一株产酯增香的威尼斯不动杆菌及其在海水鱼发酵制品中的应用的制作方法

1.本发明涉及食品微生物领域，特别是涉及一株产酯增香的威尼斯不动杆菌及其在海水鱼发酵制品中的应用。


背景技术：

2.近年来，水产品在我国居民膳食结构中的比例不断增加，其消费量以年均3％的速度增长。其中，鱼类制品因含有高价值的蛋白质和脂质，营养丰富，而成为人类重要的动物食品来源之一。
3.发酵技术是加工和保藏食品的重要工艺之一，利用发酵技术处理鱼制品可以有效提高鱼制品的利用率和附加值。由于发酵鱼独特的风味、质地和保存特性，全球对发酵鱼产品的需求持续增加。风味物质的组成是决定发酵食品风味品质的关键，其形成主要依赖于发酵微生物在食品基质中分泌的各种酶的活性以及具有活性的微生物存在的代谢途径。酯类物质如乙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯等占风味物质总质量的60％以上，由于较低的气味阈值，在适宜的浓度下，会散发出果香和花香的气味，成为发酵产品风味中最重要的香气贡献者之一。海水鱼的鱼肉富含丰富的不饱和脂肪酸等活性脂质。在发酵过程中，微生物群相互作用并产生复杂的酶系：酯酶、蛋白酶等，将营养物质分解转化为风味前体物质，同时再结合微生物生长代谢产生的有机酸和醇，在酯酶和脂肪酶等羧酸酯水解酶催化下合成小分子脂肪酸酯，增强发酵海水鱼的独特风味。
4.目前，发酵海水鱼制品多以自然发酵和手工操作为主。由于生产条件、技术水平的限制及加工者的制作经验不同，导致产品的风味品质不同，且存在发酵周期长、风味不稳定等问题，使其发展远远滞后于其它传统发酵食品。研究发现，生物发酵技术能够有效解决上述问题，极大的促进海水鱼加工产业的发展。威尼斯不动杆菌的产酯增香功能尚未被挖掘，且也未在海水鱼制品中进行应用。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一株产酯增香的威尼斯不动杆菌及其在海水鱼发酵制品中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过将威尼斯不动杆菌接种于海水鱼中进行发酵，可以促进发酵海水鱼中酯类物质的生成，达到改善海水鱼发酵制品风味的作用。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一株产酯增香的威尼斯不动杆菌(acinetobactervenetianus)，其特征在于，该菌株已于2021年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23774，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
8.本发明还提供一种发酵剂，包括所述的威尼斯不动杆菌。
9.本发明还提供一种利用所述的威尼斯不动杆菌发酵海水鱼制备鱼发酵制品的方法，包括以下步骤：
10.(1)将所述威尼斯不动杆菌活化培养后，制备成发酵剂；
11.(2)将所述发酵剂均匀喷淋在处理后的海水鱼鱼肉表面，以传统盐腌制发酵的方式在常温下发酵，得到鱼发酵制品，所述接菌发酵的接菌量为10
5-107cfu/g。
12.优选的是，步骤(1)中，制备发酵剂的方法具体为：活化后的所述威尼斯不动杆菌，在4℃，10000r/min下离心4min，重悬，配制浓度为10
5-107cfu/g的菌液，即为所述发酵剂。
13.优选的是，活化培养基包括以下组分：葡萄糖10g、蛋白胨5g、k2hpo40.5g、mgso40.5g、蒸馏水1000ml、ph值为7.2。
14.优选的是，步骤(2)中，将所述发酵剂按照接菌量为10
5-107cfu/g喷淋处理后的海水鱼鱼肉；发酵条件：避光发酵5天。
15.本发明还提供所述的威尼斯不动杆菌在海水鱼发酵制品中的应用。
16.优选的是，应用于促进所述海水鱼发酵制品中风味物质的生成。
17.优选的是，所述风味物质包括酯类物质。
18.本发明公开了以下技术效果：
19.本发明利用三丁酸甘油酯培养基从传统发酵鱼中定向筛选产酯酶菌，通过快速发酵的方式，筛选到一株威尼斯不动杆菌，将该菌株接种于海水鱼中进行发酵，通过此方法获得的发酵金鲳鱼中，总酯含量较其他菌株高。与未接菌发酵的鱼相比，可产生更多的酯类物质，且含量也更多，可显著提高发酵海水鱼制品的风味品质，并且方法简单易操作，发酵时间短。因此，本技术通过将筛选的威尼斯不动杆菌具有产酯增香的效果，将其接种到海水鱼中，可以显著提高海水鱼发酵制品中酯类物质含量，实现对海水鱼发酵制品风味的提升，从而改善海水鱼发酵制品的品质。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1为本发明威尼斯不动杆菌scsmx-3及其他菌株总酯含量测定结果；
22.图2为本发明威尼斯不动杆菌scsmx-3及其他菌株酯酶酶活测定结果；
23.图3为本发明威尼斯不动杆菌scsmx-3的电镜图；
24.图4为本发明威尼斯不动杆菌scsmx-3的16srrna基因序列构建的系统发育树。
具体实施方式
25.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
26.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
27.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
28.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
29.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
30.实施例1一种产酯增香的威尼斯不动杆菌的分离与鉴定
31.1、产酯增香菌株的分离
32.(1)所用培养基主要包括：
33.富集培养基(tsb-橄榄油)(g/l):胰蛋白胨1.5g，大豆蛋白胨0.5g，氯化钠0.5g，橄榄油1g，蒸馏水1000ml，ph 7.2
±
0.2，121℃灭菌15min。
34.三丁酸甘油酯平板培养基(g/l)：胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g、氯化钠10.0g、琼脂15.0g、三丁酸甘油酯4.0g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌15min。
35.lb固体培养基：酵母粉5g、蛋白胨10g、nacl 10g、琼脂15g、蒸馏水1000ml，ph7.2～7.4，121℃灭菌30min。
36.种子培养基(g/l)：葡萄糖10g、蛋白胨5g、k2hpo
4 0.5g、mgso
4 0.5 g、蒸馏水1000ml，ph值为7.2。
37.发酵培养基：蛋白胨10g、酵母粉5g、橄榄油聚乙烯醇乳化液120ml、nacl2.5 g、(nh4)2so
4 2g、k2hpo
4 1g、mgso
4 0.5g、ph 7.0～7.5。(橄榄油乳化液的配制：称取聚乙烯醇4.0g，加水200ml，在沸水浴中加热，搅拌直到溶解，冷却后过滤定容到200ml。将橄榄油与聚乙烯醇溶液按照 1:3的体积比混合，再按照15ml/100ml的比例往混合后的溶液中加入吐温80，在组织混匀器上乳化5min，间隔5min，再乳化5min，即可得到橄榄油乳化液，橄榄油乳化液要现配现用。)
38.(2)分离方法，包括以下步骤：
39.称取传统发酵鱼肉25g到225ml无菌生理盐水中，用均质机拍打，吸取均浆液1ml置入装有100ml富集培养基的三角瓶中，30℃、180r/min 摇床培养1～2d，培养基出现浑浊，进行富集培养。之后富集培养液用无菌水梯度稀释，稀释到原来浓度的10-5
、10-6
、10-7
，取0.1ml菌液涂布于三丁酸甘油酯培养基，30℃培养24h，挑取菌落周围有明显透明圈的菌落，在三丁酸甘油酯培养基上反复划线分离，直至纯化。将纯化培养的单一菌株接种于斜面固体培养基，30℃恒温培养24h，保藏于4℃备用。
40.2、产酯增香菌株的复筛
41.(1)感官筛选
42.将纯化的单一菌株接种到pda平板上，30℃培养72h，通过感官分析筛选出使平板具有明显香味的菌株。
43.(2)理化筛选
44.将上述筛选的菌株接种在种子液中，按2％的比例接种于20ml pda 培养基中，30℃、180r/min培养72h后，利用皂化回流法测定总酯含量。测定总酯含量步骤如下：取4ml发酵液置于150ml三角瓶中，稀释10 倍加2滴酚酞指示剂，用0.1mol/l的naoh滴定至刚显微红色(不可过量)，再准确加入25ml 0.1mol/l的naoh。沸水浴中回流皂化0.5h冷却，立即用0.1mol/l的hcl滴定至红色刚好消失为止记下消耗的hcl体积。
45.总酯含量(以乙酸乙酯计.g/100ml)的计算如下:
[0046][0047]
式中:n1为naoh浓度；n2为hcl浓度；v1为滴定用hcl消耗体积； 88.12为乙酸乙酯的摩尔质量(g/mol)。
[0048]
(3)酶活测定
[0049]
根据结果将总酯含量较高的菌株，以1％的接种量接入发酵培养基中进行发酵，30℃，180r/min，发酵24h，4℃条件下，10000rpm离心4min，取上清液进行酶活测定。按照酯酶活性大小筛选高产酯酶菌株。将分离得到的菌株置于磁珠保藏管中，保藏备用。
[0050]
测定酯酶活性步骤如下：取一定量的对硝基苯磷酸二钠(pnpp)溶于异丙醇和二甲基亚砜的混合溶液中(异丙醇和二甲基亚砜体积比为3：1)，配制成2.0mmol/l的溶液。底物缓冲液为0.1mol/l tris-hcl(ph8.0)。取 380μl缓冲液和100μl酶液在试管中混合于35℃水浴孵育1-2min，之后加入20μl底物，反应5min，加500μl sds终止反应，取上清液在405 nm处测定吸光度值。最后，根据1min内催化水解底物pnpp产生1μmol 对硝基苯酚(pnp)所需的酶量为1个酶活单位(u)进行计算。
[0051]
结果分析：通过pda培养基培养72h，根据感官筛选出能产生较明显的酯香、醇香或其他香气的6株菌株：scsmx-2、scsmx-3、scsmx-5、 scsmx-7、scsmx-8、scsmx-10。采用皂化回流法对感官嗅闻生香能力较强的6株菌进行总酯的测定。
[0052]
由图1可知，培养72h后发酵液中scsmx-3的总酯含量最高达 1.96g/100ml，scsmx-5、scsmx-2和scsmx-7的总酯含量次之，为 1.829g/100ml、1.448g/100ml和1.471g/100ml。为了进一步确定六株菌的产酯能力，对四株菌的酶活力进行测定，如图2所示，scsmx-3的酶活力最高，为1.995u/ml，其次是scsmx-2，酶活力为1.652u/ml。选取这两株菌做后续实验。
[0053]
3、发酵剂的制备
[0054]
将scsmx-2和scsmx-3在种子液中活化24h，10000rpm离心4min 收集这两株菌的沉淀物，用无菌生理盐水配制成10
5-107cfu/g浓度的发酵剂。
[0055]
4、原料鱼的发酵与酯类物质分析
[0056]
将新鲜金鲳鱼、海鲈鱼及大黄鱼清洗处理，备用。将配制好的两种发酵剂的菌体浓度调整为10
5-107cfu/g，分别均匀喷淋在三种鱼肉的表面(以不接菌发酵作为对照)，再以传统盐腌发酵的方式，将鱼身均匀抹上粗盐，最后放入装满粗盐的缸中进行常温密封发酵。利用静态顶空-固相微萃取
‑ꢀ
气相色谱-质谱联用(hs-spme-gc-ms)技术对发酵鱼制品的酯类挥发性风味组分进行鉴定，测定方法如下：
[0057]
精确称取1g
±
0.01g搅碎的鱼肉，加入0.2μl内标物tmp和5ml生理盐水置于15ml顶空瓶中，迅速封闭瓶口，插入已老化好的65μm dvb-pdms的萃取头，置于温度为60℃的磁力搅拌台上，吸附40min。再插入gc/ms进样口进行解析，进样口温度为250℃，解析10min。用
no:1所示，电镜结果如图3所示，可看出该菌株的形态为杆状。
[0068]
经16s rrna基因序列鉴定，测序拼接结果如下seq id no:1所示：
[0069]
tcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgagc gggggaaggtagcttgctactggacctagcggcggacgggtgagta atgcttaggaatctgcctattagtgggggacaacattccgaaaggaa tgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagcaggggaccttcggg ccttgcgctaatagatgagcctaagtcggattagctagttggtggggt aaaggcctaccaaggcgacgatctgtagcgggtctgagaggatgatc cgccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcag cagtggggaatattggacaatggggggaaccctgatccagccatgcc gcgtgtgtgaagaaggccttatggttgtaaagcactttaagcgagga ggaggctactagtattaatactactggatagtggacgttactcgcaga ataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagaggg tgcgagcgttaatcggatttactgggcgtaaagcgtgcgtaggcggc catttaagtcaaatgtgaaatccccgagcttaacttgggaattgcatt cgatactggatggctagagtatgggagaggatggtagaattccaggt gtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccgatggcgaagg cagccatctggcctaatactgacgctgaggtacgaaagcatggggag caaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgtctac tagccgttggggcctttgaggctttagtggcgcagctaacgcgataa gtagaccgcctggggagtacggtcgcaagactaaaactcaaatgaat tgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgc aacgcgaagaaccttacctggccttgacatactagaaactttccaga gatggattggtgccttcgggaatctagatacaggtgctgcatggctgt cgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgc aacccttttccttacttgccagcatttcggatgggaactttaaggata ctgccagtgacaaactggaggaaggcggggacgacgtcaagtcatc atggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatggtcggtaca aagggttgctacctagcgataggatgctaatctcaaaaagccgatcgt agtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgct agtaatcgcggatcagaatgccgcggtgaatacgttcccgggccttg tacacaccgcccgtc
[0070]
再经系统分类鉴定，系统发育树如图4所示，鉴定为威尼斯不动杆菌(acinetobacter venetianus)。将该菌株命名为威尼斯不动杆菌scsmx-3，于2021年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23774，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号。
[0071]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。