Fc受体CAR构建体和细胞的制作方法

本发明的领域是嵌合抗原受体(car)和表达这样的car的重组细胞，特别是涉及具有结合抗体的fc部分的抗原结合结构域(例如cd16 fc结合结构域、cd32 fc结合结构域或cd64 fc结合结构域)的car。

背景技术：

1、背景描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认特别地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。

2、本文中的所有出版物和专利申请都通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被特别地且单独地指明通过引用并入一样。在并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在该参考文献中的定义。

3、在许多情况下，治疗性抗体可用于产生抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(adcc)，这已成为利用基因修饰的nk细胞对各种癌症进行免疫治疗的有前途的途径。adcc由cd16受体介导，该受体结合治疗性抗体并触发颗粒酶和颗粒溶素向结合抗体的靶细胞释放。然而，不幸的是，cd16受体的表达通常被迅速下调，因此限制了使用天然nk细胞的这些抗体的治疗效用。此外，天然nk细胞上的cd16对抗体的fc部分具有相对较低的亲和力，因此甚至进一步限制了治疗用途。最近，开发了重组nk细胞(可从南克维斯特公司(nantkwest)作为hank细胞商购获得)，其表达高亲和力版本的cd16，从而显著增加了治疗潜力，因为重组cd16变体不发生下调，并且对抗体的fc部分具有更高的亲和力。

4、在另一种方法中，产生了具有cd16细胞内和跨膜部分以及cd64细胞外部分的嵌合蛋白，以维持adcc能力，并由于cd64部分而具有增加的亲和力(参见例如，frontiers inimmunology[免疫学前沿]，2018年12月，第9卷，文章2873)。这虽然在概念上有吸引力，但仍然存在各种缺点。除其他外，体内抗肿瘤活性尚未得到证明，诸位作者推测表达cd64/16a的nk细胞在连续杀伤方面可能效率较低。在进一步的尝试中，如wo 2015/179833中所述，产生了杂交构建体，其中cd64的多聚体与跨膜结构域和细胞内t细胞信号传导结构域偶联，从而用嵌合受体武装t细胞，该杂交构建体可以激活由抗体结合诱导的t细胞的细胞毒性细胞杀伤。

5、在又另一种方法中，产生了嵌合抗原受体，其包括与各种信号传导结构域偶联的cd16v结构域，如us 2018/0133252中所述。类似地，us 7618817描述了某些car构建体，其中cd16部分用于提供由nk-92细胞中的逆转录病毒构建体表达的car中的结合特异性。虽然这些方法导致了能够结合抗体的重组细胞毒性细胞，但这样的细胞系的产生通常与天然细胞毒性的丧失或降低、如与天然nk细胞相比中靶细胞杀伤减少和/或脱靶细胞杀伤增加、重组car的表达减弱和/或至少一些car构建体的car介导的细胞毒作用降低有关，即使在这样的构建体是第2代或第3代car构建体的情况下。

6、因此，尽管结合抗体fc部分的car的各种系统和方法在本领域是已知的，但它们全部或几乎全部都存在一些缺点。因此，仍然需要用于改善car和表达car的细胞的组合物和方法，这些细胞具有多种细胞毒性方式、改善的中靶细胞杀伤、减少的脱靶细胞杀伤、显著的重组car表达和/或增加的car介导的细胞毒作用。

技术实现思路

1、本发明主题涉及重组car和表达这样的car的细胞的各种组合物和方法，其中这样的细胞表现出多种细胞毒性方式、改善的中靶细胞杀伤、减少的脱靶细胞杀伤、显著的重组car表达和/或增加的car介导的细胞毒作用。

2、在本发明主题的一个方面，诸位发明人设想了一种重组嵌合抗原受体(car)，其包含具有如下多肽的抗体结合部分的抗体结合结构域，该多肽具有选自由以下组成的组的序列：seq id no：12、seq id no：16、seq id no：19、seq id no：22、seq id no：25、seq idno：28和seq id no：31。在这样的car中，抗体结合结构域进一步偶联到依次包含任选的铰链部分、跨膜部分和信号传导结构域的多肽。

3、在选定的实施例中，抗体结合结构域具有选自由以下组成的组的肽序列：seq idno：17、seq id no：20、seq id no：23、seq id no：26、seq id no：29和seq id no：32。典型地，铰链部分具有seq id no：3的肽序列，跨膜部分具有seq id no：5、seq id no：74、seqid no：76、seq id no：78、seq id no：80、seq id no：82或seq id no：84的肽序列，并且/或者信号传导结构域具有seq id no：1的肽序列。在进一步设想的实施例中，car可以包括至少一个第二信号传导结构域，其可以不同于初始信号传导结构域。例如，在一些实施例中，信号传导结构域具有选自由以下组成的组的肽序列：seq id no：7、seq id no：8和seq idno：9。

4、在进一步的示例性实施例中，这样的car中的抗体结合结构域具有选自由以下组成的组的肽序列：seq id no：17、seq id no：20、seq id no：23、seq id no：26、seq id no：29和seq id no：32，并且信号传导结构域具有seq id no：1的肽序列。优选地，铰链部分具有seq id no：3的肽序列，并且/或者跨膜部分具有seq id no：5、seq id no：74、seq idno：76、seq id no：78、seq id no：80、seq id no：82或seq id no：84的肽序列。在需要的情况下，car还可以包括至少一个另外的信号传导结构域(例如，具有seq id no：1的序列或其他信号传导结构域)。

5、在进一步设想的方面中，诸位发明人设想了一种重组核酸，其编码如本文所呈现的嵌合抗原受体。优选地但不是必须地，将核酸针对人类密码子使用进行密码子优化。此外，可以设想核酸还可以包括编码细胞因子、cd16、归巢受体和/或tgf-β陷阱的序列部分。(所有这些都可以以多顺反子配置来排列)。例如，重组核酸可以是慢病毒载体的一部分，或dna载体的一部分。

6、在仍进一步设想的方面中，本发明人设想了用如本文所呈现的重组核酸转染的(典型地是哺乳动物)细胞。例如，细胞是nk细胞(例如，nk-92细胞、基因修饰的nk-92细胞或自体nk细胞)或t细胞。从不同的角度看，诸位发明人还设想了用编码如本文所述的重组嵌合抗原受体的重组核酸转染的重组nk细胞(例如，nk-92细胞、基因修饰的nk-92细胞或自体nk细胞)。

7、因此，本发明人还设想了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其中向该患者施用治疗有效量的本文所呈现的细胞，从而治疗该癌症。最典型地，向患者施用约1x 108至约1x 1011个细胞/m2患者体表面积。此外，可以向患者施用至少一种另外的治疗实体，例如病毒癌症疫苗、细菌癌症疫苗、酵母癌症疫苗、n-803、抗体、干细胞移植物和/或肿瘤靶向细胞因子。例如，设想治疗的癌症包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性白血病、慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、实体瘤，这些实体瘤包括但不限于肉瘤和癌，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮癌、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

8、因此，在癌症的治疗中设想了如本文所呈现的细胞的用途。

9、根据优选实施例的以下详细描述以及附图(其中相同的数字代表相同的组分)，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加清楚。