一种产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其构建方法和应用

本发明属于基因工程，更具体地讲，涉及一种产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、反式橙花叔醇(trans-nerolidol，3,7,11-三甲基-1,6,10-十二碳三烯-3-醇)是一种含氧倍半萜衍生物，其存在于红檀香、花生油和橙花油中。高纯度的反式橙花叔醇是一种透明液体，其具有挥发性气味，可溶于醚、酯类和其他有机溶剂，不溶于水，主要由植物来生产。反式橙花叔醇具有消炎、抗衰老特性，因此被广泛用于食品、制药和营养行业。

2、反式橙花叔醇的生产方法主要包括化学合成法、天然提取法和微生物发酵法。首先，反式橙花叔醇可以用化学方法合成，但技术路线复杂，成本昂贵，且所合成的一般为顺式和反式橙花叔醇的混合物。其次，反式橙花叔醇也可从植物中提取，如秘鲁香、吐鲁香、降香黄檀等，并且提取获得的反式橙花叔醇具有多种功能活性。然而，提取率低，污染环境等问题限制了反式橙花叔醇提取技术的发展。第三，反式橙花叔醇还可以用工程微生物来进行生产，该方法具有原料成本低、环境污染小等优点。此外，微生物的代谢工程提供了另一种方法，通过异源生物合成途径的引入，基因工程的应用，在细菌和酵母中非天然生产具有安全性和高生物活性的反式橙花叔醇。因此微生物发酵法生产反式橙花叔醇具有明显的优势。特别是随着生物技术的快速发展，利用微生物发酵生产反式橙花叔醇成为目前研究的热点之一。

3、解脂耶氏酵母作为一种油脂酵母可以为反式橙花叔醇提供储存空间，具有利用广泛底物的能力，是公认的安全性菌株。但迄今为止，利用酵母生产反式橙花叔醇的报道并不多，并且普遍产量较低，更未有在解脂耶氏酵母中将反式橙花叔醇作为目标代谢产物的研究报道。因此亟需开发反式橙花叔醇合成的解脂耶氏酵母基因工程菌。

技术实现思路

1、本发明通过构建解脂耶氏酵母生产反式橙花叔醇的合成途径，所构建的基因工程菌株含有1个拷贝的含有点突变的优化的fragaria×ananassa duch.来源的反式橙花叔醇合成酶基因fanes1g498q和1个拷贝的yarrowia lipolytica内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因hmgr。优选的，所述的重组菌株整合了甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(erg19)、s-3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合成酶(erg13)和融合表达反式橙花叔醇合成酶(fanes1g498q)和法尼基二磷酸酯合成酶(erg20)的 fanes1g498qlerg20。所述菌株过表达了yarrowialipolytica内源的肉碱乙酰转移酶 cat 2。优选的，所述的重组菌株中过表达了携带有过氧化物酶体定位标签epts1的 s-3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合成酶erg13、磷酸甲羟戊酸激酶erg8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶erg19、将hmg-coa还原为甲羟戊酸的内源hmgr、异戊烯基二磷酸酯δ-异构酶idi和融合表达反式橙花叔醇合成酶(fanes1g498q)和法尼基二磷酸酯合成酶(erg20)的fanes1g498qlerg20，成功获得了高产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母生产菌株。因此，本发明的第一个目的是提供一种产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法。本发明的第二个目的是提供一种产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌。本发明的第三个目的是一种产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌的应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:

3、作为本发明的第一个目的，一种产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌sbt02-18的构建方法，包括如下步骤：先将解脂耶氏酵母内源的hmgr基因导入解脂耶氏酵母中，得到解脂耶氏酵母基因工程菌sbt02-16；然后再将1个拷贝的优化的含有点突变的fanes1g498q基因导入解脂耶氏酵母基因工程菌sbt02-16中获得解脂耶氏酵母基因工程菌sbt02-18，其中，优化的含有点突变的fanes1g498q基因的序列如seq id no.1所示。

4、具体的，所述的构建方法为：

5、a、将解脂耶氏酵母菌内源的基因hmgr片段经nhei和bsshii双酶切连接到质粒phr_xpr2_hrgfp中，得到质粒phr_xpr2_hmgr；

6、b、将质粒phr_xpr2_hmgr和质粒pcrispryl_xpr2转化到解脂耶氏酵母中，获得解脂耶氏酵母基因工程菌sbt02-16；

7、c、将核苷酸序列如seq id no.1所示的反式橙花叔醇合成酶基因fanes1g498q的优化序列片段经nhei和bsshii双酶切连接到质粒phr_a08_hrgfp中，得到质粒 phr_a08_fanes1g498q；

8、d、所得的质粒phr_a08_fanes1g498q和质粒pcrispryl_a08转化到解脂耶氏酵母基因工程菌sbt02-16中，获得解脂耶氏酵母基因工程菌sbt02-18。

9、根据本发明，所述构建方法还包括：将解脂耶氏酵母内源的基因erg13、erg19、fanes1g498qlerg20整合到解脂耶氏酵母基因工程菌sbt02-18中，得到解脂耶氏酵母基因工程菌sbt02-19。

10、具体的，所述构建方法为：

11、a、将解脂耶氏酵母内源的erg13基因、启动子pub8t和终止子cyc1t先经重叠 pcr获得表达盒pub8t-erg13-cyc1t序列片段，再经ecori和hindiii双酶切连接到质粒puc19中，得到质粒puc19-pub8t-erg13-cyc1t；

12、b、将解脂耶氏酵母内源的erg19基因、启动子pgpd和终止子xpr2t先经重叠 pcr获得表达盒pgpd-erg19-xpr2t序列片段，再经ecori和hindiii双酶切连接到质粒puc19中，得到质粒puc19-pgpd-erg19-xpr2t；

13、c、将解脂耶氏酵母内源的启动子pfba、fanes1g498qlerg20融合基因和终止子pex20t先经重叠pcr获得表达盒pfba-fanes1g498qlerg20-pex20t序列片段，再经ecori和hindiii双酶切连接到质粒puc19中，得到质粒 puc19-pfba-fanes1g498qlerg20-pex20t；

14、d、以质粒pina1312为模板，扩增得到loxp-ura3d1-loxp；将解脂耶氏酵母rdna位点上下游同源臂、片段loxp-ura3d1-loxp无缝连接到质粒puc19中，得到质粒puc19-rdna-lul；

15、e、经测序验证正确后，通过pcr将表达盒pub8t-erg13-cyc1t、 pgpd-erg19-xpr2t和pfba-fanes1g498qlerg20-pex20t从对应质粒中扩增纯化后，无缝连接到质粒puc19-rdna-lul中，得到质粒 puc19-rdnalul-u13c-g19x-fn*lep，序列如seq id no.2所示；

16、f、将质粒puc19-rdnalul-u13c-g19x-fn*lep经swai酶切线性化后转化到解脂耶氏酵母基因工程菌sbt02-18中，获得解脂耶氏酵母基因工程菌sbt02-19。

17、根据本发明，所述构建方法还包括将质粒pub4-cre转化到解脂耶氏酵母基因工程菌sbt02-19中，获得解脂耶氏酵母基因工程菌sbt02-24。

18、根据本发明，所述构建方法还包括：将解脂耶氏酵母内源的cat2基因整合到解脂耶氏酵母基因工程菌sbt02-24中，得到解脂耶氏酵母基因工程菌sbt02-21。

19、具体的，所述构建方法为：

20、a、将解脂耶氏酵母来源的基因cat2片段经bamhi和pmli双酶切连接到质粒pina1312中，得到质粒pina1312-cat2，序列如seq id no.3所示；

21、b、将质粒pina1312-cat2经noti线性化后，转化到解脂耶氏酵母基因工程菌sbt02-24中，构建获得解脂耶氏酵母基因工程菌sbt02-21。

22、根据本发明，所述构建方法还包括：将含有过氧化物酶体定位标签epts1的基因erg19、hmgr和erg13整合到工程菌株sbt02-21中，得到解脂耶氏酵母基因工程菌sbt02-26，其中，过氧化物酶体定位标签epts1的序列如seq id no.4所示。

23、具体的，所述构建方法为：

24、a、将过氧化物酶体定位信号epts1(序列如seq id no.4所示)添加到mva 途径基因erg19、hmgr、erg13的3’端，将经重叠pcr扩增获得的表达盒 pgpd-erg19-epts1-xpr2t、pexp-hmgr-epts1-migt、pfba-erg13-epts1-pex20t 无缝连接到经acc65i酶切线性化的质粒jmp114中得到质粒jm618，所述的质粒 jm618、jm620序列如seq id no.5所示。

25、b、将经swai线性化后的jm618质粒转化到菌株sbt02-21中得到工程菌株 sbt02-26。

26、根据本发明，所述构建方法还包括：将含有过氧化物酶体定位标签epts1的erg8、erg12、idi和fanes1g498qlerg20整合到工程菌株sbt02-21中，得到解脂耶氏酵母基因工程菌sbt02-27，其中，过氧化物酶体定位标签epts1的序列如seq id no.4 所示。

27、具体的，所述构建方法为：

28、a、将过氧化物酶体定位信号epts1(序列如seq id no.4所示)添加到mva 途径基因idi、erg20、erg8、erg12的3’端，将经重叠pcr扩增获得的表达盒 pgpd-erg8-epts1-xpr2t、pub8t-erg12-epts1-cyc1t、pub8t-idi-epts1-cyc1t、 pexp-fanes1g498qlerg20-epts1-migt无缝连接到经acc65i酶切线性化的质粒 jm617中得到质粒jm620，所述的质粒jm620序列如seq id no.6所示。

29、b、再将经noti线性化后的质粒jm620转化到菌株sbt02-26中，得到工程菌株sbt02-27。

30、作为本发明的第二个方面，一种产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌，其采用上述所述的构建方法构建获得。

31、作为本发明的第三个方面，上述所述的产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌在生产反式橙花叔醇中的应用。所述的解脂耶氏酵母基因工程菌能够利用但不限于葡萄糖高产反式橙花叔醇。

32、本发明的产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法的有益效果：本发明过表达了基因hmgr、erg 13、erg 19和fanes1g498qlerg20，使碳通量尽可能多的流入反式橙花叔醇合成途径，减少对底物的浪费，能极大幅度地提高反式橙花叔醇的产量。本发明中将反式橙花叔醇的生物合成路径定位到过氧化物酶体中，为反式橙花叔醇的生产提供了更多的生产场所，从而能够更大幅度地提高反式橙花叔醇的产量。

33、本发明的产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌，其有益效果：

34、(1)反式橙花叔醇的产量高：本发明的产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌能使反式橙花叔醇在摇瓶水平达到930mg/l以上的产量。

35、(2)获得的菌株经过连续传代培养稳定性良好，能够用于大规模的商业化生产，所得的反式橙花叔醇能够被安全的利用，产业化应用前景良好。