GP130结合分子及使用方法与流程

本发明涉及生物活性分子，所述生物活性分子包括特异性结合至gp130的胞外结构域的单域抗体，包含这种单域抗体的组合物，及其使用方法。

背景技术：

1、糖蛋白130(gp130)，也称为il6st、il6r-β和cdw130m，是一种高度保守的跨膜蛋白，在il6受体家族中形成1型细胞因子受体的亚基。gp130在人体中普遍表达，是至少九种细胞因子的共享受体亚基，包括il6、il27、心肌营养素-1(ct-1)和神经生成素(np)、制瘤素m(osm)、白血病抑制因子(lif)、il11、睫状神经营养因子(cntf)和心肌营养素样细胞因子(clc)。这些不同的细胞因子介导高度多样的生物过程，因此gp130已被证明在各种类型的癌症、心血管疾病、自身免疫性疾病中发挥作用。通过形成适当的受体复合物，gp130能够与多种细胞因子相互作用，从而与50多种不同的细胞反应相关联。

2、gp130的胞外结构域包括六个连续的三明治结构域(d1--d6)：n-末端免疫球蛋白样结构域(d1)，然后是五个纤连蛋白3型结构域(d2-d6)。大多数配体与膜远端结构域d1、d2和d3中的gp130相互作用。细胞因子反应需要n-末端d1免疫球蛋白样结构域。作为对配体结合的反应，胞内结构域与janus激酶(jak)相互作用，以提供胞内信号转导

3、除了其膜结合形式外，gp130还具有三种可溶性同种型sgp130-raps、sgp130-e10和“全长”sgp130。gp130的可溶性形式缺乏跨膜和胞质结构域，但保留了胞外配体结合结构域。gp130的可溶性形式与il6受体的可溶性形式相互作用。尽管sgp130的生理作用尚未完全确定，但已假定sgp130通过抑制gp130信号转导具有抗炎作用。sgp130对于il6:sil6r具有高亲和力(1mm)，该复合物驱动促炎和促动脉粥样硬化的il6反式信号转导途径。sgp130与il6:sil6r的结合导致il6:sil6r复合物的中和，从而降低其炎症活性。在小鼠中，sgp130的重组形式(sgp130fc)与动脉粥样硬化硬化小鼠实验模型中的保护作用相关联。可溶性gp130也被报道可抑制il-6、osm、lif和cntf的功能。

4、尽管gp130在人体中普遍表达，但其表达在各种器官和细胞类型中差异显著，并且在成人器官中的表达高于胎儿组织。由于gp130参与多种细胞因子信号转导途径，认为其他受体亚基表达的差异可能有助于与涉及gp130的受体的配体相关联的不同且广泛变化的功能。例如，il-6r以相对较高的水平存在于肝脏、中性粒细胞和白细胞中。lif受体在神经系统和免疫系统中高度表达。il-11r在t淋巴细胞、心房和主动脉中高度表达

5、由于gp130在一系列组织和器官类型的细胞信号转导中的核心作用，gp130已被提议作为干预多种人类疾病状态的靶点。例如，抗-gp130抗体已被提出用于调节与创伤、感染和损伤相关的急性期炎症反应。harrison,等(1996)british journal of haematology 95(3):443-451。harrison等证明了针对gp130的胞外结构域的单克隆抗体在下调急性期反应中的il6急性期反应方面是有效的。okamato等观察到，抗-gp130单克隆抗体可以在u1细胞中抑制il-6-诱导的hiv-1的表达，这表明阻断gp130信号转导可能对治疗hiv-1感染具有治疗潜力。okamato,等(1997)biochemistry and molecular biology international 43(4):733-740。

6、下调或抑制gp130活性的药剂已被证明在多种癌症类型中有效。xu等报道了一种口服小分子gp130抑制剂用于治疗卵巢癌。xu,等(2013)mol cancer ther；12(6)；937–49。martin等证明，gp130的表达与膀胱癌的侵袭性形式相关，并且用sirna抑制gp130提供了肿瘤特异性反应，表明阻断gp130在控制肿瘤生长方面具有治疗性潜力martin,等(2019)molcancer ther；18(2):413-420。此外，burger等证明，在治疗骨髓瘤方面，抗-gp130抗体比抗-il6抗体更有效，并且gp130抗体治疗可完全预防浆细胞瘤的发展。burger,等(2017)haematologica 102(2):381–390。

7、尽管单克隆抗体是用于检测和定量蛋白质的最广泛的试剂，但单克隆抗体是约150kda的大分子，有时会限制其在多个试剂竞争近表位识别的试验中的使用。一类独特的免疫球蛋白，含有重链结构域，但缺乏轻链结构域(通常称为重链”抗体(hcab))存在于骆驼科动物中，包括单峰骆驼、双峰驼、野生双峰驼，美洲驼、羊驼、骆马和原驼，以及软骨鱼类，如鲨鱼。hcab的分离的可变结构域区域被称为vhh(反映其“可变-重-重”结构的缩写)或(ablynx)。单域vhh抗体具有体积小(～12-14kd)、分子量约为常规哺乳动物igg类抗体的十分之一的优点，这有助于这些vhh分子与gp130的抗原决定簇的结合，而常规单克隆igg形式可能无法接近这些决定簇(ingram等.,2018)。此外，vhh单结构域抗体通常具有高热稳定性，有助于将药剂分布到难以或不可能维持冷链的地理区域。这些性质，特别是结合不需要重/轻链配对(如igg抗体的情况)和简单制造(如在细菌表达系统中)的简单噬菌体展示发现方法，使得vhh单域抗体在多种应用中有用，包括成像剂和治疗剂的开发。

技术实现思路

1、本发明提供了特异性结合gp130的多肽。

2、本发明提供了特异性结合gp130胞外结构域的多肽。

3、本发明提供了一种gp130结合分子，其特异性结合gp130(例如，人gp130)的胞外结构域。

4、在一些实施方式中，gp130结合分子包括单域抗体(sdab)，其特异性结合至人gp130的胞外域。

5、在一些实施方式中，gp130结合分子是sdab，sdab包含一组cdr，对应于cdr1、cdr2和cdr3，如下表1的行所示。

6、在一些实施方式中，gp130结合分子包含如下表1的行中所述的cdr1、cdr2和cdr3，其中cdr1、cdr2和cdr3相对于下表1的行中所述的序列可各自独立地包含至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化。

7、在一些实施方式中，gp130结合分子由下述单域抗体(sdab)组成、任选地基本由下述单域抗体组成、或任选地包括与seq id no:2-7中任一项的多肽序列具有至少80％、或者至少85％、或者至少90％、或者至少95％、或者至少98％、或者至少99％同一性(或除了1、2、3或4个氨基酸是任选的保守取代之外是相同的)或100％的同一性的单域抗体(sdab)，如下表1所示。

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11、在一些实施方式中，将前文的cdr组纳入人源化vhh框架中以提供“人源化”sdabgp130结合分子。

12、本发明还提供了用于制备本发明的gp130结合分子的化学或重组过程的方法。

13、本发明还提供了编码gp130结合分子的核酸。下表2提供了编码如本文所述的gp130结合分子的dna序列的示例。

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17、在一些实施方式中，ilrb是鼠gp130。

18、在一些实施方式中，gp130结合分子包括单域抗体(sdab)，其特异性结合至小鼠或鼠gp130(mgp130)的胞外结构域或特异性结合人和小鼠gp130的胞外结构域。

19、在一些实施方式中，gp130结合分子是sdab，sdab包含一组cdr，对应于cdr1、cdr2和cdr3，如下表3的行所示。

20、在一些实施方式中，gp130结合分子包含如下表3的行中所述的cdr1、cdr2和cdr3，其中cdr1、cdr2和cdr3相对于下表3的行中所述的序列可各自独立地包含至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化。

21、在一些实施方式中，gp130结合分子由下述单域抗体(sdab)组成、任选地基本由下述单域抗体组成、或任选地包括与seq id no:26-74中任一项的多肽序列具有至少80％、或者至少85％、或者至少90％、或者至少95％、或者至少98％、或者至少99％同一性(或除了1、2、3或4个氨基酸是任选的保守取代之外是相同的)或100％的同一性的单域抗体(sdab)，如下表3所示。

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47、在一些实施方式中，将前文的cdr组纳入人源化vhh框架中以提供“人源化”sdabgp130结合分子。

48、本发明还提供了用于制备本发明的gp130结合分子的化学或重组过程的方法。

49、本发明还提供了编码gp130结合分子的核酸。下表4提供了编码hgp130结合分子的dna序列的例子，如上表3中所述。

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75、本发明进一步提供重组病毒和非病毒载体，其包含编码本发明的gp130结合分子或本发明的gp130结合分子的cdr的核酸。

76、本发明还提供包含重组病毒和非病毒载体的宿主细胞，所述载体包含本发明的gp130结合分子或本发明的gp130结合分子的cdr的核酸。

77、本发明还提供包含重组病毒和非病毒载体的宿主细胞，所述载体包含本发明的gp130结合分子或本发明的gp130结合分子的cdr的核酸。

78、本公开还提供了包含重组病毒和非病毒载体的药物制剂，所述载体包含本发明的gp130结合分子的核酸，以及其在治疗或预防哺乳动物对象的疾病、病症或病况中的使用方法。

79、本发明还提供包含本发明的gp130结合分子的试剂盒。

80、在另一方面，本发明提供了用于将治疗剂靶向递送至表达gp130受体的细胞的构建体，其中gp130结合分子任选地通过化学或多肽接头偶联至一种或多种治疗剂。本发明还提供了前述在治疗对象中与gp130表达相关的疾病中的使用方法，该方法包括给予需要治疗的对象治疗有效量的与治疗剂偶联的gp130结合分子，单独或与一种或多种其它治疗剂组合。在一些实施方式中，适于治疗的疾病是与来自受体(包括gp130)的信号转导相关的疾病、病症或病况。在一些实施方式中，本发明的gp130结合分子可用于治疗与失调的t细胞或b细胞活性相关的疾病。在一些实施方式中，本发明的gp130结合分子可用于治疗炎症和自身免疫病。在一些实施方式中，本发明的gp130结合分子可用于治疗与由表达gp130的细胞中失调的信号转导引起的异常细胞活性相关的肿瘤疾病。

81、在另一方面，本发明提供了用于鉴定表达gp130受体的细胞的构建体，其中gp130结合分子任选地通过化学或多肽接头偶联至一种或多种成像剂。本发明还提供了上述用于鉴定对象中表达gp130受体的细胞的使用方法，所述方法包括向需要治疗的对象给予有效量的偶联至成像剂的gp130结合分子，并评估对象是否存在偶联至gp130结合分子的成像剂。

82、在一些实施方式中，本发明的gp130结合分子可用于体外和/或体内干扰素γ活性的抑制。在一些实施方式中，本发明的ifngr1结合分子可用于治疗自身免疫病。本发明还提供了上述用于治疗对象自身免疫病的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的本发明的gp130结合分子。在一些实施方式中，本发明的gp130结合分子可以单独或与一种或多种补充治疗剂组合使用。在一些实施方式中，适于治疗的疾病是与来自受体(包括gp130)的信号转导相关的疾病、病症或病况。在一些实施方式中，本发明的gp130结合分子可用于治疗与失调的t细胞或b细胞活性相关的疾病。在一些实施方式中，本发明的gp130结合分子可用于治疗自身免疫病。在一些实施方式中，本发明的gp130结合分子可用于治疗肿瘤性疾病。在一些实施方式中，本发明的gp130结合分子在药学上可接受的制剂中给予对象。在一些实施方式中，通过给予对象包含含有编码本发明的gp130结合分子的核酸序列的重组病毒或非病毒载体的组合物，以给予本发明的gp130结合分子。

83、另一方面，本发明提供了gp130结合分子，其被修饰以延长在体内作用持续时间，其中gp130结合分子偶联至一个或多个运载体分子。

84、本发明提供了gp130结合分子，其包括特异性结合gp130胞外结构域的多肽序列，以及其用于分离、耗竭或富集表达gp130的细胞和生物样品的使用方法。