增强成纤维细胞生长因子21基因治疗制品效果的方法及其应用

本发明属基因工程，涉及成纤维细胞生长因子21基因制品，具体涉及增强成纤维细胞生长因子21基因治疗制品效果的方法及其应用。

背景技术：

1、据报道，蛋白类药物在已经获批的和正在进行临床开发的数千种生物制药产品中占主导地位。其中，一些小分子的重组蛋白，如细胞因子和激素类，在临床上被用于治疗各种疾病。由于其分子量小(小于50kda)和半衰期短(通常在几分钟到几小时之间)，导致这类蛋白会通过肾脏过滤并迅速从血液循环中清除。而为了保持有效的治疗浓度，就必须大量的频繁给药[1]。然而，这种给药方法会导致药物浓度在体内不断出现高峰然后迅速降低的波动现象，其将会引起与剂量和波动有关的并发症，并且降低病人的依从性，增加治疗成本等问题。因此，延长药物的半衰期是保持药物治疗浓度的有效的方法[2]。在过去的几年里，科学家们为此做了许多的工作，包括peg融合、脂肪酸共轭[3]、白蛋白融合以及与igg的恒定区(fc)区融合[4]等。这些技术已被广泛的应用于蛋白质疗法，并且通过延长半衰期而提高了其疗效。然而，实践显示，即使延长了药物的半衰期，在慢性疾病治疗中，也需要频繁的多次给药。因此，该技术领域急需一种在商业上可行的替代方法解决上述问题。

2、有研究公开了基因治疗即将治疗性蛋白质的基因递送至靶细胞和组织，然后可以在细胞或者组织内长期的表达，是目前可解决蛋白类药物治疗中出现的问题的一种可行的治疗方法。自从首个基于aav8基因治疗产品即用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症被批准上市之后，aav8以其相对理想的安全性和低频整合的特点，已经成为临床试验中使用最广泛的基因治疗载体[5]。尽管如此，高剂量的给药和高昂的治疗成本严重制约了aav8基因治疗的发展。因此，保证体内治疗性蛋白浓度的前提下降低病毒载体的使用剂量，同时降低治疗成本已经成为急需解决的问题。虽然延长半衰期的好处已经在传统的基于蛋白质的疗法中得到证实，但药物半衰期对基因疗法疗效的影响却较少见有被探讨。

3、基于现有技术的现状，本技术的发明人拟提供增强成纤维细胞生长因子21 基因治疗制品效果的方法及其应用。

4、与本发明相关的现有技术有如下参考文献：

5、1.kontermann re:half-life extended biotherapeutics.expert opin biolther 2016, 16(7):903-915.

6、2.chen x,zaro jl,shen wc:fusion protein linkers:property,design andfunctionality. adv drug deliv rev 2013,65(10):1357-1369.

7、3.lehnen te,da silva mr,camacho a,marcadenti a,lehnen am:a review oneffects of conjugated linoleic fatty acid(cla)upon body composition andenergetic metabolism.j int soc sports nutr 2015,12:36.

8、4.levin d,golding b,strome se,sauna ze:fc fusion as a platformtechnology:potential for modulating immunogenicity.trends biotechnol 2015,33(1):27-34.

9、5.wang d,tai pwl,gao g:adeno-associated virus vector as a platformfor gene therapy delivery.nat rev drug discov 2019,18(5):358-378.。

技术实现思路

1、本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供增强成纤维细胞生长因子21 基因治疗制品效果的方法及其应用。

2、本发明的实施例中提供了通过sfc延长基因治疗中fgf21的半衰期的方法该方法有助于二型糖尿病的干预治疗措施。

3、为实现上述目的，本发明利用sfc融合fgf21后，再用aav8病毒载体表达，能够显著的提高sfc-fgf21的血清浓度。

4、在所述的实施例中，本发明提供了一种基因治疗中延长半衰期的的方法，该方法通过sfc延长fgf21半衰期，从而显著的提高aav8表达的血清浓度。

5、本发明中，优选的，延长fgf21蛋白的半衰期是通过sfc蛋白的融合实现。

6、进一步地，本发明还提供了一种治疗二型糖尿病的药物，所述药物包括有效成分fgf21。

7、优选的，所述延长fgf21的半衰期的蛋白为sfc。

8、优选的，所述药物还包括药学上可接受的载体或其他二型糖尿病治疗药物。

9、本发明中，所述的sfc-fgf21是由sfc通过连接子与fgf21连接而成，其核苷酸序列如seq id no:1，氨基酸序列如seq id no:2所示。

10、本发明中，所述的连接子序列为(ggggs)4。

11、本发明中，所述的腺相关病毒载体是aav8。

12、本发明中，所述的基因治疗载体选自aav8、sfc-fgf21。

13、本发明还提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白包含sfc和fgf21。

14、本发明还提供了一种核酸分子，其编码上述的基因治疗载体，和所述的融合蛋白。

15、本发明还提供了一种质粒，含有所述的核酸分子。

16、本发明进一步提供了一种治疗二型糖尿病(t2dm)的药物，其包括所述的基因治疗载体，所述的融合蛋白，所述的核酸分子，或所述的质粒。

17、本发明所述的药物包括有效成分的sfc-fgf21。

18、本发明中，进行了aav8递送fgf21以及sfc融合蛋白设计分别将rfp， fgf21，sfc-fgf21几个蛋白的基因构建到aav8病毒载体上，了验证延长fgf21 半衰期会延长aav8体内表达的浓度和提高治疗效果。

19、本发明中，进行了balb/c小鼠实验，体内fgf21和sfc-fgf21的血清浓度检测结果说明aav8病毒在体内的表达有明显的剂量依赖性，随着病毒的剂量的提高而增加，同时表明通过sfc延长了fgf21的半衰期后，也能够显著的提高 aav8在体内的表达浓度。

20、本发明中，进行了aav8递送fgf21以及sfc融合蛋白在db/db小鼠模型中的疗效验证，实验结果说明，通过sfc融合蛋白的形式延长fgf21的半衰期后，在db/db小鼠模型中的治疗效果要显著的好于fgf21基因治疗的效果。

21、本发明中，通过aav8递送fgf21以及sfc融合蛋白在dio小鼠模型中的疗效验证，结果表明延长了fgf21的半衰期显著的提高了sfc-fgf21基因表达的浓度，对降低dio小鼠体重和降血糖的效果好于fgf21的治疗组小鼠。

22、本发明提供了增强成纤维细胞生长因子21基因治疗制品效果的方法及其应用。本发明通过基因工程技术对fgf21进行改造，使其与单体fc(sfc)融合，然后通过aav8表达，能够显著的提高体内aav8表达sfc-fgf21的血清浓度。 aav8-sfc-fgf21的主要特征是在相同剂量的病毒情况下，在体内可以达到更高的血清浓度。本发明所述基因制品利用延长半衰期的方法，可在各种不同的治疗药物的基因干预中进行使用，有助于降低病毒的使用剂量，提高治疗效果，能解决基因制品使用中高剂量毒性和高成本的问题。

23、本发明中，所述的载体为药学上可接受的载体，其指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质。它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。

24、本发明中，“相容性”指的是组合物中各组分能和本发明的活性成分记忆它们之间相互掺和，而不明显降低或性成分的药效。