从体细胞制备幼稚型人iPS细胞的方法

本技术涉及从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的方法。

背景技术：

1、已知的是，小鼠的诱导性多能干(ips)细胞和胚胎干(es)细胞接近着床前胚囊的状态，是高度未分化状态的幼稚型(naive-type)，与此相对，由常规方法制备的人ips细胞和人es细胞接近着床后胚胎的状态，保有比幼稚型发生更后期状态的始发型(primed-type)的特征。

2、已指出，人ips细胞与幼稚型的小鼠ips细胞比较，多分化能力受到限制，基因操作困难，细胞株间的基因表达和多分化能力等质量偏差大等，作为这些的主要原因之一，已指出，人ips细胞是比幼稚型发生更后期的始发型。因此，为了再生医疗的发展，迫切期望具有幼稚型的性质的人多能干细胞的制备方法。

3、迄今，作为人幼稚型多能干细胞的制备方法，已报告：(1)通过在始发型多能干细胞中表达特定基因、由含有特定成分的培养基培养，转换为幼稚型多能干细胞的方法(专利文献1、非专利文献1)，(2)通过由含有特定成分的培养基培养始发型多能干细胞，转换为幼稚型多能干细胞的方法(专利文献2～4)，(3)在重编程体细胞(成纤维细胞)时，通过从途中由含有特定成分的培养基培养，制备幼稚型ips细胞的方法(非专利文献2～4)。

4、现有技术文献

5、专利文献

6、专利文献1：wo2016/148253

7、专利文献2：特开2015-136349

8、专利文献3：wo2016/179243

9、专利文献4：wo2017/170849

10、非专利文献

11、非专利文献1：takashima y et al.,cell,158:1254-1269,2014

12、非专利文献2：theunissen t et al.,cell stem cell,15:471-487,2014

13、非专利文献3：kilens s et al.,nature communications,9:360-,2018

14、非专利文献4：liu x et al.,nature methods,14:1055-,2017

技术实现思路

1、发明要解决的课题

2、本技术的目的在于提供从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的方法。

3、用于解决课题的手段

4、本技术提供下述实施方式。

5、[1]

6、从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的方法，其包括下述步骤(1)～(3)：

7、(1)向人的体细胞导入包含重编程因子的1个以上的载体的步骤，

8、(2)在幼稚培养基的存在下，培养前述体细胞的步骤，和

9、(3)在步骤(2)之后，在幼稚培养基的存在下，在每前述体细胞的前述载体量与步骤3开始时相比减少至30％以下的条件下，培养得到的细胞的步骤。

10、[2]

11、前述[1]记载的方法，其中，前述1个以上的载体是负链rna病毒载体。

12、[3]

13、前述[2]记载的方法，其中，前述1个以上的载体是副粘病毒载体。

14、[4]

15、前述[3]记载的方法，其中，前述1个以上的载体是仙台病毒载体。

16、[5]

17、前述[1]～[4]的任一项记载的方法，其中，在步骤(1)的1～10日后开始步骤(2)。

18、[6]

19、前述[1]～[5]的任一项记载的方法，其中，在1～20日期间进行步骤(2)。

20、[7]

21、前述[1]～[6]的任一项记载的方法，其中，前述1个以上的载体选自由显示温度敏感性的载体，包含对诱导性多能干细胞特异性的微小rna的目标序列的载体，和显示温度敏感性、并且包含对诱导性多能干细胞特异性的微小rna的目标序列的载体组成的组中。

22、[8]

23、前述[7]记载的方法，其中，前述1个以上的载体是显示温度敏感性的载体。

24、[9]

25、前述[8]记载的方法，其中，前述1个以上的载体是在建立幼稚型多能干细胞的细胞培养环境下显示温度敏感性的载体。

26、[10]

27、前述[9]记载的方法，其中，前述1个以上的载体是包含以下的仙台病毒载体：ts7突变(ts突变(m蛋白的g69e/t116a/a183s突变、hn蛋白的a262t/g264r/k461g突变、p蛋白的l511f突变、和l蛋白的n1197s/k1795e突变)、加上l蛋白的y942h/l1361c/l1558i突变)、ts12突变(ts突变、加上p蛋白的d433a/r434a/k437a突变)或ts15突变(ts突变、加上p蛋白的d433a/r434a/k437a突变和l蛋白的l1361c/l1558i)。

28、[11]

29、前述[7]～[10]的任一项记载的方法，其中，步骤(3)包含在38℃以上培养得到的细胞。

30、[12]

31、前述[7]～[11]的任一项记载的方法，其中，包含对诱导性多能干细胞特异性的微小rna的目标序列的载体是负链rna病毒载体，前述微小rna的目标序列存在于np基因或p基因的翻译区、5’utr、或3’utr。

32、[13]

33、前述[12]记载的方法，其中，前述微小rna是mir-367。

34、[14]

35、前述[1]～[13]的任一项记载的方法，其中，重编程因子包含oct基因、sox基因、myc基因和/或klf基因。

36、[15]

37、前述[14]记载的方法，其中，前述1个以上的载体包括：包含oct基因、sox基因和klf基因的载体，包含myc基因的载体，和包含klf基因的载体。

38、[16]

39、前述[15]记载的方法，其中，包含myc基因的载体是包含ts15突变的仙台病毒载体。

40、[17]

41、前述[15]或[16]记载的方法，其中，包含oct基因、sox基因和klf基因的载体、和包含klf基因的载体是包含ts12突变的仙台病毒载体。

42、[18]

43、前述[1]～[17]的任一项记载的方法，其中，在步骤(3)中，每前述体细胞的前述载体量在自步骤3开始时12日以内与步骤3开始时相比减少至30％以下。

44、[19]

45、前述[1]～[18]的任一项记载的方法，其中，前述幼稚培养基包含选自白血病抑制因子(lif)、mek抑制剂、gsk3抑制剂、camp产生促进剂、tgf-β抑制剂和pkc抑制剂中的1种以上的化合物。

46、[20]

47、前述[19]记载的方法，其中，前述幼稚培养基是选自t2ilgo、5ilaf、和tt2ilgo中的培养基。

48、[21]

49、前述[1]～[20]的任一项记载的方法，其中，在饲养细胞不存在下进行步骤(2)和(3)。

50、[22]

51、前述[1]～[21]的任一项记载的方法，其中，前述人的体细胞是单核细胞或成纤维细胞。

52、[23]

53、用于从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的试剂盒，其包含：

54、包含重编程因子的1个以上的载体，其中前述1个以上的载体选自由显示温度敏感性的载体，包含对诱导性多能干细胞特异性的微小rna的目标序列的载体，和显示温度敏感性、并且包含对诱导性多能干细胞特异性的微小rna的目标序列的载体组成的组中；和

55、幼稚培养基。

56、[24]

57、前述[23]记载的试剂盒，其中，前述1个以上的载体是负链rna病毒载体。

58、[25]

59、前述[24]记载的试剂盒，其中，前述1个以上的载体是副粘病毒载体。

60、[26]

61、前述[25]记载的试剂盒，其中，前述1个以上的载体是仙台病毒载体。

62、[27]

63、前述[23]～[26]的任一项记载的试剂盒，其中，前述1个以上的载体是显示温度敏感性的载体。

64、[28]

65、前述[27]记载的试剂盒，其中，前述1个以上的载体是在建立幼稚型多能干细胞的细胞培养环境下显示温度敏感性的载体。

66、[29]

67、前述[28]记载的试剂盒，其中，前述1个以上的载体是包含以下的仙台病毒载体：ts7突变(ts突变(m蛋白的g69e/t116a/a183s突变、hn蛋白的a262t/g264r/k461g突变、p蛋白的l511f突变、和l蛋白的n1197s/k1795e突变)、加上l蛋白的y942h/l1361c/l1558i突变)、ts12突变(ts突变、加上p蛋白的d433a/r434a/k437a突变)或ts15突变(ts突变、加上p蛋白的d433a/r434a/k437a突变和l蛋白的l1361c/l1558i)。

68、[30]

69、前述[23]～[29]的任一项记载的试剂盒，其中，包含对诱导性多能干细胞特异性的微小rna的目标序列的载体是负链rna病毒载体，前述微小rna的目标序列存在于np基因或p基因的翻译区、5’utr、或3’utr。

70、[31]

71、前述[30]记载的试剂盒，其中，前述微小rna是mir-367。

72、[32]

73、前述[23]～[31]的任一项记载的试剂盒，其中，重编程因子包含oct基因、sox基因、myc基因和/或klf基因。

74、[33]

75、前述[32]记载的试剂盒，其中，前述1个以上的载体包括：包含oct基因、sox基因和klf基因的载体，包含myc基因的载体，和包含klf基因的载体。

76、[34]

77、前述[33]记载的试剂盒，其中，包含myc基因的载体是包含ts15突变的仙台病毒载体。

78、[35]

79、前述[33]或[34]记载的试剂盒，其中，包含oct基因、sox基因和klf基因的载体、和包含klf基因的载体是包含ts12突变的仙台病毒载体。

80、[36]

81、前述[23]～[35]的任一项记载的试剂盒，其中，前述幼稚培养基包含选自由白血病抑制因子(lif)、mek抑制剂、gsk3抑制剂、camp产生促进剂、tgf-β抑制剂和pkc抑制剂组成的组中的1种以上的化合物。

82、[37]

83、前述[36]记载的试剂盒，其中，前述幼稚培养基是选自由t2ilgo、5ilaf、和tt2ilgo组成的组中的培养基。

84、[38]

85、前述[23]～[37]的任一项记载的试剂盒，其中，前述人的体细胞是单核细胞或成纤维细胞。

86、[39]

87、由前述[1]～[22]的任一项记载的方法制备的幼稚型诱导性多能干细胞的培养上清液。

88、[40]

89、化妆品，其包含由前述[1]～[22]的任一项记载的方法制备的幼稚型诱导性多能干细胞的培养上清液作为原料。

90、发明效果

91、根据本技术，提供从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的方法。此外，提供用于从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的载体组和试剂盒。由本技术的方法得到的幼稚型诱导性多能干细胞实质上不含包含重编程因子的载体，性状稳定性高。

92、                         序列表

93、<110>  国立大学法人京都大学

94、       株式会社爱迪药业

95、<120>  从体细胞制备幼稚型人ips细胞的方法

96、<130>  676564

97、<150>  jp2020-217472

98、<151>  2020-12-25

99、<160>  1

100、<170>  patentin version 3.5

101、<210>  1

102、<211>  48

103、<212>  dna

104、<213>  人工序列(artificial sequence)

105、<220>

106、<223>  合成多核苷酸(synthetic polynucleotide)

107、<400>  1

108、tcaccattgc taaagtgcaa ttcgattcac cattgctaaa gtgcaatt                   48