一种植物外泌体的纯化方法与流程

1.本发明涉及外泌体分离技术领域，具体涉及一种植物外泌体的纯化方法。


背景技术：

2.外泌体是干细胞分泌微小的囊泡(30～150纳米)。它们类似细胞间的“通信兵”可以在细胞之间转移dna，rna或蛋白质，从而影响受体细胞的功能。
3.目前，外泌体应用广泛。在干细胞和再生医学领域，外泌体被用于以治疗从心脏病到呼吸系统疾病的疾病。在护肤领域，外泌体进入皮肤，可以自动释放营养物质，持续改善细胞环境，修复皮肤问题；刺激细胞迁移、增殖和胶原合成，增加皮肤厚度，修复屏障；可增强抗氧化酶的表达，从而增强肌肤的抗氧化能力；修复紫外线导致的细胞衰老，修复日晒损伤。
4.常见的外泌体分离方法有如下几种：离心法，最常用提取外泌体的方法，得到的外泌体量多，但完整性差，电镜鉴定时会发现外泌体聚集成块，不利于后续实验；密度梯度离心法，常用蔗糖密度梯度离心法，将样本和两种蔗糖溶液一起超速离心，样品中的不同组分沉降到各自等密度区，得到的外泌体纯度高，但前期准备工作繁杂，耗时且量少；过滤离心法，操作简单省时，而且不影响外泌体的生物活性，但提取的外泌体纯度不足；旋转超滤法，利用氮气产生的压力将上清过滤，但会减少由于压力过大引起的外泌体破裂，提取外泌体量少；免疫磁珠法，利用包被有外泌体相关抗原(如cd9、cd63)抗体的磁珠与外泌体结合进行分离，无需超速离心，但洗涤液会影响外泌体生物活性，得到的外泌体较难进行后续研究；色谱法，利用凝胶孔隙的孔径大小与样品分子尺寸的相对关系对溶质进行分离提取外泌体，但操作复杂，且纯度不够高。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种植物外泌体的纯化方法，以期克服现有方法中外泌体活性不足、分离提取量少、纯度不高的技术问题。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
7.本发明提供一种植物外泌体的纯化方法，包括以下步骤：
8.(1)收集植物细胞破碎液，离心收集上清液；
9.(2)向上清液中加入沉淀液，得混合液；
10.所述沉淀液包括10％～12％peg8000，10％～15％甘油；
11.(3)将混合液离心，弃上清，收集沉淀，加入pbs完全溶解沉淀，得溶解液；
12.(4)将溶解液进行凝胶过滤层析分离，即得外泌体。
13.本发明的植物外泌体的纯化方法通过将peg8000沉淀与凝胶过滤层析联合，实现大规模和高纯度外泌体的分离纯化，能够同时保证外泌体的含量、纯度、生物活性，所分离的外泌体产量高，纯度高；且，本发明的方法效率高，操作简单，易大规模生产。
14.作为本发明所述的植物外泌体的纯化方法的优选实施方式，在所述步骤(1)中，所
述离心的条件为2500rpm～3500rpm、0℃～4℃下离心25min～35min。
15.作为本发明所述的植物外泌体的纯化方法的优选实施方式，在所述步骤(2)中，所述peg8000的终浓度为10mg/ml～12mg/ml。
16.作为本发明所述的植物外泌体的纯化方法的优选实施方式，在所述步骤(2)中，所述混合液在0℃～4℃下放置6h～12h。
17.作为本发明所述的植物外泌体的纯化方法的优选实施方式，在所述步骤(3)中，所述离心的条件为10000rpm～15000rpm、0℃～4℃下离心25min～35min。
18.作为本发明所述的植物外泌体的纯化方法的优选实施方式，在所述步骤(4)中，所述凝胶过滤层析采用的层析柱为focurose 6ff。
19.作为本发明所述的植物外泌体的纯化方法的优选实施方式，所述层析柱的粒径范围为45μm～165μm，平均粒径为85μm～95μm；柱体积为2000ml～2400ml，装料高度为120cm～150cm。
20.作为本发明所述的植物外泌体的纯化方法的优选实施方式，在所述步骤(4)中，所述凝胶过滤层析分离的条件为：
21.平衡：用缓冲液平衡层析柱，流速为1ml/min～1.5ml/min，直到ph、电导率稳定；
22.上样：上样量为1％～5％cv，流速为8cm/h～10cm/h；
23.洗脱：采用pbs洗脱，流速为1ml/min～1.5ml/min，在280nm处收集洗脱峰。
24.作为本发明所述的植物外泌体的纯化方法的优选实施方式，所述缓冲液为ph6.8～ph7.2的20mm～25mm na2hpo4和0.1m～0.15m nacl。
25.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
26.本发明的植物外泌体的纯化方法通过peg8000沉淀与凝胶过滤层析联合实现大规模和高纯度外泌体的分离纯化，能够同时保证外泌体的含量、纯度、生物活性，所分离的外泌体产量高，纯度高；本发明的方法效率高，操作简单，易大规模生产。
附图说明
27.图1为实施例1～5提取的外泌体的tem检测图；
28.图2为实施例1～5提取的外泌体的dls粒径分析；
29.图3为对比例1～9提取的外泌体的tem检测图；
30.图4为对比例1～9提取的外泌体的dls粒径分析。
具体实施方式
31.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
32.实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
33.实施例1：一种植物外泌体的纯化方法
34.该方法的具体步骤如下：
35.(1)取香圆果实，按1:1000(w/w)加入破碎液(1
×
pbs)；
36.(2)收集破碎液，在3000rpm、4℃下离心30min，去除细胞碎片，收集上清液；
37.(3)向上清液中加入沉淀液(沉淀液：10％peg8000，10％甘油，余量为水)，在4℃放置10h；
38.(4)将混合液在10000rpm、4℃下离心30min，弃上清，收集沉淀，加入pbs(ph7.0)完全溶解沉淀，得溶解液；
39.(5)将溶解液凝胶过滤层析分离，得外泌体；具体为：
40.层析柱选择focurose 6ff，适用于生物大分子物质的组分分离和中度纯化，粒径范围为45～165μm，平均粒径为90μm；柱体积为2000ml，装料高度为120cm；
41.平衡：用缓冲液(20mm na2hpo4、0.15m nacl，ph7.0)平衡层析柱，流速为1ml/min，直到ph、电导率稳定；
42.上样：上样量为5％cv，流速为10cm/h，缓冲液为20mm na2hpo4、0.15mnacl，ph7.0；
43.洗脱：用1
×
pbs洗脱，流速为1ml/min，在280nm处监控并收集洗脱峰。
44.实施例2：一种植物外泌体的纯化方法
45.该方法的具体步骤如下：
46.(1)取香圆果实，按1:1000(w/w)加入破碎液(1
×
pbs)；
47.(2)收集破碎液，在3000rpm、4℃下离心30min，去除细胞碎片，收集上清液；
48.(3)向上清液中加入沉淀液(沉淀液：12％peg8000，15％甘油，余量为水)，在4℃放置10h；
49.(4)将混合液在10000rpm、4℃下离心30min，弃上清，收集沉淀，加入pbs(ph7.0)完全溶解沉淀，得溶解液；
50.(5)将溶解液凝胶过滤层析分离，得外泌体；具体为：
51.层析柱选择focurose 6ff，适用于生物大分子物质的组分分离和中度纯化，粒径范围为45～165μm，平均粒径为90μm；柱体积为2000ml，装料高度为120cm；
52.平衡：用缓冲液(20mm na2hpo4、0.15m nacl，ph7.0)平衡层析柱，流速为1ml/min，直到ph、电导率稳定；
53.上样：上样量为5％cv，流速为10cm/h，缓冲液为20mm na2hpo4、0.15mnacl，ph7.0；
54.洗脱：用1
×
pbs洗脱，流速为1ml/min，在280nm处监控并收集洗脱峰。
55.实施例3：一种植物外泌体的纯化方法
56.该方法的具体步骤如下：
57.(1)取香圆果实，按1:1000(w/w)加入破碎液(1
×
pbs)；
58.(2)收集破碎液，在3000rpm、4℃下离心30min，去除细胞碎片，收集上清液；
59.(3)向上清液中加入沉淀液(沉淀液：10％peg8000，10％甘油，余量为水)，在4℃放置10h；
60.(4)将混合液在10000rpm、4℃下离心30min，弃上清，收集沉淀，加入pbs(ph7.0)完全溶解沉淀，得溶解液；
61.(5)将溶解液凝胶过滤层析分离，得外泌体；具体为：
62.层析柱选择focurose 6ff，适用于生物大分子物质的组分分离和中度纯化，粒径范围为45～165μm，平均粒径为90μm；柱体积为2400ml，装料高度为150cm；
63.平衡：用缓冲液(20mm na2hpo4、0.15m nacl，ph7.0)平衡层析柱，流速为1ml/min，
直到ph、电导率稳定；
64.上样：上样量为5％cv，流速为10cm/h，缓冲液为20mm na2hpo4、0.15mnacl，ph7.0；
65.洗脱：用1
×
pbs洗脱，流速为1ml/min，在280nm处监控并收集洗脱峰。
66.实施例4：一种植物外泌体的纯化方法
67.该方法的具体步骤如下：
68.(1)取香圆果实，按1:1000(w/w)加入破碎液(1
×
pbs)；
69.(2)收集破碎液，在3000rpm、4℃下离心30min，去除细胞碎片，收集上清液；
70.(3)向上清液中加入沉淀液(沉淀液：10％peg8000，10％甘油，余量为水)，在4℃放置10h；
71.(4)将混合液在10000rpm、4℃下离心30min，弃上清，收集沉淀，加入pbs(ph7.0)完全溶解沉淀，得溶解液；
72.(5)将溶解液凝胶过滤层析分离，得外泌体；具体为：
73.层析柱选择focurose 6ff，适用于生物大分子物质的组分分离和中度纯化，粒径范围为45～165μm，平均粒径为90μm；柱体积为2000ml，装料高度为120cm；
74.平衡：用缓冲液(20mm na2hpo4、0.15m nacl，ph7.0)平衡层析柱，流速为1ml/min，直到ph、电导率稳定；
75.上样：上样量为1％cv，流速为10cm/h，缓冲液为20mm na2hpo4、0.15mnacl，ph7.0；
76.洗脱：用1
×
pbs洗脱，流速为1ml/min，在280nm处监控并收集洗脱峰。
77.实施例5：一种植物外泌体的纯化方法
78.该方法的具体步骤如下：
79.(1)取香圆果实，按1:1000(w/w)加入破碎液(1
×
pbs+10％甘油)；
80.(2)收集破碎液，在3000rpm、4℃下离心30min，去除细胞碎片，收集上清液；
81.(3)向上清液中加入沉淀液(沉淀液：10％peg8000，10％甘油，余量为水)，在4℃放置10h；
82.(4)将混合液在10000rpm、4℃下离心30min，弃上清，收集沉淀，加入pbs(ph7.0)完全溶解沉淀，得溶解液；
83.(5)将溶解液凝胶过滤层析分离，得外泌体；具体为：
84.层析柱选择focurose 6ff，适用于生物大分子物质的组分分离和中度纯化，粒径范围为45～165μm，平均粒径为90μm；柱体积为2000ml，装料高度为120cm；
85.平衡：用缓冲液(20mm na2hpo4、0.15m nacl，ph7.0)平衡层析柱，流速为1ml/min，直到ph、电导率稳定；
86.上样：上样量为5％cv，流速为10cm/h，缓冲液为20mm na2hpo4、0.15mnacl，ph7.0；
87.洗脱：用1
×
pbs洗脱，流速为1.5ml/min，在280nm处监控并收集洗脱峰。
88.试验例1：外泌体表征
89.一、tem表征外泌体：分别取实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5提取的外泌体，滴加到铜网上，用醋酸双氧铀负染，用去离子水洗涤铜网两次，晾干，100kv进行电镜检测成像，获取的外泌体形态和大小，实验结果如图1所示，获取的外泌体具有双层膜结构，符合外泌体的形态特征。
90.二、外泌体粒径测量：将获得的外泌体取出10μl稀释到30μl。先用标准品进行仪器
性能测试合格后进行外泌体样品上样，结果如图2所示。
91.三、总蛋白浓度定量检测：在37℃中速融外泌体，并迅速加入5
×
的ripa裂解液。混匀后在冰上裂解30min，期间混匀。配制bca法测蛋白浓度的标准样品，并取5μl样品加入到bca混合液中，混匀。37℃孵育30min，酶标仪上在od562 nm处检测吸光值。经计算，各实施例外泌体的蛋白结果见表1。
92.表1外泌体总蛋白含量检测
[0093][0094][0095]
可见，实施例1～5的方法通过peg8000沉淀与凝胶过滤层析联合可有效实现高纯度外泌体的分离纯化。
[0096]
对比例1：peg8000沉淀分离外泌体的方法
[0097]
该方法的具体步骤如下：
[0098]
(1)取香圆果实，按1:1000(w/w)加入破碎液(1
×
pbs)；
[0099]
(2)收集破碎液，在3000rpm、4℃下离心30min，去除细胞碎片，收集上清液；
[0100]
(3)向上清液中加入沉淀液(沉淀液：10％peg8000，10％甘油，余量为水)，在4℃放置10h；
[0101]
(4)将混合液在10000rpm、4℃下离心30min，弃上清，收集沉淀，加入pbs(ph7.0)完全溶解沉淀，得溶解液；
[0102]
对比例2：凝胶过滤层析分离外泌体的方法
[0103]
该方法的具体步骤如下：
[0104]
(1)取香圆果实，按1:1000(w/w)加入破碎液(1
×
pbs)；
[0105]
(2)收集破碎液，在3000rpm、4℃下离心30min，去除细胞碎片，收集上清液；
[0106]
(3)将上清液经凝胶过滤层析分离，得外泌体；具体为：
[0107]
层析柱选择focurose 6ff，适用于生物大分子物质的组分分离和中度纯化，粒径范围为45～165μm，平均粒径为90μm；柱体积为2000ml，装料高度为120cm；
[0108]
平衡：用缓冲液(20mm na2hpo4、0.15m nacl，ph7.0)平衡层析柱，流速为1ml/min，直到ph、电导率稳定；
[0109]
上样：上样量为5％cv，流速为10cm/h，缓冲液为20mm na2hpo4、0.15mnacl，ph7.0；
[0110]
洗脱：用1
×
pbs洗脱，流速为1ml/min，在280nm处监控并收集洗脱峰。
[0111]
对比例3：一种植物外泌体的纯化方法
[0112]
该方法的与实施例4的区别之处在于：
[0113]
在步骤(3)中，沉淀液为8％peg8000，10％甘油，余量为水。
[0114]
对比例4：一种植物外泌体的纯化方法
[0115]
该方法的与实施例4的区别之处在于：
[0116]
在步骤(3)中，沉淀液为18％peg8000，10％甘油，余量为水。
[0117]
对比例5：一种植物外泌体的纯化方法
[0118]
该方法的与实施例4的区别之处在于：
[0119]
在步骤(5)中，上样时的上样量为10％cv。
[0120]
对比例6：一种植物外泌体的纯化方法
[0121]
该方法的与实施例4的区别之处在于：
[0122]
在步骤(5)中，上样时的上样量为0.5％cv。
[0123]
对比例7：一种植物外泌体的纯化方法
[0124]
该方法的具体步骤如下：
[0125]
(1)取香圆果实，按1:1000(w/w)加入破碎液(1
×
pbs)；
[0126]
(2)收集破碎液，在3000rpm、4℃下离心30min，去除细胞碎片，收集上清液；
[0127]
(3)向上清液中加入沉淀液(沉淀液：10％peg8000，10％甘油，余量为水)，在4℃放置10h；
[0128]
(4)将混合液在10000rpm、4℃下离心30min，弃上清，收集沉淀，加入pbs(ph7.0)完全溶解沉淀，得溶解液；
[0129]
(5)将溶解液凝胶过滤层析分离，得外泌体；具体为：
[0130]
层析柱选择ge capto core 700；
[0131]
平衡：用缓冲液(20mm na2hpo4、0.15m nacl，ph7.0)平衡层析柱，流速为1ml/min，直到ph、电导率稳定；
[0132]
上样：上样量为5％cv，流速为10cm/h，缓冲液为20mm na2hpo4、0.15m
[0133]1×
pbs洗脱，流速为1ml/min，在280nm处监控并收集流穿。
[0134]
对比例8：一种植物外泌体的纯化方法
[0135]
该方法的具体步骤如下：
[0136]
(1)取香圆果实，按1:1000(w/w)加入破碎液(1
×
pbs)；
[0137]
(2)收集破碎液，在3000rpm、4℃下离心30min，去除细胞碎片，收集上清液；
[0138]
(3)向上清液中加入沉淀液(沉淀液：10％peg8000，10％甘油，余量为水)，在4℃放置10h；
[0139]
(4)将混合液在10000rpm、4℃下离心30min，弃上清，收集沉淀，加入pbs(ph7.0)完全溶解沉淀，得溶解液；
[0140]
(5)将溶解液凝胶过滤层析分离，得外泌体；具体为：
[0141]
层析柱选择toyopearl hw-75s，粒径30-60μm，孔径(a)＞1000。；
[0142]
平衡：用缓冲液(20mm na2hpo4、0.15m nacl，ph7.0)平衡层析柱，流速为1ml/min，直到ph、电导率稳定；
[0143]
上样：上样量为5％cv，流速为10cm/h，缓冲液为20mm na2hpo4、0.15m
[0144]1×
pbs洗脱，流速为1ml/min，在280nm处监控并收集流穿。
[0145]
对比例9：一种植物外泌体的纯化方法
[0146]
该方法的具体步骤如下：
[0147]
(1)取香圆果实，按1:1000(w/w)加入破碎液(1
×
pbs)；
[0148]
(2)收集破碎液，在3000rpm、4℃下离心30min，去除细胞碎片，收集上清液；
[0149]
(3)向上清液中加入沉淀液(沉淀液：10％peg8000，10％甘油，余量为水)，在4℃放置10h；
[0150]
(4)将混合液在10000rpm、4℃下离心30min，弃上清，收集沉淀，加入pbs(ph7.0)完全溶解沉淀，得溶解液；
[0151]
(5)将溶解液凝胶过滤层析分离，得外泌体；具体为：
[0152]
层析柱选择阴离子交换介质(q large scale)；
[0153]
平衡：用缓冲液(20mm na2hpo4、0.15m nacl，ph7.0)平衡层析柱，流速为1ml/min，直到ph、电导率稳定；
[0154]
上样：上样量为5％cv，流速为10cm/h，缓冲液为20mm na2hpo4、0.15m
[0155]1×
pbs洗脱，流速为1ml/min。
[0156]
洗脱：洗脱液为1
×
pbs+1m nacl，流速为1ml/min，在280nm处监控并收集洗脱峰。
[0157]
试验例2：外泌体表征
[0158]
一、tem表征外泌体：分别取对比例提取的外泌体，滴加到铜网上，用醋酸双氧铀负染，用去离子水洗涤铜网两次，晾干，100kv进行电镜检测成像，获取的外泌体形态和大小，实验结果如图3所示。
[0159]
二、外泌体粒径测量：将获得的外泌体取出10μl稀释到30μl。先用标准品进行仪器性能测试合格后进行外泌体样品上样，结果如图4所示。
[0160]
三、总蛋白浓度定量检测：在37℃中速融外泌体，并迅速加入5
×
的ripa裂解液。混匀后在冰上裂解30min，期间混匀。配制bca法测蛋白浓度的标准样品，并取5μl样品加入到bca混合液中，混匀。37℃孵育30min，酶标仪上在od562 nm处检测吸光值。经计算，各实施例外泌体的蛋白结果见表2。
[0161]
表2总蛋白含量分析
[0162]
实施例总蛋白浓度对比例10.780mg/ml对比例20.023mg/ml对比例30.192mg/ml对比例40.025mg/ml对比例50.182mg/ml对比例60.133mg/ml对比例70.054mg/ml对比例80.026mg/ml对比例90.011mg/ml
[0163]
可见，与实施例1相比，对比例1～9的方法分离的外泌体的粒径上纯在两个峰，表面存在两种尺寸的物质存在，其纯度均大大降低。对比例1的方法仅采用peg8000沉淀，外泌体的总蛋白含量较高，但纯度很低，且大部分粒径在500nm～1000nm，与外泌体尺寸不符合；对比例2的方法仅采用凝胶过滤层析，上样量较少，外泌体的提取量较低。对比例3和对比例4的方法中，采用的沉淀液peg8000的比例分别为8％和18％组成，所分离的外泌体的纯度较
低；对比例5和6的方法中，上样时采用的上样量分别为为0.5％cv和10％cv，所分离的外泌体的纯度较低。对比例7、8和9分别采用了不同的层析介质，tem结果显示，无法明显判断存在外泌体。
[0164]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。