检测方法与流程

1.本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种肿瘤组织液代血清微组织块个体化体外肿瘤组织培养体系，该体系在体外实验中最大限度地保持肿瘤细胞天然的生物学特性，能够快速、准确得到药敏检测数据，为肿瘤患者的个性化精准治疗提供临床依据。


背景技术：

2.近年来，恶性肿瘤发病率持续上升，手术联合化疗依然是肿瘤治疗的主要手段。但由于个体间存在差异，同一类型肿瘤对不同化疗药物的敏感性存在差异。体外化疗药敏实验可以协助肿瘤科医生提前了解不同患者对不同化疗药物的敏感性，制定出个体化的化疗方案，实现肿瘤患者精准用药。因此，在体外建立能够保留亲本肿瘤组织的基因组学和遗传学特性，操作简单、易于评价的检测模型是改善肿瘤化疗效果，实现肿瘤个体化治疗的重要途径。
3.类器官最大的优势是可以作为患者肿瘤的替身，较好地保留亲本肿瘤的异质性，同时可以高通量筛药，精准预测抗癌药物的疗效。由细胞聚集形成的多细胞肿瘤球体模型因简单易用而被认为是三维癌症模型的“金标准”。本技术拟选择手术后肿瘤组织，基于原代肿瘤细胞自组装形成肿瘤三维微球的新技术，建立肿瘤类器官培养体系和类器官筛药平台，为实现肿瘤患者的个性化精准治疗提供临床依据。
4.现有的抗肿瘤药药敏检测方法存在以下问题：1.体外二维细胞培养筛药体系，个体化差、准确性不高，最终能通过临床实验的只有5％，且易产生耐药，造成了极大的成本浪费。2.体外三维细胞培养体系的建立，需要肿瘤组织长大到一定程度才能进行，周期花费时间长，步骤操作繁琐，无法精准且个体化还原体内肿瘤组织三维结构以及所处微环境，给临床应用造成了不便。


技术实现要素：

5.为解决现有技术的不足，本发明旨在提供一种体外组织培养液代血清微组织块个体化组织块培养体系用于抗肿瘤药药敏检测，无需通过手术得到组织样本，不会对患者造成大的创伤；并且可以在肿瘤早期进行检测，解决了肿瘤个性化治疗方案筛选及抗肿瘤药物评价耗时长，数据相关性差的问题，最大程度保留肿瘤的异质性和原有的微环境，保证了肿瘤组织的效能。
6.本发明采用的技术方案如下：
7.一种肿瘤组织匀浆液代血清微组织块个体化药敏检测方法，包括以下步骤：
8.a)制备人工基底膜三维组织体外低粘附培养皿和培养板；
9.b)获取新鲜肿瘤组织样本，取一部分制备大小均一的肿瘤微组织块；
10.c)将剩余部分组织块称重，转移至灭菌玻璃匀浆器中，制备组织匀浆液，得到含一定比例的组织匀浆液的培养基；
11.d)将b)中大小均一的肿瘤微组织块加入c)中含一定比例的组织匀浆液的培养基
中，形成组织匀浆液代血清微组织块个体化培养体系，于37℃，5％co2含量的细胞培养箱稳定孵育；
12.e)将d)中稳定后的肿瘤微组织块进行台盼蓝活性检测；
13.f)将有活性的肿瘤微组织块接种到低粘附培养板中，与化疗药物共孵育；
14.g)采用葡萄糖代谢和mtt方法，对化疗方案进行药敏性检测。
15.进一步地，在步骤a)中，所制备的低粘附培养皿和培养板为聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯(phema)，是为了防止肿瘤组织块中细胞游出，贴壁生长，保持了天然的肿瘤细胞-基质-细胞相互作用。所述人工基底膜三维组织体外低粘附培养皿或培养板的制备方法是，将phema按照15mg:1ml加入到85％乙醇中，待聚合物完全溶解，将聚合物的乙醇溶液加入培养皿或培养板中，细胞培养甁在37℃下干燥24h，制备人工基底膜三维组织体外低粘附培养皿或培养板备用。
16.进一步地，在步骤b)中，新鲜肿瘤组织是医生在做肿瘤切除手术时从肿瘤生长比较旺盛的部位上切取的，切除的肿瘤组织装入含有组织保存液的50ml离心管中，冰包低温运输至实验室，标本离体至低温运输到实验室的时间最长不超过48小时，最好在2个小时内；将获取的新鲜肿瘤组织样本用pbs洗涤1-2遍，取活性高的一部分制备1mm3大小均一的肿瘤微组织块。具体的，所述大小均一的肿瘤微组织块的制备，获取肿瘤组织样本，将患者新鲜肿瘤组织块放置无菌容器中，加pbs洗涤2次，去除血污、坏死、液化及微生物污染组织等，置于hanks缓冲液中快速切块，得到1mm3的均匀组织块。
17.进一步地，在步骤c)中，将剩余部分组织块称重，转移至灭菌玻璃匀浆器中，按组织块：培养基等于1g：5ml比例加入培养基，研磨匀浆后离心，收集滤液为组织匀浆液原液；将滤液和无血清培养基按不同比例稀释，得到组织匀浆液的体积浓度为10％～20％，过大可能会影响渗透压，过小无法模拟体内环境。具体的，所述培养基为无血清培养基；所述离心在离心管中进行，条件为转速10000-15000rpm，时间5-10min，之后将上清液转移至新离心管中，过0.22μm滤器，收集滤液为组织匀浆液原液。
18.进一步的，所述d)步骤中的稳定孵育体系为，在96孔板中，每孔加入3个瘤块，200ul上述含一定比例的组织匀浆液的培养基中，形成组织匀浆液代血清微组织块个体化培养体系，于37℃，5％co2含量的细胞培养箱稳定孵育。
19.进一步的，所述e)进行的微组织块活性检测方法为台盼蓝活性检测，0.4％的台盼蓝染液检测肿瘤组织活性，剔除没有活性的组织，然后用含有3％双抗的pbs冲洗组织；
20.进一步的，在步骤f)中，分离第二天即换液，之后每隔三天换一次含一定比例的组织匀浆液的培养基，共培养5天。
21.进一步的，在步骤g)中，葡萄糖代谢检测方法，接种孔每孔取上清20μl至培养板，加入80μl邻甲苯胺溶液，沸水中水浴5min，酶标仪630nm检测吸光值；
22.mtt检测方法，接种孔每孔加入20μl的mtt溶液，培养箱中孵育2-4h，待组织颜色变深，弃上清，每孔加入dmso 150μl，培养箱中孵育30min，待组织褪色，取上清至新的96孔板，酶标仪测定540nm吸光值。采用的mtt溶液可换成cck试剂，mts试剂等检测试剂。
23.所述g)步骤中化疗方案敏感性判定将孔板各孔的吸光度值进行换算，进而计算出每种药物对肿瘤组织块活性的影响，以活性抑制率为主，葡萄糖消耗率为辅，选取活性抑制率高且葡萄糖消耗率低的化疗方案。
24.与现有技术相比，本发明有益效果为：(1)本发明使用的肿瘤切除后制备的肿瘤组织匀浆液，内含多种细胞因子，最大限度的在体外培养过程中保持与体内状态的一致性，使体外药敏实验更贴近于真实情况，检测结果更可靠，筛选出的药物在患者体内更有效。而其他方法多使用牛血清、化合物、合成蛋白等非自体成分，可能会导致肿瘤细胞状态的变化，无法完全模拟体内环境，导致检测结果可能与实际情况有偏差。(2)本发明所述的肿瘤组织块比“器官样细胞”更真实，这些“器官样细胞”是从“干细胞”中生长出来的，而“干细胞”不是真正的肿瘤片段，需要很长时间才能建立，并且不包含基质细胞因为对抗癌药物的反应可以直观和快速地获得，因为癌症和各种基质细胞以及肿瘤中的细胞外基质成分不会被破坏；(3)本发明所述方法操作简单，实验条件要求低，可以快速、准确的筛选出最适合患者的肿瘤化疗方案；本发明所述的肿瘤组织匀浆液代血清微组织块个体化体外培养体系，最大限度的保持了肿瘤的异质性和微环境，为测试候选药物的功效和毒性不良反应提供体内仿生筛药平台。(4)本发明所述的肿瘤精准、个性化培养体系，可以应用于药物研发和筛选，药物药效与毒性的研究，临床患者化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗的敏感性预测及个性化治疗的研究。
附图说明
25.图1：本发明所述方法流程示意图；其中，a肿瘤微组织制备；b肿瘤微组织培养；c药物刺激；d数据收集；
26.图2：药物处理后，不同比例组织匀浆液培养基对肿瘤微组织培养。
27.图3：药物处理后，肿瘤微组织mtt细胞活力测定图。
具体实施方式
28.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下对本发明进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅是本技术一部分实施例，而不是全部实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性的劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
29.实施例1：
30.荷瘤小鼠脱颈椎处死后，转移至超净台中；取小鼠肿瘤组织块，转移至培养皿中，pbs洗涤1-2遍；将清洗过的组织块，取活性高的部分切成大小约1mm3的均匀小块；将剩余部分组织块称重，转移至灭菌玻璃匀浆器中，按组织块(g)：无血清培养基(ml)等于1：5的比例加入无血清培养基，研磨匀浆；将研磨好的组织匀浆液转移至离心管中，15000rpm，5min离心；离心后取上清液转移至新离心管中，过0.22um滤器，收集滤液；将滤液和无血清培养基分别按不同体积比例1：6(15％)，1：9(10％)，1：19(5％)稀释，得到含一定比例的组织匀浆液的培养基；在96孔板中，每孔加入3个瘤块，200ul上述匀浆液，每个浓度做5个复孔，同时设置含10％自体血清和10％胎牛血清培养肿瘤组织做对照组；将96孔板置于co2培养箱中孵育；分离第二天即换液，之后每隔三天换一次培养液，共培养5天，得到肿瘤类器官。
31.实施例2：
32.将实施例1所述方法得到肿瘤类器官做药敏实验，测试药物有长春新碱、表柔比星、吡柔比星、多西他赛、5-氟尿嘧啶、顺铂、环磷酰胺、吉西他滨和奥沙利铂。给药3天后，每
孔加入5mg/ml的mtt溶液20μl，继续孵育4小时，终止培养，吸取培养基，每孔加入150μl的dmso，振荡10min，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度。
33.细胞活性抑制率％＝(对照组吸光值-实验组吸光值)/对照组吸光值*100％，当抑制率大于30％时，药物即为有效。
34.由图2可知，按15％、10％、5％浓度的肿瘤组织匀浆液，10％自体血清和10％胎牛血清分别培养肿瘤组织，发现15％和10％浓度的肿瘤组织匀浆液组中肿瘤细胞的迁移能力明显高于其他组，说明肿瘤组织匀浆液可以更好的维持肿瘤细胞的特性。
35.图3为肿瘤微组织块对不同化疗药物的敏感性结果，其中抑制率的临界值为30％，抑制率低于30％的药物可视为无效药物。