从体细胞制备幼稚型人iPS细胞的方法

文档序号:35577774发布日期:2023-09-24 21:08阅读:来源:国知局

技术特征:

1.从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的方法,其包括下述步骤(1)~(3):

2.权利要求1所述的方法,其中,所述1个以上的载体是负链rna病毒载体。

3.权利要求2所述的方法,其中,所述1个以上的载体是副粘病毒载体。

4.权利要求3所述的方法,其中,所述1个以上的载体是仙台病毒载体。

5.权利要求1~4的任一项所述的方法,其中,在步骤(1)的1~10日后开始步骤(2)。

6.权利要求1~5的任一项所述的方法,其中,在1~20日期间进行步骤(2)。

7.权利要求1~6的任一项所述的方法,其中,所述1个以上的载体选自由显示温度敏感性的载体,包含对诱导性多能干细胞特异性的微小rna的目标序列的载体,和显示温度敏感性、并且包含对诱导性多能干细胞特异性的微小rna的目标序列的载体组成的组中。

8.权利要求7所述的方法,其中,所述1个以上的载体是显示温度敏感性的载体。

9.权利要求8所述的方法,其中,所述1个以上的载体是在建立幼稚型多能干细胞的细胞培养环境下显示温度敏感性的载体。

10.权利要求9所述的方法,其中,所述1个以上的载体是包含以下的仙台病毒载体:ts7突变,其具有ts突变(m蛋白的g69e/t116a/a183s突变、hn蛋白的a262t/g264r/k461g突变、p蛋白的l511f突变、和l蛋白的n1197s/k1795e突变)和l蛋白的y942h/l1361c/l1558i突变;ts12突变,其具有ts突变和p蛋白的d433a/r434a/k437a突变;或ts15突变,其具有ts突变、p蛋白的d433a/r434a/k437a突变和l蛋白的l1361c/l1558i。

11.权利要求7~10的任一项所述的方法,其中,步骤(3)包括在38℃以上培养得到的细胞。

12.权利要求7~11的任一项所述的方法,其中,包含对诱导性多能干细胞特异性的微小rna的目标序列的载体是负链rna病毒载体,所述微小rna的目标序列存在于np基因或p基因的翻译区、5’utr、或3’utr。

13.权利要求12所述的方法,其中,所述微小rna是mir-367。

14.权利要求1~13的任一项所述的方法,其中,重编程因子包含oct基因、sox基因、myc基因和/或klf基因。

15.权利要求14所述的方法,其中,所述1个以上的载体包括:包含oct基因、sox基因和klf基因的载体,包含myc基因的载体,和包含klf基因的载体。

16.权利要求15所述的方法,其中,包含myc基因的载体是包含ts15突变的仙台病毒载体。

17.权利要求15或16所述的方法,其中,包含oct基因、sox基因和klf基因的载体、和包含klf基因的载体是包含ts12突变的仙台病毒载体。

18.权利要求1~17的任一项所述的方法,其中,在步骤(3)中,每所述体细胞的所述载体量在自步骤3开始时12日以内与步骤3开始时相比减少至30%以下。

19.权利要求1~18的任一项所述的方法,其中,所述幼稚培养基包含选自白血病抑制因子(lif)、mek抑制剂、gsk3抑制剂、camp产生促进剂、tgf-β抑制剂和pkc抑制剂中的1种以上的化合物。

20.权利要求19所述的方法,其中,所述幼稚培养基是选自t2ilgo、5ilaf、和tt2ilgo中的培养基。

21.权利要求1~20的任一项所述的方法,其中,在饲养细胞不存在下进行步骤(2)和(3)。

22.权利要求1~21的任一项所述的方法,其中,所述人的体细胞是单核细胞或成纤维细胞。

23.用于从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的试剂盒,其包含:

24.权利要求23所述的试剂盒,其中,所述1个以上的载体是负链rna病毒载体。

25.权利要求24所述的试剂盒,其中,所述1个以上的载体是副粘病毒载体。

26.权利要求25所述的试剂盒,其中,所述1个以上的载体是仙台病毒载体。

27.权利要求23~26的任一项所述的试剂盒,其中,所述1个以上的载体是显示温度敏感性的载体。

28.权利要求27所述的试剂盒,其中,所述1个以上的载体是在建立幼稚型多能干细胞的细胞培养环境下显示温度敏感性的载体。

29.权利要求28所述的试剂盒,其中,所述1个以上的载体是包含以下的仙台病毒载体:ts7突变,其具有ts突变(m蛋白的g69e/t116a/a183s突变、hn蛋白的a262t/g264r/k461g突变、p蛋白的l511f突变、和l蛋白的n1197s/k1795e突变)和l蛋白的y942h/l1361c/l1558i突变;ts12突变,其具有ts突变和p蛋白的d433a/r434a/k437a突变;或ts15突变,其具有ts突变、p蛋白的d433a/r434a/k437a突变和l蛋白的l1361c/l1558i。

30.权利要求23~29的任一项所述的试剂盒,其中,包含对诱导性多能干细胞特异性的微小rna的目标序列的载体是负链rna病毒载体,所述微小rna的目标序列存在于np基因或p基因的翻译区、5’utr、或3’utr。

31.权利要求30所述的试剂盒,其中,所述微小rna是mir-367。

32.权利要求23~31的任一项所述的试剂盒,其中,重编程因子包含oct基因、sox基因、myc基因和/或klf基因。

33.权利要求32所述的试剂盒,其中,所述1个以上的载体包括:包含oct基因、sox基因和klf基因的载体,包含myc基因的载体,和包含klf基因的载体。

34.权利要求33所述的试剂盒,其中,包含myc基因的载体是包含ts15突变的仙台病毒载体。

35.权利要求33或34所述的试剂盒,其中,包含oct基因、sox基因和klf基因的载体、和包含klf基因的载体是包含ts12突变的仙台病毒载体。

36.权利要求23~35的任一项所述的试剂盒,其中,所述幼稚培养基包含选自由白血病抑制因子(lif)、mek抑制剂、gsk3抑制剂、camp产生促进剂、tgf-β抑制剂和pkc抑制剂组成的组中的1种以上的化合物。

37.权利要求36所述的试剂盒,其中,所述幼稚培养基是选自由t2ilgo、5ilaf、和tt2ilgo组成的组中的培养基。

38.权利要求23~37的任一项所述的试剂盒,其中,所述人的体细胞是单核细胞或成纤维细胞。

39.由权利要求1~22的任一项所述的方法制备的幼稚型诱导性多能干细胞的培养上清液。

40.化妆品,其包含由权利要求1~22的任一项所述的方法制备的幼稚型诱导性多能干细胞的培养上清液作为原料。


技术总结
本文提供从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的方法,其包括下述步骤(1)~(3):(1)向人的体细胞导入包含重编程因子的1个以上的载体的步骤,(2)在幼稚培养基的存在下,培养前述体细胞的步骤,和(3)在步骤(2)之后,在幼稚培养基的存在下,在每前述体细胞的前述载体量与步骤3开始时相比减少至30%以下的条件下,培养得到的细胞的步骤。

技术研发人员:国富晃,朱亚峰,川口实太郎
受保护的技术使用者:国立大学法人京都大学
技术研发日:
技术公布日:2024/1/15
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